CC BY
15© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-03
ЭКСПРЕССИОННЫЙ ПРОФИЛЬ БЕЛКОВ АСТРОЦИТОВ ПРИ КОКУЛЬТИВИРОВАНИИ С КЛЕТКАМИ ГЛИОМЫ И ВЛИЯНИЕ КОНДИЦИОНИРОВАННЫХ ГЛИОМОЙ АСТРОЦИТОВ НА СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
А.А. Чернышева1, И.В. Чехонин1, А.О. Сосновцева1, С.А. Черепанов1, 2, К.Ш. Кардашова1, О.И. Гурина1, А.С. Силантьев3, С.А. Павлова4, Г.В. Павлова4, 5 6, Т.А. Савельева7, 8, В.Б. Лощенов7, 8, В.П. Чехонин1, 2
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава Российской Федерации, Российская Федерация, 119034, Москва, Кропоткинский пер., д. 23; 2«Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Российская Федерация, 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1; 3Национальный научный центр наркологии — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России,
Российская Федерация, 119002, Москва, Малый Могильцевский пер., д. 3; 4Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Российская Федерация, 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а;
5Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Российская Федерация, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8; 6«Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. академика Н. Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Российская Федерация, 125047, Москва, 4-я Тверская-Ямская, д. 16; Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук, Российская Федерация, 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 38; 8Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ, Российская Федерация, 115409, Москва, Каширское шоссе, д. 31 E-mail: aachernysheva512@gmail.com
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чернышева Анастасия Алексеевна — младший научный сотрудник ФГБУ«НМИЦПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Тел.: +7 (920) 220-86-06. E-mail: aachernysheva512@gmail.com. ORCID: 0000-0002-9793-0129
Чехонин Иван Владимирович — научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ ПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Тел.: +7(903) 292-11-53. E-mail: chekhonin@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-6652-2472
Сосновцева Анастасия Олеговна — младший научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ ПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Кандидат биологических наук. Тел.: +7 (919) 773-37-09. E-mail: sollomia@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-1586-5264
Черепанов Сергей Александрович — научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ ПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Кандидат биологических наук. Тел: +7(916) 248-62-82. E-mail: cherep.serega@gmail.com. ORCID: 0000-0001-9003-0171
Кардашова Карина Шамильевна — ^арший научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ ПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Кандидат биологических наук. Тел.: +7 (985) 195-01-12. E-mail: kksh08@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-6113-836X
Гурина Ольга Ивановна — руководитель лаборатории нейрохимии ФГБУ «НМИЦ ПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Доктор медицинских наук, профессор РАН, член-корреспондент РАН. Тел.: +7(903) 798-82-69. E-mail: olga672@yandex.ru. ORCID: 00000001-6942-5531
Силантьев Артемий Сергеевич — младший научный сотрудник Национального научного центра наркологии — филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России. Тел.: +7(965) 403-24-55. E-mail: artsilan@gmail.com. ORCID: 0000-0001-8360-1415
Павлова Светлана Андреевна — аспирант ИВНД и НФ РАН. Тел.: +7 (916) 520-48-04. E-mail: pavlova.sweti@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-9595-9358
Павлова Галина Валериевна — Заведующий лабораторией ИВНД и НФ РАН. Доктор биологических наук, профессор РАН. Тел.: +7(964) 710-91-57. E-mail: lkorochkin@mail.ru. ORCID: 0000-0002-6885-6601
Савельева Татьяна Александровна — научный сотрудник ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук» (ИОФ РАН). Доцент НИЯУ МИФИ Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ». Кандидат физико-математических наук, доцент. Тел.: +7 (499) 503-83-08. E-mail: savelevat@gmail.com. ORCID: 0000-0001-9833-716X
Лощенов Виктор Борисович — зав. лаб. лазерной биоспектроскопии ФГБУН Федеральный исследовательский центр «Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук» (ИОФ РАН). Зав. кафедрой №87 НИЯУ МИФИ Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ». Доктор физико-математических наук, профессор. Тел.: +7(499) 135-14-89. E-mail: loschenov@mail.ru. ORCID: 0000-0002-0507-2367
Чехонин Владимир Павлович — рук. отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «НМИЦПН им. В.П. Сербского» МЗ РФ. Заведующий кафедрой медицинских нанобиотехнологий «Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Доктор медицинских наук, вице-президент РАН, академик РАН, профессор. Тел.: +7(495) 637-50-55E-mail: Chekhoninnew@yandex.ru. ORCID: 0000-0003-4386
Введение. Под воздействием клеток глиомы астроциты периопухолевого пространства могут изменять свой фенотип на протуморогенный, в частности, за счет супрессивного влияния на иммунокомпетентные клетки.
Цель исследования. Изучение изменения экспрессионного профиля кондиционированных клетками глиомы астроцитов крысы и влияния экстрактов кондиционированных астроцитов на созревание дендритных клеток.
Методы. Использовали метод непрямого кокультивирования нативных астроцитов с клетками глиомы^б (кондиционирование). Экспрессионный профиль оценивали с помощью метода ПЦР в реальном времени. Исследование фенотипа дендритных клеток, сенсибилизированных экстрактами кондиционированных астроцитов, клеток глиомы^б и нативных астроцитов осуществляли методом проточной цитометрии и методом иммуноферментного анализа. Дендритные клетки также использовались для иммунизации крыс. Изучали динамику сывороточных уровней интерферона (IFN)-y, а также продукцию цитокинов (IFNy, интерлейкина [IL]-4 и IL10) мононуклеарными клетками иммунизированных животных.
Результаты. Для кондиционированных астроцитов выявлена тенденция к повышению экспрессии мРНК гена IL6 и снижению уровня экспрессии мРНК гена B-цепи тромбоцитарного фактора роста (PDGFB). Клетки глиомы характеризовались повышенной экспрессией мРНК генов нестина и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), а также рецептора CD44. Уровень экспрессии мРНК гена хемокина CCL2 был понижен в клетках глиомы и кондиционированных астроцитах. При иммунизации крыс дендритными клетками меньший рост сывороточных концентраций IFNy и меньшая его продукция мононуклеарными клетками отмечались в группе сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов. Дендритные клетки данной группы имели меньший уровень экспозиции CD11b/c, однако продукция IL12 была выше по сравнению с другими экспериментальными группами.
Заключение. Найденные закономерности позволяют предположить, что под влиянием клеток глиомы астроциты могут приобретать особый фенотип, который отличается от такового для клеток глиомы и (в меньшей степени) нативных астро-цитов, но также имеет определенные сходства с каждым из типов клеток.
