CC BY
15
УДК 636.8.045:591.046.3
О. В. Дилекова, А. Н. Квочко
ЭКСПРЕССИЯ C-KIT/SCF-R И a-SMA В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
O. V. Dilekova, A. N. Kvochko EXPRESSION OF C-KIT/SCF-R AND a-SMA IN PROGENITOR PANCREATIC OF MAMMALS IN POSTNATAL ONTOGENESIS
FEDERAL STATE BUDGETARY EDUCATIONAL INSTITUTION OF HIGHER EDUCATION «STAVROPOL STATE AGRICULTURAL UNIVERSITY»
Аннотация. Изучена динамика изменения и характеристики прогениторных клеток поджелудочной железы у млекопитающих (кошек) в постнатальном онтогенезе. Подтверждено, что они экс-прессируют с-кй+ и а-БМА+ маркеры и находятся не в стационарном состоянии, а в постоянном динамическом процессе. Выявлено наличие а-БМА+ клеток в поджелудочной железе, которые являются, вероятно, клетками пейсмекерами подвижности стенки сосудов.
Ключевые слова: млекопитающие; кошка; постнатальный онтогенез; поджелудочная железа; прогениторные клетки; эндокриноциты.
Ольга Владимировна Дилекова
Olga Vladimirovna Dilekova кандидат биологических наук Dilekova2009@yandex.ru
Введение. В настоящее время известно, что в организме имеются постоянные (резидентные) клетки, являющиеся хранителем генетической программы паттерна развития органа или его части. Одними из перспективных маркеров являются с-kit (CD117) и a-SMA.
Маркер с-kit - трансмембранный рецептор белка тирозина, который кодируется доминантной аллелью white-spotting или ген W. При фосфориляции тирозина тирозинкиназой обеспечивается связывание трансмем-ранного рецептора с-kit с лигандом SCF, что приводит к пролиферации, дифференцировке, адгезии клеток и их миграции, а также осуществляет антиапоптические события в прогениторных клетках [1-9].
Маркер a-SMA - цитоплазматический маркер сократительных пучков цитоскелета, присутствующий в стромальной костномозговой стволовой клетке, прото-миофибробласте, в которой в ходе паракринной регуляции неоваскуляризации и репаративного процесса происходит генетическая экспрессия a-SMA под действием TGF^1 и становление миофибробласта. Миофибро-бласты относится к разновидности стромальных клеток мезенхимного происхождения и модулируют нейро-
Summary. The dynamics of change and characteristics of progenitor pancreatic cells in mammals (cats) in postnatal ontogenesis was studied. It was confirmed that they express the c-kit+ and a-SMA+ markers and are not in stationary state but in constant dynamic process. The presence of a-SMA+ cells in the pancreas, which are probably the pacemaker cells of mobility of blood vessels' walls, was revealed.
Keywords: mammals; cat; postnatal ontogenesis; pancreas; progenitor cells; endocrinocytes.
Андрей Николаевич Квочко
Апс1геу 1\Нко1аеую11 КуосИко доктор биологических наук, профессор РАН kvochko@yandex.ru
трансмиссию, участвуют в модуляции иммунного ответа, играя критическую роль в репарации, участвуют в ан-гиогенезе, контроле сосудистой проницаемости [10-15].
Данные о выявлении с-Ш-позитивных клеток и a-SMA-позитивных клеток у домашних животных в настоящее время отсутствуют и одним из подходов, позволяющих установить их, является изучение экспрессии данных маркеров в клетках.
Целью данного исследования было изучение экспрессии популяции с-кК-позитивных и a-SMA-позитивных клеток и их значение для поджелудочной железы у млекопитающих (самцов кошек).
Методика. Исследование проведено в Научно-диагностическом и лечебно-ветеринарном центре Ставропольского государственного аграрного университета.
В работе была исследована поджелудочная железа домашней кошки (Felis silvestris catus) тайской и британской пород. Для исследований было отобрано 60 самцов кошек в разные периоды постнатального онтогенеза: 1-суточные; 1-, 3-, 6-месячные; 1 год и 3 года (по 10 животных в каждой возрастной группе). Отбор объектов исследования проводили после их гибели вследствие полу-
38 Научный журнал Вестник Курганской ГСХА
ченных травм, несовместимых с жизнью, а также не имеющих патологии желудочно-кишечного тракта, с соблюдением этических норм «Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях».