Ключевые слова: глиома C6, кондиционированные астроциты, дендритные клетки
ALTERATIONS IN mRNA EXPRESSION OF RAT ASTROCYTES CO-CULTURED WITH C6 GLIOMA CELLS AND IMPACT OF GLIOMA-CONDITIONED ASTROCYTES ON DENDRITIC CELL MATURATION
A.A. Chernysheva1, I.V. Chekhonin1, A.O. Sosnovtseva1, S'.A. Cherepanov1'2, K. Sh. Kardashova1, O.I. Gurina1, A.S. Silantyev3, S.A. Pavlova4, G.V. Pavlova4,56, T.A. Savelieva78, V.B. Loshhenov78, V.P. Chekhonin1,2
1V.P. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Ministry of Health of the Russian Federation, Kropotkinskiy pereulok, 23, Moscow, 119034, Russian Federation;
2Pirogov Russian National Research Medical University, Ostrovitianov Street, 1, Moscow, 117997, Russian Federation; 3National Scientific Research Center on Addictions — a branch of the V.P. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Ministry of Health of the Russian Federation, Malyi Mogiltsevsky pereulok, 3, Moscow, 119002, Russian Federation;
4Institute of Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of the Russian Federation, Butlerova St., 5A, Moscow, 117485, Russian Federation;
5Sechenov First Moscow State Medical University, Trubetskaya Street, 8, Moscow, 119991, Russian Federation;
6«N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 4th Tverskaya-Yamskaya Street, 16, Moscow, 125047, Russian Federation; 7Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences, Vavilov St., 38, Moscow, 119991, Russian Federation;
8National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute), Kashirskoe shosse, 31, Moscow, 115409, Russian Federation E-mail: aachernysheva512@gmail.com
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chernysheva Anastasia Alekseevna — junior researcher V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Tel.: +7(920) 220-86-06. E-mail: aachernysheva512@gmail.com. ORCID: 0000-0002-9793-0129
Chekhonin Ivan Vladimirovich — research scientist V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Tel.: +7(903) 292-11-53. E-mail: chekhonin@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-6652-2472
Sosnovtseva Anastasia Olegovna — junior researcher V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Candidate of Sciences in Biology. Tel.: +7 (919) 773-37-09. E-mail: sollomia@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-1586-5264
Cherepanov Sergey Aleksandrovich — research scientist V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Candidate of Sciences in Biology. Tel.: +7(916) 248-62-82. E-mail: cherep.serega@gmail.com. ORCID: 0000-0001-9003-0171
Kardashova Karina Shamil'evna — senior researcher V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Candidate of Sciences in Biology. Tel.: +7(985) 195-01-12. E-mail: kksh08@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-6113-836X
Gurina Olga Ivanovna — Head of the laboratory of neurochemistry V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Dr. of Medical Sciences, professor of RAS, Corresponding Member of RAS. Tel.: +7(903) 798-82-69. E-mail: olga672@yandex. ru. ORCID: 0000-0001-6942-5531
Silantyev Artemiy Sergeevich — junior researcher National Scientific Research Center on Addictions — a branch of the V.P. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Ministry of Health of the Russian Federation. Tel.: +7 (965) 403-24-55. E-mail: artsilan@gmail.com. ORCID: 0000-0001-8360-1415
Pavlova Svetlana Andreevna — graduate student IHNA&NPh RAS. Tel.: +7 (916) 520-48-04. E-mail: pavlova.sweti@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-9595-9358
Pavlova Galina Valerievna — Head of the laboratory IHNA&NPh RAS. Doctor of Biological Sciences, professor of RAS. Tel.: +7(964) 710-91-57. E-mail: lkorochkin@mail.ru. ORCID: 0000-0002-6885-6601
Savelieva Tatiana Alexandrovna — research scientist Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences. Docent National research Nuclear university mephi«Moscow Engineering Physics Institute». Cand. Sc. (Phys.-Math.), docent. Tel.: +7(499) 50383-08. E-mail: loschenov@mail.ru. ORCID: 0000-0001-9833-716X
Loshhenov Victor Borisovich — Head of the Laser Biospectroscopy Laboratory, Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences. Head of the №87 Department National research Nuclear university mephi«Moscow Engineering Physics Institute». Sc.D. (Phys.-Math.),professor. Tel.: +7(499) 135-14-89. E-mail: loschenov@mail.ru. ORCID: 0000-0002-0507-2367
Chekhonin Vladimir Pavlovich — head of the Department of Fundamental and Applied Neurobiology V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology. Head of the Department of Medical Nanobiotechnologies Pirogov Russian National Research Medical University. Doctor of Medical Science, Vice-president of RAS, Acad. of RAS, professor. Tel.: +7(495) 637-50-55E-mail: Chekhoninnew@yandex.ru. ORCID: 0000-0003-4386
Introduction. Under the influence of glioma cells, peritumoral zone astrocytes may acquire tumorigenic phenotype, particularly due to the suppression of immunocompetent cells.
The aim of the study. Investigate the changes in the gene expression profile of glioma-conditioned rat astrocytes and the impact of conditioned astrocyte cellular extracts (lysates) on dendritic cell maturation.
Methods. We compared glioma-conditioned astrocytes with C6 glioma cells or native astrocytes. Astrocyte conditioning was achieved by indirect co-culturing of native astrocytes with C6 glioma cells. The expression profile was assessed with real-time PCR. The phenotype of dendritic cells pulsed with extracts of glioma-conditioned astrocytes, C6 glioma cells and native astrocytes was studied with flow cytometry and ELISA. Dendritic cells were also used for rat immunization. We measured serum interferon-y dynamics and cytokine production (interferon-y, interleukins 4 and 10) by mononuclear cells of immunized rats.
Results. Conditioned astrocytes showed a tendency to upregulation of interleukin 6 mRNA. They also demonstrated lower expression of PDGFB chain mRNA. Glioma cells expressed higher levels of nestin, GFAP, and CD44 mRNA. CCL2 chemokine mRNA was expressed at lower amounts in glioma cells and glioma-conditioned astrocytes. Dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes yielded a lower increase of serum and mononuclear-derived interferon-y after rat immunization. These dendritic cells exposed less CD11b/c but produced more interleukin 12 in comparison.
Conclusion. The findings suggest that astrocytes may undergo phenotype transformation under the influence of glioma cells and obtain traits different from glioma cells or native astrocytes and similar to both cellular types at the same time. Key words: C6glioma, conditioned astrocytes, dendritic cells
ВВЕДЕНИЕ
Глиомы высокой степени злокачественности являются важным объектом изучения экспериментальной и клинической нейроонкологии. Прогрессирующий рост подобных глиальных опухолей связан со способностью неопластических клеток влиять на микроокружение, создавая пермиссив-ную среду [1]. Одним из типов клеток опухолевого микроокружения являются опухоль-ассоциирован-ные («реактивные») астроциты [2]. «Реактивные» астроциты in vivo имеют отличный от нормальных астроцитов фенотип, например, повышенную экспрессию генов, отвечающих за пути механизмы презентации антигенов [3]. Возможность изменения фенотипа астроцитов под влиянием клеток глиомы была показана также in vitro, таким образом, подобное кондиционирование астроцитов может рассматриваться как своеобразная модель реактивного
астроглиоза [4]. Данные астроциты, участвуя в формировании перифокальной (периглиомной) зоны и присутствуя в ней в значительных количествах, могут обеспечивать инфильтрацию глиомы в мозговую ткань [5]. К механизмам протуморогенного действия реактивных астроцитов относят влияние на иммунокомпетентные клетки, что опосредует имму-носупрессивное влияние [2]. Оценка такого воздействия особенно важна в свете поиска подходов к совершенствованию методов иммунотерапии глиом, например, дендритно-клеточной вакцинотерапии, а также исследования способов ухода опухоли из-под иммунного надзора на фоне лечения [6]. Целью настоящей работы было изучить на крысиной модели экспрессионный профиль кондиционированных глиомой астроцитов, а также влияние экстрактов кондиционированных астроцитов на иммуноген-ность дендритных клеток.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры. Были использованы клетки глиомы-С6 крысы, нативные астроциты крысы (культура астроцитов получена из головного мозга беспородных крысят 1—3 дней жизни), астроциты крысы, кокультивированные в течение 10 сут с клетками глиомы-С6 (кондиционированные астроциты). В эксперименте с сенсибилизацией дендритных клеток использовались экстракты, полученные из клеток глиомы-С6 крысы, нативных и кондиционированных астроцитов крысы. Кокультивирование осуществляли в течение 10 сут с использованием 6-луночных планшетов Corning Costar (Sigma-Aldrich, США), в которые высевали астроциты в количестве 200—300 тыс. клеток на 1 лунку. Во вставки Transwell с порами 0,4 мкм диаметром (Sigma-Aldrich, США) высевали клетки глиомы-С6 в количестве 50 тыс. клеток на 1 лунку (аналогичный метод был описан ранее Gagliano et al.) [4]. По окончании культивирования (при достижении 80—90% конфлюэнтного клеточного монослоя) выполнялась диссоциация клеток от культураль-ных планшетов с помощью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА.
Выделение РНК из клеток, подбор и определение эффективности прай-меров для ПЦР в реальном времени. Выделение РНК проводили из клеток глиомы-С6 крысы, астроцитов крысы и кондиционированных астроцитов крысы с помощью Trizol (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Всего было подготовлено 3 серии каждой из клеточных культур, из которых была выделена РНК.
Подбор праймеров выполнялся на экзон-экзон-ные стыки или на разные экзоны. Перечень использованных в работе праймеров с указанием их характеристик указан в таблице.
Краткий список генов, к которым были подобраны праймеры, приведен далее. Данные гены кодируют следующие белки:
♦ Нестин — белок промежуточных филаментов
[7].
♦ CD44 — гликопротеин, ответственный за взаимодействие клетки с микроокружением, клеточную адгезию и миграцию [3].
♦ Транскрипционный фактор STAT3 (Signal tranducer and activator of transcription 3), активация которого может быть ассоциирована с инвазией глиомы [8].
Список использованных для RT-ПЦР праймеров с указанием их нуклеотидных последовательностей.
Курсивом выделены референсные гены List of used PCR-primers with nucleotide sequences. Reference genes are highlighted in italics
Ген Направление Нуклеотидная последовательность (5'-3') Длина продукта, п.н.
Нестин Forward ggaaggtgggcagcaactgg 152
Reverse gcttcagcttggggtccaga
CD44 Forward cagcctactggagaccggga 70
Reverse acacagttgaggcaatggtgg
STAT3 Forward attgacctgccgatgtcccc 104
Reverse gtgagcgactcaaactgccc
Коннексин 43 Forward agcctccaaggagttccacca 73
Reverse tgtctgggcacctctctttcac
IL6 Forward ctctggtcttctggagttccg 178
Reverse gagagcattggaagttgggg
Глиофибриллярный кислый белок (GFAP) Forward tggtatcggtccaagtttgc 158
Reverse ctctccaaggactcgttcg
PDGF-B Forward cgagagtgtgggcagggtta 93
Reverse acagacggacgaggggaaca
CCL Forward gctgtctcagccagatgcagt 85
Reverse ctccagccgactcattggga
B2M (в-microglobulin) Forward cgtcgtgcttgccattcagaaaa 72
Reverse ggcttcccattctccggtgg
TATA-бокс TBP (TATA-box binding protein) Forward ctgaatataatcccaagcggt 81
Reverse cagaactgaagatcaacgca
♦ Коннексин-43 (Cx43) — белок щелевых контактов, ассоциированный с периглиомной зоной реактивного астроглиоза [9].
♦ IL 6 — потенциально провоспалительный цито-кин, аутокринная секреция которого глиомой может быть ассоциирована с усилением ее роста и инвазии [8].
♦ Глиальный фибриллярный кислый белок — GFAP, гиперпродукция которого ассоциирована с зоной реактивного астроглиоза [2].
♦ B-цепь тромбоцитарного фактора роста (PDGFB), ассоциированного с пролиферацией клеток глиомы, в том числе аутокринно-регу-лируемой [10].
Синтез кДНК проводили с помощью набора High cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР в реальном времени проводили с помощью ам-плификатора Step One Plus (Applied Biosystems, США) c использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+HighROX (Евроген, Россия). Проводили
градиентную ПЦР для подбора оптимальной температуры отжига праймеров (61°С). Для идентификации амплифицируемых продуктов проводили электрофо-ретическое разделение продуктов ПЦР в 2% агарозном геле. Сравнивали длины ПЦР-продуктов. Также для определения специфичности продуктов ПЦР для каждой пары праймеров анализировали кривые плавления и вычисляли температуру плавления. Теоретическую температуру плавления ампликонов рассчитывали заранее с помощью Oligonucleotide Calculator (http:// biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) и затем сравнивали с полученными значениями. Для каждой пары праймеров определяли эффективность реакции при помощи стандартной кривой. Использованные в работе праймеры имели эффективность >78%.
Определение содержания относительного количества мРНК в экспериментальных образцах методом ПЦР в реальном времени. ПЦР для определения содержания мРНК генов мишеней и референсных генов B2M ((^-microglobulin) и ТВР (TATA-box binding protein) проводили в следующем температурном режиме: денатурация — 95°С, 90 с, затем 40 циклов — 94°С, 15 с - 61°С, 15 с - 72°С, 20с. Все реакции проводили в трех технических повторах. Для анализа результатов использовали метод ACt.
Получение и сенсибилизация дендритных клеток из мононуклеарных клеток крысят. Дендритные клетки получали методом дифференцирования из адгезиро-вавшей фракции мононуклеарных клеток селезенки 7-10-дневных беспородных крысят в присутствии IL4 и ГМ-КСФ в концентрации 10 нг/мл. Для сенсибилизации дендритных клеток на 7-е сутки культивирования в культуральную среду добавляли экстракты из клеток глиомы-С6, нативных астроцитов или кондиционированных глиомой астроцитов (до 100 мкг/мл по общему белку в ростовой среде), полученные методом трехкратного замораживания и оттаивания с последующим центрифугированием лизата (экстракта) и отбором супернатанта [11].
Исследование иммунологического и функционального фенотипа дендритных клеток. Иммунологический фенотип дендритных клеток оценивали на 10-е сутки культивирования методом проточной цитометрии на клеточном сортере MoFlo XDP (Beckman Coulter, США). Для маркирования клеток использовались следующие препараты моноклональных антител класса IgG (по 10 мкл на образец), меченных флуо-рохромами, к маркерам зрелых дендритных клеток: CD86 (FITC) - 6 повторов, CD83 (APC) - 5 повторов, CD11b/c (PE) - 4 повтора.