У каждого животного проводили отбор целой поджелудочной железы, которую фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. В области головки железы вырезали кусочки размером 1см3. Материал проводили с использованием гистологического процессора замкнутого типа Tissue-Tek VIP™ 5 Jr (Sakura, Япония), а затем заливали в гистологическую среду «Гистомикс» (БиоВитрум, Россия) на станции парафиновой заливки Tissue-Tek® TEC™ 5 (Sakura, Япония). Из полученных блоков делали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм.
Для иммуногистохимических реакций использовали моноклональные мышиные антитела к с-Ш(Сй117) (DCS, Германия 1:25-1:50) и поликлональные кроличьи антитела к a-SMA (SpringBioScience, США). Негативным контролем служили реакции с заменой первых антител раствором для разведения (SpringBioScience, США).
При проведении иммуногистохимических реакций депарафинированные и гидратированные срезы обрабатывали 3% раствором Н2О2 в течение 10 минут для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем срезы подвергали высокотемпературной обработке в 0,01 М ци-тратном буфере (рН 6,0) в течении 40 минут. Инкубация срезов с первичными антителами на ^ki^CD^) и a-SMA проводили во влажной камере при температуре 27 °С в течение 24 часов. Со вторыми козьими антителами инкубацию проводили в течении 60 минут во влажной камере при температуре 27 °С. После инкубации применяли высокочувствительную систему визуализации Reveal biotinfree polyvalent DAB (SpringBioScience, США).
Микроскопию срезов проводили на световом микроскопе Olympus BX45 со встроенным фотоаппаратом С 300 (Япония). Для микроскопии были использованы окуляры х10, объективы х4, х10, х20, х40, х100.
С каждого препарата поджелудочной железы, окрашенного позитивно на ^kit(CD117) и a-SMA, выполняли по 10 цифровых снимков (в формате jpg, размером 3136x2352 пикселей в палитре 24 бит) случайно выбранных полей зрения при увеличении х100, х200, х400 и х1000. Для оценки экспрессии с-kit и a-SMA маркеров использовали метод предложенной Л. Е. Гуревич [16].
Морфометрические исследования с-kit^ клеток проводили с использованием программы ВидеоТест-Мастер Морфология 4.0 для Windows.
Полученные цифровые данные были анализированы с применением статистического метода однофактор-ного дисперсионного анализа и критерия множественных сравнений Ньюмена-Кейсла в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows. Достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты. Экспрессия c-kit+ маркера мембранная, от односуточного возраста до одного года иммунореактив-ный материал равномерно распределен по всей клеточной мембране (1 балл), в три года мембранно-редуцированный тип экспрессии (1 балл). Экспрессия a-SMA+ маркера крупно-гранулярная цитоплазматическая (3 балла).
C-kit+клетки в поджелудочной железе кошек идентифицируются в основном в эндокринных островках. Расположены они в виде клеточных скоплений или диффуз-
но в толще островков. Они имеют округлую или овальную форму с центрально расположенным ядром.
От односуточного до трехмесячного возраста с-кИ+ клетки в островках расположены небольшими группами по 3-5 клеток или единичными элементами на периферии островков.
К шести месяцам постнатального онтогенеза происходит перемещение клеток, и они занимают центральное место в эндокринных островках.
В возрасте один и три года с-кН+ клетки занимают центральное месторасположение в островках. Однако имеются единичные эндокринные островки, в которых с-кИ+ клетки регистрируются на периферии, формируя вокруг них тяж из клеток в виде мантии.
Количество с-кИ+ клеток в островках в односуточном возрасте кошек составляет 13,79±1,02 или 27,98 % от общего количества эндокриноцитов. Затем к возрасту один месяц отмечается достоверное (р<0,05) снижение с-кИ+ клеток в 3,8 раза, что приводит к их количественному показателю 3,56±0,17 или 7,87 % в составе эндокринных островков.
Однако к трехмесячному возрасту регистрируется достоверное (р<0,05) повышение значений данного показателя на 79,96 % (до 6,3±0,47) или 7,91 % в составе островков, которое продолжает увеличиваться до шести месяцев. В этом возрасте количество с-кИ+ клеток достоверно (р<0,05) увеличивается на 42,20 % и составляет 8,96±0,44 или 13,81 % от общего количества эндокриноцитов.