Для функционального исследования мононукле-арную фракцию, полученную из селезенки крысят, равномерно (приблизительно по 1,45 х105 клеток на лунку) вносили в ячейки 48-луночного планшета Corning Costar (Sigma-Aldrich, США) и культивировали по стандартной методике, на 7-е сутки с момента выделения производили сенсибилизацию вышеописанными клеточными экстрактами (3 группы). Перед сенсибилизацией были отобраны образцы
супернатанта культуральной среды. Второй забор супернатанта культуральной среды в каждой из групп осуществляли на десятые сутки культивирования. Концентрации IL12 в культуральной среде оценивали методом обратного (антительного) твердофазного ИФА с использованием стандартной тест-системы (R&D Systems, США) для определения IL12 p70 по протоколу фирмы-производителя.
Иммунизация крыс дендритными клетками. Получено 3 группы дендритных клеток по 5 образцов в каждой; в каждой группе для сенсибилизации использовался один тип экстракта — из клеток глиомы, астроцитов, кокультивированных с клетками глиомы астроцитов. На десятые сутки культивирования дендритные клетки вводились крысам подкожно в дозе 5*104 на 1 особь. Проводили трехкратную иммунизацию крыс — на 1-е, 8-е, 15-е сутки (3 группы по 5 животных, соответственно). Перед первой иммунизацией, перед 2-й иммунизацией, а также на 29-е сутки с момента 1-й иммунизации были получены образцы сывороток крыс. На 29-е сутки крысы были умерщвлены летальной дозой ингаляционного анестетика, де-капитированы. Получены селезенки крыс, из которых по вышеописанной методике была выделена моно-нуклеарная фракция. В качестве контрольной группы были получены селезенки здоровых крыс. Продукцию цитокинов мононуклеарными клетками при культивировании оценивали с помощью иммунофермент-ного спот-анализа (ELISPOT) и иммуноферментного анализа супернатантов культуральной среды.
Иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) для определения секреции IFNy мононуклеарными клетками. Для постановки реакции ELISPOT использовался набор Rat interferon gamma ELISPOT kit (Abcam, США). Мононуклеарные клетки, полученные на предыдущем этапе, распределялись в лунки планшета с иммобилизованными антиинтерферон (IFN)-y-антителами — от одной крысы — в 2 лунки (дуплеты — по 2,5 х 105 клеток на 100 мкл в лунке, за исключением серий титровки количества мононуклеаров) 96-луноч-ного планшета. Мононуклеарные клетки инкубировались с клеточными экстрактами (соответственно экспериментальной группе в концентрациях 100 мкг/мл) или отрицательным контролем (PBS) в течение 15 ч. Дальнейшие манипуляции осуществляли по протоколу фирмы-производителя. Подсчет спотов (пятен) производили вручную под бинокулярной лупой.
Определение концентраций цитокинов в культу-ральных средах и сыворотках. Мононуклеарные клетки, полученные на предыдущем этапе, распределялись в лунки 96-луночного планшета. Распределение клеток по лункам и условия культивирования были аналогичны предыдущему пункту. По окончании культивирования из лунок отбирали культуральную среду, которую центрифугировали при 1500 об/мин, супернатанты отбирали. В дальнейшем в данных су-пернатантах определяли концентрации IL4, IL10, IFNy методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем (Abcam, США) по прото-
колу фирмы-производителя. Также методом имму-ноферментного анализа исследовали концентрации IFNy в сыворотках крыс, иммунизированных дендритными клетками.
Статистический анализ. Статистические расчеты выполнялись с использованием программных пакетов Statistica, IBM SPSS, Microsoft Office.
Для сравнения двух групп между собой использовали критерий Манна-Уитни. Для поиска различий между группами в тех случаях, когда их число было больше двух, использовали критерий Крускала-Уол-лиса или критерий медиан; при наличии значимых различий использовался post hoc-анализ — метод множественных сравнений с поправкой Бонферрони (IBM SPSS) или непараметрический вариант критерия Ньюмена—Кейлса. Для сравнения значений показателя в динамике использовался критерий Фридмана. Корреляционные зависимости оценивались с помощью критерия Спирмена. Результаты признавались статистически значимыми при значении p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение транскриптов методом ПЦР в реальном времени
Различие между группами сравнения уровней экспрессии мРНК было показано для генов, кодирующих следующие белки из вышеперечисленных (критерий Крускала—Уоллиса):
• Нестин (H=21,4, p<0,0l)
• CD44 (H=15, p<0,01)
• IL6 (H=22,2, p<0,01)
• GFAP (H=15,41, p<0,01)
• PDGFB (H=16,2, p<0,01)
• CCL2 (H=16,1, p<0,01)
Для STAT3 (Н=4,84, р=0,89) и Сх43 (Н=1,65, р=0,44) различий между тремя группами не получено.
При проведении множественных сравнений уровней экспрессии мРНК были выявлены различия для генов следующих белков:
♦ нестин — наибольший в клетках глиомы-С6 при сравнении с нативными астроцитами или кондиционированными астроцитами. Статистически значимых различий по уровням экспрессии мРНК гена нестина между нативными и кондиционированными астроцитами не выявлено (рис. 1).
♦ СБ44 — больший в клетках глиомы-С6 при сравнении с кондиционированными астроци-тами, различий между клетками глиомы-С6 и нативными астроцитами и между двумя группами астроцитов не выявлено (рис. 2).
♦ ^6 — наименьший показан в группе клеток глиомы-С6 при сравнении с группами кондиционированных и нативных астроцитов. В группе кондиционированных астроцитов показана выраженная тенденция (р=0,67 при применении поправки Бонферрони на множественные сравнения, р=0,22 без поправки) к большим значениям экспрессии мРНК гена при сравнении с группой нативных астроцитов (рис. 3).
♦ GFAP— больший в клеткахглиомы-С6 при сравнении с кондиционированными астроцита-ми и нативными астроцитами. Статистически значимых различий между уровнями экспрессии мРНК данного гена в группах нативных и кондиционированных астроцитов не получено (рис. 4).
Œ
<и сс с
£ >Б Й
Œ >£
3 fS о с Œ f-с
щ
к й Œ <и
¡X Р-
s s
о о
<и &
К
о «
m
ü Median
2 3
Группы сравнения CJ 25-75% X Min-Max
1
>£
н е в
С £
« ^
0,045 0,040 0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000
Median
2 3
Группы сравнения О 25-75% X Min-Max
1
Рис. 1. Уровни экспрессии мРНК гена белка нестина в клетках глиомы-С6 (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3) Fig. 1. The nestin gene mRNA expression levels in C6 glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
Рис. 2. Уровни экспрессии мРНК гена CD44 в клетках глиомы-Ce (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3)
Fig. 2. The CD44 gene mRNA expression levels in C6 glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
♦ PDGFB — наименьший показан в группе кондиционированных астроцитов (меньший, чем в группе клеток глиомы-С6 и нативных астроцитов), уровни экспрессии мРНК данного гена между группой клеток глиомы-С6 и нативными астроцитами не различались (рис. 5).
♦ CCL2 — наибольший показан в группе натив-ных астроцитов при сравнении с клетками глиомы-С6 и кондиционированными астро-
цитами. Различий в уровнях экспрессии между клетками глиомы и кондиционированными астроцитами не выявлено (рис. 6).
Для уровней STAT3 была получена тенденция к различиям (статистически незначимым) между клетками глиомы-С6 и кондиционированными астро-цитами с несколько большими значениями в группе кондиционированных астроцитов. Для Cx43 убедительных различий между группами не получено.
ü Median
2 3
Группы сравнения CJ 25-75% X Min-Max
1
Рис. 3. Уровни экспрессии мРНК гена IL6 в клетках глиомы-С6 (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3)
Fig. 3. The IL6 gene mRNA expression levels in C6 glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
Рис. 5. Уровни экспрессии мРНК гена PDGFB в клетках глиомы-С6 (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3)
Fig. 5. The PDGFB gene mRNA expression level in C6glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
Л ЬС
Я S о ^ ва
о IE
£ £ « ^
te
p-
£
и и с с
е р
п
Median
2 3
Группы сравнения CJ 25-75% X Min-Max
1
еа н е
>£
н е в
С £
« ^
te p-
£
и и с с
е р
п
S
m
50 45 40 35 30 25 20 15 10
Median
2 3
Группы сравнения О 25-75% X Min-Max
5
0
1
Рис. 4. Уровни экспрессии мРНК гена GFAP в клетках глиомы-С6 (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3)
Fig. 4. The GFAP gene mRNA expression levels in C6 glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
Рис. 6. Уровни экспрессии мРНК гена CCL2 в клетках глиомы-С6 (1), нативных астроцитах (2) и кондиционированных астроцитах (3)
Fig. 6. The CCL2 gene mRNA expression level in C6 glioma cells (1), native astrocytes (2), and conditioned astrocytes (3)
Фенотип сенсибилизированных дендритных клеток.
При сравнении каждой из экспериментальных групп дендритных клеток с другими по уровню экспозиции соответствующего маркера, различий между ними по уровню экспозиции CD86, CD83 не выявлено (p>0,05 для критерия Крускала—Уоллиса), однако была выявлена большая экспозиция CD11b/c на дендритных клетках, сенсибилизированных экстрактами клеток глиомы, при сравнении с дендритными клетками, сенсибилизированных экстрактами кондиционированных астроцитов (значение post hoc-критерия множественных сравнений 2,75 при p=0,18 с поправкой Бонферрони, рис. 7). Последняя группа также имела тенденцию к более низкому уровню экспозиции CD11b/c при сравнении с дендритными клетками, сенсибилизированных экстрактами натив-ных астроцитов (значимые различия были получены при использовании более мягкого непараметрического варианта критерия Ньюмена—Кейлса, q=4,1 при p<0,05).
При изучении уровня секреции IL12 дендритными клетками до сенсибилизации соответствующими экстрактами (контроль) и через 3 сут после нее
(рис. 8), выявлено, что экспериментальные группы отличались от контрольной (при применении критерия Данна для каждого сравнения p<0,01, для группы сенсибилизации экстрактами нативных астроцитов показана тенденция без четкой статистической значимости). Выявлено значимое различие экспериментальных групп между собой (критерий Крускала—Уоллиса H=51,9, p<0,01). Более того, при использовании множественных post hoc сравнений с поправкой Бонферрони выявлено значимое различие групп между собой (p<0,01) с наибольшими значениями концентраций IL12 в группе сенсибилизации дендритных клеток экстрактами кондиционированных астроцитов.
Продукция цитокинов в ответ на введение дендритных клеток.
Для оценки эффективности иммунизации экспериментальных животных проведено сравнение уровней IFNy в образцах сывороток крыс в динамике для каждой из экспериментальных групп. Для каждой из экспериментальных групп было показано нарастание уровня IFNy в динамике (рис. 9—11) — от первого измерения к третьему (значение p для критерия Фридмана <0,00674 для каждого из трех сравнений).
С
и
и и я и
^ с
п
S
m
100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 80
ü Median
2 3
Группы сравнения DJ 25-75% X Min-Max
1
Рис. 7. Иммунологический фенотип дендритных клеток по уровню экспозиции маркера CD1R. Группы сравнения: 1 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами клеток глиомы (n=4); группа 2 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами нативных астроцитов (n=4), группа 3 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами кондиционированных астроцитов (n=4) Fig. 7. The CD11c exposure level on dendritic cells. Comparison groups: 1 — dendritic cells, pulsed with C6 glioma cellular extracts (n=4); 2 — dendritic cells, pulsed with extracts of native astrocytes (n=4); 3 — dendritic cells, pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=4)
Рис. 8. Уровни IL12 в супернатантах культуральных сред дендритных клеток. 1 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами клеток глиомы-Сб (n=19); 2 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами нативных астроцитов (n=20); 3 — дендритные клетки, сенсибилизированные экстрактами кондиционированных астроцитов (n=20); 4 — дендритные клетки до сенсибилизации (контроль) Fig. 8. The IL12 level in dendritic cells culture supernatants. 1 — dendritic cells, pulsed with Сбglioma cellular extracts (n=19); 2 — dendritic cells, pulsed with extracts of native astrocytes (n=20); 3 — dendritic cells, pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=20); 4 — dendritic cells before pulsing (control)
Рис. 9. Динамика уровня IFNy в сыворотке крыс (n=5) при иммунизации их дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы-Ce. Группы сравнения: 1 — перед первой иммунизацией (1-е сутки), 2 — перед второй иммунизацией (8-е сутки), 3 — 29-е сутки
Fig. 9. The dynamic of IFNy level in serum of rats (n=5) immunized with dendritic cells pulsed with C6 glioma cellular extracts. Comparison groups: 1 — before 1st immunization (day 1), 2 — before 2nd immunization (day 8), 3 — day 29
При сравнении базальных значений IFNy (первый забор крови) значимых различий между группами получено не было (критерий Крускала—Уоллиса H=0,87; p=0,65). При сравнении значений IFNy через неделю после иммунизации крыс дендритными клетками отмечалось статистически значимое различие между группами (критерий Крускала-Уолли-са H=10,43; p=0,0054) — в группе сенсибилизации экстрактами клеток глиомы уровни IFNy были больше при сравнении с между группой сенсибилизации анитгенами кондиционированных астроцитов (p<0,01) для критерия множественных сравнений с поправкой Бонферрони). Аналогичные взаимоотношения между группами сохранялись и на заключительном этапе наблюдения экспериментальных животных — различия выявлены между группой сенсибилизации экстрактами клеток глиомы (больший уровень IFNy) и группой сенсибилизации экстрактами астроцитов, а также группой сенсибилизации экстрактами клеток глиомы (больший уровень IFNy) и группой сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов (критерий Крускала—Уоллиса H=9,7; p=0,008; p<0,01 при множественном сравнении с поправкой Бонферрони).
При сравнении концентраций цитокинов (IFNy, IL10, IL4) и числа спотов в IFNy-ELISPOT-анализе, продуцируемых мононуклеарными клетками в экспериментальных группах (иммунизация дендритными клетками), с соответствующими контрольными
Рис. 10. Динамика уровня IFNy в сыворотке крыс (n=5) при иммунизации их дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами нативных астроцитов. Группы сравнения: 1 — перед первой иммунизацией (1-е сутки), 2 — перед второй иммунизацией (8-е сутки), 3 — 29-е сутки
Fig. 10. The dynamic of IFNy level in serum of rats (n=5) immunized with dendritic cells pulsed with extracts of native astrocytes. Comparison groups: 1 — before 1st immunization (day 1), 2 — before 2nd immunization (day 8), 3 — day 29
Рис. 11. Динамика уровня IFNy в сыворотке крыс (n=5) при иммунизации их дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных астроцитов. Группы сравнения: 1 — перед первой иммунизацией (1-е сутки), 2 — перед второй иммунизацией (8-е сутки), 3 — 29-е сутки
Fig. 11. The dynamic of IFNy level in serum of rats (n=5) immunized with dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes. Comparison groups: 1 — before 1st immunization (day 1), 2 — before 2nd immunization (day 8), 3 — day 29
группами (неиммунизированные животные) при использовании непараметрического критерия Манна—Уитни получены значимые различия каждой из экспериментальных групп с соответствующими контрольными (p<0,01).