К одному году постнатального онтогенеза кошек происходит достоверное (р<0,05) снижение количества с-кН+ клеток (на 38,70 %), приближается к значениям в трехмесячном возрасте и составляет 6,46±0,57 или 8,19 % в островке.
К возрасту морфофункциональной зрелости организма кошек регистрируется достоверное (р<0,05) повышение значений данного показателя на 64,08 % и в возрасте три года их регистрируется 10,6±1,35 или 19,69 % от общего количества эндокриноцитов островков.
У всех самцов исследованных возрастных групп, кроме островкового расположения, единичные с-кН+ клетки были обнаружены между панкреатическими ацинусами, в ацино-инсулярных клеточных образованиях, а также между эпителиоцитами в межацинозных и междольковых выводных протоках.
а-БМД+ клетки имеют мезенхимное происхождение и выявляются на протяжении всего исследуемого возрастного периода постнатального онтогенеза кошек. Наличие иммунореактивного материала отмечается в отросчатых клетках, которые имеют веретенообразную форму с одним или несколькими отростками.
От односуточного возраста до трех лет а-БМД+ клетки идентифицируются обязательно в стенке крупных кровеносных сосудов, а также в мышечной оболочке междольковых выводных протоков.
Кроме постоянного расположения а-БМД+ клетки с односуточного до трехмесячного возраста регистрируются повсеместно в артериолах и между панкреатическими аци-нусами, как в составе стенки микроциркуляторного русла, так и одиночно во внеклеточном матриксе.
С шести месяцев жизни до трех лет кроме выше описанных областей, а-БМД+ клетки визуализируются по всей площади среза (*100) в эндокринных островках железы. Клетки входят в состав капилляров или лежат единичными свободными элементами в рыхлой соединительной ткани островков между эндокриноцитами.
Выводы. Таким образом, в постнатальном онтогенезе у кошек в поджелудочной железе постоянно присутствует две популяции прогениторных стволовых клеток, которые детерминированы к дифференцировке в клетки определенных линий. Они являются производными ге-мопоэтических и мезенхимных стволовых клеток. Кроме того, клетки предшественники экспрессирующие c-kit+ и a-SMA+ маркеры в железе находятся не в стационарном состоянии, а в постоянном динамическом процессе, мигрируя между тканями экзокринной и эндокринной частями железы.
По нашему мнению, экспрессия с-kit/SCF-R в эндокринных островках поджелудочной железы кошек является маркером коммитированых клеток-предшественников a- и p-эндокриноцитов, так как они локализуются в основном в островках и в ацино-инсулярных клеточных образованиях, которые, как известно, дают начало a- и р-эндокриноцитам. Последние данные, полученные М. С. Калигиным (2011, 2013, 2014), J. Gong (2012), Y. Wu et al. (2010), а также Z. C. Feng et al. (2015) в исследованиях поджелудочной железы крыс, плодов человека и в первые два месяца после рождения, также пришли к выводу, что трансмембранный рецептор белка тирозинкиназы - c-kit является предшественником a- и p-эндокриноцитов. Обнаружение c-kit+ клеток в протоковом дереве железы доказывает теорию происхождения эндокриноцитов из протокового эпителия, что приводит к образованию новых островков путем отделения их от протоков и согласуется с исследованиями N. K. Yashpal et al. (2004), S. Bonner-Weir et al. (2008).
Периодичность изменения количественных показателей железы связано, по нашему мнению, со сменой пула эндокриноцитов, что является критическими фазами постнатального онтогенеза железы. Первый период наблюдается в одномесячном возрасте, что, вероятно, связано с изменением типа питания и, как следствие, перестройкой функции железы. Второй период наблюдается в один год жизни, что, по нашему мнению, связано с морфофункциональным созреванием животного.