В ELSPOT-анализе при сравнении экспериментальных групп между собой были выявлены значимые различия (критерий Крускала—Уоллиса H=9,42; p=0,009) между группами (рис. 12), притом число спотов в группе сенсибилизации экстрактами клеток глиомы и группе сенсибилизации экстрактами на-тивных астроцитов не отличалось, но было выше, чем в группе сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов (p<0,05 при множественном post hoc-сравнении с поправкой Бонферрони).
По уровню продукции IFNy в ИФА также были выявлены значимые различия между группами (критерий Крускала—Уоллиса H=12,3; p=0,002) между группами (рис. 13). Post hoc-критерий множественных сравнений с поправкой Бонферрони выявил больший уровень IFNy в группе сенсибилизации экстрактами клеток глиомы по сравнению с группой сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов (p<0,01) без иных значимых различий.
Вместе с тем, непараметрический вариант критерия Ньюмена—Кейлса позволил определить статистическую значимость различий между всеми экспериментальными группами (p<0,05). Уровни IFNy в группе сенсибилизации экстрактами клеток глиомы были наивысшими, в группе сенсибилизации экстрактами нативных астроцитов имели промежуточные значения, в группе сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов значения концентраций IFNy были наименьшими. Между уровнями IFNy и числом спотов в ELISPOT-анализе выявлена корреляция (R=0,695, p<0,01 по Спирмену).
При сравнении групп по уровню продукции IL10 выявлены различия пограничной значимости (критерий медиан Chi—Square=6,96, p=0,03; Критерий Крускала—Уоллиса H=5,45; p=0,066) между группами (рис. 14). Множественные сравнения с применением непараметрического варианта критерия Ньюме-на—Кейлса показали тенденцию к большим значениям концентраций IL10 в группе сенсибилизации экстрактами кондиционированных астроцитов по сравнению с группой сенсибилизации экстрактами глиомы (q=3,2 при критическом значении критерия q=3,314).
в
с f-
С
п с
С
ч
с и
¡г
240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20
Median
2 3
Группы сравнения CJ 25-75% X Min-Max
1
Рис. 12. Продукция IFNy мононуклеарными клетками иммунизированных крыс по данным ELISPOT-анализа.
1 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы (n=5); 2 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами нативных астроцитов (n=5), 3 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных астроцитов (n=5)
Fig. 12. The IFNy production by mononuclear cells of immunized rats, data of ELISPOT analysis. 1 — rats immunized with dendritic cells pulsed with C6 glioma cellular extracts (n=5);
2 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of native astrocytes (n=5); 3 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=5)
Рис. 13. Продукция IFNy мононуклеарными клетками иммунизированных крыс по данным ИФА: 1 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы (n=5); 2 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами нативных астроцитов (n=5), 3 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных астроцитов (n=5) Fig. 13. The IFNy production by mononuclear cells of immunized rats, data of ELISA. 1 — rats immunized with dendritic cells pulsed with C6 glioma cellular extracts (n=5); 2 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of native astrocytes (n=5); 3 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=5)
При сравнении экспериментальных групп по уровню продукции IL4 мононуклеарными клетками значимых различий не выявлено (критерий Круска-ла-Уоллиса H=3,77; p=0,15) (рис. 15).
Исследование продемонстрировало присутствие ряда важных отличий в экспрессионном фенотипе кондиционированных астроцитов. Были показаны значимое повышение экспрессии мРНК гена IL6 при сравнении с клетками глиомы-C6 и тенденция к повышению экспрессии при сравнении с нативны-ми астроцитами. Данный цитокин ассоциируется с инвазией глиом, а его сигнальный путь ассоциирован с транскрипционным фактором STAT3 [12]. Ранее Park et al. выявили наличие у системы IL6/STAT3 потенциально супрессивного действия в отношении дендритных клеток, что отчасти может объяснять снижение иммуногенности дендритных клеток, сенсибилизированных экстрактами кондиционированных астроцитов. Вместе с тем указанное отличие кондиционированных астроцитов не является односторонним. В исследовании наблюдался значимо более низкий уровень экспрессии мРНК гена цепи PDGFB в группе кондиционированных астроцитов при сравнении с нативными астроцитами или клет-
ками глиомы. Следует предположить наличие ограничений нашей модели, которая не предусматривала намеренное создание условий тканевой гипоксии (повышение уровня экспрессии PDGFB в глиальных клетках может быть ответом на ишемию [13]). Наряду с этим в работе Mauro et al. уровень мРНК гена PDGFB был выше в ядре глиальных опухолей при сравнении с перифокальной зоной опухоли. Авторы работы также предположили роль эндотелия в продукции данного фактора, таким образом, подчеркнув важность механизмов, которые можно изучить только в более сложных моделях, в том числе in vivo [14]. Как и предполагалось, в нашем исследовании в клетках глиомы определялся наивысший уровень экспрессии мРНК генов белков нестина и CD44. В настоящем исследовании уровень экспрессии мРНК гена GFAP был наивысшим в клетках глиомы при отсутствии различий между нативными и кондиционированными астроцитами. Различий между уровнями экспрессии мРНК гена коннексина-43 не продемонстрировано. Вместе с тем, данный факт может не противоречить традиционным представлениям о GFAP и коннексине-43 как о гиперпродуцируемых маркерах периглиомной зоны [15], поскольку по
ья и
я а
н е я н
с
136 134 132 130 128 126 124 122 120 118 116 114
ü Median
2 3
Группы сравнения CJ 25-75% X Min-Max
1
Рис. 14. Продукция IL10мононуклеарными клетками иммунизированных крыс по данным ИФА. 1 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы (n=5); 2 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами нативных астроцитов (n=5), 3 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных астроцитов (n=5) Fig. 14. The IL10production by mononuclear cells of immunized rats, data of ELISA. 1 — rats immunized with dendritic cells pulsed with C6 glioma cellular extracts (n=5); 2 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of native astrocytes (n=5); 3 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=5)
Рис. 15. Продукция IL4мононуклеарными клетками иммунизированных крыс по данным ИФА. 1 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы (n=5); 2 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами нативных астроцитов (n=5), 3 — группа иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных астроцитов (n=5) Fig. 15. The IL4production by mononuclear cells of immunized rats, data of ELISA. 1 — rats immunized with dendritic cells pulsed with C6 glioma cellular extracts (n=5); 2 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of native astrocytes (n=5); 3 — rats immunized with dendritic cells pulsed with extracts of conditioned astrocytes (n=5)
данным Vogel и Marcotte [1б], существенные различия в концентрациях белка могут быть объяснены их посттранскрипционной модификацией и особенностями измерения. Кроме того, Mauro et al. продемонстрировали случаи большей экспрессии мРНК гена GFAP в глиальных опухолях при сравнении с перитуморальной зоной [14]. Следует учитывать, что имеющиеся в литературе данные об обратной корреляции уровня продукции GFAP и экспрессии его гена со степенью анаплазии глиомы противоречивы и не являются однозначными [17]. В исследовании Wang et al. сайленсинг экспрессии гена CD44 приводил к снижению уровня экспрессии GFAP в клетках глиомы-C6, в то время как клетки Œ дикого типа имели более высокий уровень экспрессии гена GFAP и по фенотипу в большей степени соответствовали опухолевым клеткам в периферических отделах глиомы in vivo, то есть в большей степени отвечали критериями зоны инвазии и миграции опухоли, хотя формально и являлись «более дифференцированными» при сравнении с клетками ядра опухоли [18]. В классической работе по кокультивированию астроцитов и клеток глиомы человека (Gagliano et al. [4]) уровни экспрессии гена GFAP не изучались (иммунофлуо-ресцентное исследование показало большую GFAP-позитивность кондиционированных астроцитов по сравнению с нативными), а уровень экспрессии гена Cx43 в кондиционированных астроцитах был снижен при повышении продукции фосфорилированной изоформы данного белка, что подтверждает предположение о неоднозначной корреляции уровней экспрессии генов и продукции белков. Кроме того, возможно стойкое снижение уровня экспрессии мРНК гена GFAP в астроцитах в связи с длительным их культивированием. На основании исследования уровней экспрессии вышеуказанных генов можно судить о большем сходстве экспрессионного фенотипа кондиционированных и нативных астроцитов, чем таковых с клетками глиомы, что объясняется наличием анаплазии в клетках глиомы-Сб и, вероятно, конститутивно иного уровня экспрессии генов, в том числе ассоциированных с пролиферацией, инвазией и миграцией клеток. Наряду с этим уровни экспрессии мРНК гена хемокина CCL2 были одинаково ниже в клетках глиомы и кондиционированных астроци-тах по сравнению с нативными. Данный факт может казаться противоречащим результатам исследований, показавших, что CCL2 продуцируется клетками глиомы, реактивными астроцитами, микроглией и опухоль-ассоциированными макрофагами для привлечения клеток макрофагального звена и последующей индукции за счет них иммунологической толерантности [19, 20]. Вероятным объяснением нашего результата может быть ограниченная возможность экстраполяции непрямой in vitro модели на все взаимодействия в пределах микроокружения глиомы и необходимость более тесных взаимодействий между клетками для реализации более реального механизма секреции хемокинов.
Принципиальным пунктом в нашей работе явилось изучение влияния клеточных экстрактов на им-мунофенотипическую и функциональную зрелость дендритных клеток. Снижение экспозиции маркера CD11b/c в группе сенсибилизации дендритных клеток экстрактами кондиционированных астроцитов косвенно свидетельствует о негативном влиянии последнего клеточного экстракта на созревание дендритных клеток [21]. Иммунизация дендритных клеток, сенсибилизированных всеми типами вышеописанных экстрактов, приводила к появлению у экспериментальных животных ответа, в виде динамического повышения сывороточного уровня IFNy. Данный уровень был выше в группе иммунизации крыс дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами клеток глиомы, что свидетельствует о большем стимулирующем значении данного пула антигенов и иных факторов, чем таковых для на-тивных или кондиционированных клетками глиомы астроцитов. При дальнейшем анализе проводимых исследований (секреция IFNy мононуклеарными клетками иммунизированных крыс, детектированная методами ELISPOT и ИФА) получено, что экстракты из кондиционированных клетками глиомы астроцитов обладали наименьшей иммуногенностью in vivo. Подтверждением последнему является также и тот факт, что мононуклеарные клетки крыс из группы иммунизации дендритными клетками, сенсибилизированными экстрактами кондиционированных клетками глиомы астроцитов, имели тенденцию к большему уровню секреции IL10 — одного из основных противовоспалительных цитокинов. Отдельного упоминания заслуживает факт, что, несмотря на относительно невысокую in vivo иммуногенность дендритных клеток, сенсибилизированных клеточными экстрактами кондиционированных астроцитов, данные дендритные клетки показали наибольший уровень продукции IL12, который является ключевым провоспалительным цитокином и посредником развития иммунного ответа в контексте презентации антигена. Данный феномен подчеркивает сложный характер связи между иммунологическим фенотипом, секреторным паттерном дендритных клеток и итоговым уровнем цитокинового ответа на их введение.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в ходе настоящего исследования данные позволяют говорить о том, что кондиционированные клетками глиомы астроциты представляют собой особое функциональное состояние астроци-тов. Экстракты из данных клеток, обладая несколько иными свойствами, чем нативные астроциты, могут влиять на зрелость дендритных клеток. Подобное влияние кокультивированных астроцитов является объяснимым в связи с тем, что in vivo аналогичные клетки являются мощными супрессорами опухоль-ассоциированного иммунного ответа, обладая вместе с тем определенным набором потенциально иммуно-генных факторов.
Финансирование: работа выполнена при поддерж- Конфликт интересов
ке грантов РФФИ 17-00-00161 КОМФИ, 17-00-00157 Авторы заявляют об отсутствии
КОМФИ, 17-00-00159 КОМФИ и 17-00-00162 КОМФИ. конфликта интересов.
The research was supported by RFBR grants 17-00- Conflict of interest
00161, 17-00-00157, 17-00-00159, 17-00-00162. The authors declare no conflict of interest.
* * *
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Broekman M.L., Maas S.L.N., Abels E.R., Mempel T.R., Krichevsky A.M., Breakefield X.O. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nat Rev Neurol. 2018; 14 (8): 482-95. https://doi. org/10.1038/s41582-018-0025-8.
2. Brandao M., Simon T., Critchley G., Giamas
G. Astrocytes, the rising stars of the glioblastoma microenvironment. Glia. 2019; 67 (5): 779-90. https://doi.org/10.1002/glia.23520.
3. Katz A.M., Amankulor N.M., Pitter K., Helmy K., Squatrito M., Holland E.C. Astrocyte-specific expression patterns associated with the PDGF-induced glioma microenvironment. PLoS One. 2012; 7 (2): e32453. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0032453.
4. Gagliano N., Costa F., Cossetti C., Pettinari L., Bassi R., Chiriva-Internati M., Cobos E., Gioia M., Pluchino S. Glioma-astrocyte interaction modifies the astrocyte pheno-type in a co-culture experimental model. Oncol Rep. 2009; 22 (6): 1349-56. https:// doi.org/10.3892/or_00000574.
5. Fazi B., Felsani A., Grassi L., Moles A., D'Andrea D., Toschi N., Sicari D., De Bonis P., Anile C., Guerrisi M.G., Luca E., Farace M.G., Maira G., Ciafre S.A., Mangiola A. The transcriptome and miRNome profiling of glioblastoma tissues and peritumoral regions highlights molecular pathways shared by tumors and surrounding areas and reveals differences between short-term and long-term survivors. Onco-target. 2015; 6 (26): 22526-52. https://doi. org/10.18632/oncotarget.4151.