Обнаружение экспрессии a-SMA+ в поджелудочной железе доказывает, что в ней имеется постоянная популяция интерстициальных миофибробластов. Одни из них ассоциированы с гладкими миоцитами крупных кровеносных сосудов и выводных протоков, они являются, по видимому, клетками пейсмекерами подвижности стенки сосудов и регуляции ионных каналов. Обнаружение клеток в капиллярной сети вероятно связано с физиологическим неоан-гиогенезом и репаративным процессом микроциркулятор-ного русла на протяжении жизни животного. Выявление a-SMA+ клеток в соединительной ткани железы связано, по-видимому, с реализацией генетической программы паттерна развития (пространственно-хронологического морфогенеза тканей) органа или его части, что согласуется с данными Е. Б. Владимирской (2007), Э. Ф. Баринова, О. Н. Сулае-вой (2010), D. Klein et al. (2011), C. Kordec et al. (2012).
Полученные результаты можно использовать в качестве константных при изучении морфофункциональ-ных показателей поджелудочной железы в научных целях, а также с целью постановки правильного диагноза при оценке повреждений этого органа у кошек.
Список литературы
1 C-kit - маркер стволовых клеток эндокриноцитов поджелудочной железы человека / М. С. Калигин, А. А. Гу-мерова, М. А. Титова [и др.] // Морфология. - 2011. - № 4.
- Т. 140. - С. 32-37.
2 C-kit и десмин-позитивные клетки островков поджелудочной железы при экспериментальном диабете у крыс / М. С. Калигин, А. С. Плюшкина, М. А. Титова [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013.
- № 3. - Т. 8. - С. 113-115.
3 Пролиферация клеток поджелудочной железы при экспериментальном диабете / М. С. Калигин, М. А. Титова, А. С. Плюшкина [и др.] // Гены и клетки. - 2014. - № 3.
- Т. 9. - С. 85-88.
4 Bonner-Weir S., Inada A., Yatoh S., et al. Transdifferentiation of pancreatic ductal cells to endocrine ß-cells // Biochem. Soc. Trans. - 2008. - № 3. - Vol. 36. - P. 353 - 356.
5 Charlotte E., Edling, Bengt Hallberg c-Kit - A hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase // Biochemistry & Cell Biology. - 2007. - № 11 (39). - P. 1995 - 1998.
6 Feng Z. C., Riopel M., Popell A., Wang R. A survival Kit for pancreatic beta cells: stem cell factor and c-Kit receptor tyrosine kinase // Diabetologia. - 2015. -№ 58 (4). - P. 654 - 665.
7 WU Y., Li J., Saleem S. et al. c-Kit and stem cell factor regulate PANC-1 cell differentiation into insulin-and glucagon-produc-ing cells // Lab Invest. - 2010. - № 9 (90). - P. 1373 - 1384.
8 Yashpal N. K., Li J., Wang R. Characterization of c-Kit and nestin expression during islet cell development in the prenatal and postnatal rat pancreas // Dev Dyn. - 2004. - № 229 (4).- P. 813 - 825.
9 Gong J., Wang Y., Cao Y. Migration path of stem cells involved in the repair of damaged pancreatic tissue caused by pancreatitis // Clin. Exp. Pathol. - 2014. - № 7 (5). - P. 2438
- 2445.
10 Банин В.В. Происхождение, натуральная история и идентификация мезенхимальных стволовых клеток // Морфология. - 2015. - № 3. - Т. 147. - С. 63.
11 Баринов Э. Ф., Сулаева О. Н. Гастроинтестиналь-ные миофибробласты - роль в регуляции физиологической активности и репарации желудочно-кишечного тракта // РЖГГК. - 2010. - № 3. - С. 9 - 18.
12 Владимирская Е. Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии // Онкогематология.
- 2007. - № 1. - С. 4 - 16.
13 Анализ миофибробластов крысы, полученных из структур портальных трактов печени методом экспланации / О. Миянович, М. Н. Катина, А. А. Ризванов [и др.] // Гены и клетки. - 2013. - № 3. - Т. 8. - С. 119-124.
14 Klein D., Weisshardt P., Kleff V. et al. Vascular wall-resident CD44+ multipotent stem cells give rise to pericytes and smooth muscle cells and contribute to new vessel maturation // PloS One. - 2011. - № 5 (6). -P. 1 - 14.
15 Kordec C., Sawitza I. et.al. Stellate cells from rat pancreas are stem cells and can contribute to liver regeneration // PloS One. - 2012. -№ 12. - P. 518-538.
16 Гуревич Л. Е. Иммуногистохимическое исследование фенотипа и инвазивного потенциала опухолей поджелудочной железы : дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2003.
- 218 с.