6. Liau L.M., Ashkan K., Tran D.D., Campian J.L., Trusheim J.E., Cobbs C.S., Heth J.A., Salacz M., Taylor S., D'Andre S.D., Iwamoto F.M., Dropcho E.J., Moshel Y.A., Walter K.A., Pillainayagam C.P., Aiken R., Chaudhary R., Goldlust S.A., Bota D.A., Duic P., Grewal J., Elinzano H., Toms S.A., Lillehei K.O., Mikkelsen T., Walbert T., Abram S.R., Brenner A.J., Brem S., Ewend M.G., Khagi S., Portnow J., Kim L.J., Loudon W.G., Thompson R.C., Avigan D.E., Fink K.L., Geoffroy F.J., Lindhorst S., Lutzky
J., Sloan A.E., Schackert G., Krex D., Meisel
H.J., Wu J., Davis R.P., Duma C., Etame A.B., Mathieu D., Kesari S., Piccioni D., Westphal M., Baskin D.S., New P.Z., Lacroix M., May S.A., Pluard T.J., Tse V., Green R.M., Villano
J.L., Pearlman M., Petrecca K., Schulder M., Taylor L.P., Maida A.E., Prins R.M., Cloughesy T.F., Mulholland P., Bosch M.L. First results on survival from a large Phase 3 clinical trial of an autologous dendritic cell vaccine in newly diagnosed glioblastoma. J. Transl Med. 2018; 16 (1): 142. https://doi. org/10.1186/s12967-018-1507-6.
7. Fang B.J., Geng F.Y., Lu F.Q., Wang Y.H., Zhang L.Q., Meng F.G. Expression and clinical significance of nestin in astrocytic tumors. J. buon. 2016; 21 (1): 191-8.
8. McFarland B.C., Hong S.W., Rajbhandari R., Twitty G.B., Jr., Gray G.K., Yu H., Benveniste E.N., Nozell S.E. NF-KB-induced IL6 ensures STAT3 activation and tumor aggressiveness in glioblastoma. PLoS One. 2013; 8 (11): e78728. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0078728.
9. Baklaushev V.P., Yusubalieva G.M., Tsitrin E.B., Gurina O.I., Grinenko N.P., Victorov I.V., Chekhonin V.P. Visualization of Con-nexin 43-positive cells of glioma and the periglioma zone by means of intravenously injected monoclonal antibodies. Drug Deliv. 2011; 18 (5): 331-7. https://doi.org/10. 3109/10717544.2010.549527.
10. Westermark B. Platelet-derived growth factor in glioblastoma-driver or biomarker? Ups J. Med. Sci. 2014; 119 (4): 298-305. https://doi.org/10.3109/03009734.2014.970 304.
11. Chekhonin I.V., Gurina O.I., Cherepanov S.A., Abakumov M.A., Ionova K.P., Zhigarev D.I., Makarov A.V., Chekhonin V.P. Pulsed Dendritic Cells for the Therapy of Experimental Glioma. Bull Exp. Biol. Med. 2016; 161 (6): 792-6. https://doi.org/10.1007/ s10517-016-3512-1.
12. Jiang Y., Han S., Cheng W., Wang Z., Wu A. NFAT1-regulated IL6 signalling contributes to aggressive phenotypes of glioma. Cell Commun Signal. 2017; 15 (1): 54. https:// doi.org/10.1186/s12964-017-0210-1.
13. Funa K., Sasahara M. The roles of PDGF in development and during neurogenesis in the normal and diseased nervous system. J Neuroimmune Pharmacol. 2014; 9 (2): 168-81. https://doi.org/10.1007/s11481-013-9479-z.
14. Mauro A., Bulfone A., Turco E., Schiffer D. Coexpression of platelet-derived growth
factor (PDGF) B chain and PDGF B-type receptor in human gliomas. Childs Nerv Syst. 1991; 7 (8): 432-6. https://doi.org/10.1007/ BF00263184.
15. Chekhonin V.P., Baklaushev V.P., Yusubalieva G.M., Belorusova A.E., Gulyaev M.V., Tsitrin E.B., Grinenko N.F., Gurina O.I., Pirogov Y.A. Targeted delivery of liposomal nanocontainers to the peritumoral zone of glioma by means of monoclonal antibodies against GFAP and the extracellular loop of Cx43. Nanomedicine. 2012;
8 (1): 63-70. https://doi.org/10.10Wj. nano.2011.05.011.
16. Vogel C., Marcotte E.M. Insights into the regulation of protein abundance from pro-teomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 2012; 13 (4): 227-32. https://doi. org/10.1038/nrg3185.
17. Van Bodegraven E.J., van Asperen J.V., Robe P.A.J., Hol E.M. Importance of GFAP isoform-specific analyses in astrocytoma. Glia. 2019; 67 (8): 1417-33. https://doi. org/10.1002/glia.23594.
18. Wang H.H., Liao C.C., Chow N.H., Huang L.L., Chuang J.I., Wei K.C., Shin J.W. Whether CD44 is an applicable marker for glioma stem cells. Am. J. Transl. Res. 2017; 9 (11): 4785-806.
19. Chang A.L., Miska J., Wainwright D.A., Dey M., Rivetta C.V., Yu D., Kanojia D., Pituch K.C., Qiao J., Pytel P., Han Y., Wu M., Zhang L., Horbinski C.M., Ahmed A.U., Lesniak M.S. CCL2 Produced by the Glioma Microenvironment Is Essential for the Recruitment of Regulatory T Cells and Myeloid-Derived Suppressor Cells. Cancer Res. 2016; 76 (19): 5671-82. https://doi.org/10.1158/0008-5472.Can-16-0144.
20. Leung S.Y., Wong M.P., Chung L.P., Chan A.S., Yuen S.T. Monocyte chemoattractant protein-1 expression and macrophage infiltration in gliomas. Acta Neuropathol. 1997; 93 (5): 518-27. https://doi.org/10.1007/ s004010050647.
21. Zhu X.J., Yang Z.F., Chen Y., Wang J., Rosmarin A.G. PU.1 is essential for CD11c expression in CD8(+)/CD8(-) lymphoid and monocyte-derived dendritic cells during GM-CSF or FLT3L-induced differentiation. PLoS One. 2012; 7 (12): e52141. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0052141.
Для цитирования: Чернышева А.А., Чехонин И.В., Сосновцева А.О., Черепанов С.А., Кардашова К.Ш., Гурина О.И., Силантьев А.С., Павлова С.А., Павлова Г.В., Савельева Т.А., Лощенов В.Б., Чехонин В.П. Экспрессионный профиль белков астроцитов при кокультивировании с клетками глиомы и влияние кондиционированных глиомой астроцитов на созревание дендритных клеток. Молекулярная медицина. 2021; 19 (5): 16-28. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-03
Поступила 26 декабря 2020 г.
For citation: Chernysheva A.A., Chekhonin I.V., Sosnovtseva A.O., Cherepanov S.A., Kardashova K.Sh., Gurina O.I., Silantyev A.S., Pavlova S.A., Pavlova G.V., Savelieva T.A., Loshhenov V.B., Chekhonin V.P Alterations in mRNA expression of rat astrocytes CO-cultured with C6 glioma cells and impact of glioma-conditioned astrocytes on dendritic cell maturation. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (5): 16-28 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-03
