CC BY
20
УДК: 619:616.982.2 Власенко В.В. *, Власенко И.Г.**, Лысенко А.П. ***, Войцицкая О.М*. ©
* Винницкий национальный аграрныйуниеерситет ** Винницкий торгово-экономический институт КНТЭУ *** Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРИЛЬНОСТИ ТУБЕРКУЛИНУ ППД ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
В статт1 представлет резулътати видыення збудника туберкулъозу з туберкул1тв та вивчення бюх1м1чних властивостей мтобактерш на середовищ1 Влакон. Показана можливжтъ перев1рки туберкулту на стерилъшстъ.
Ключое1 слова: туберкулт, мтобактерп, бюхЬтчт властивост1, поживш середовища.
Вступ. Туберкулез является общим заболеванием для человека и животных. Он был и остается проблемой номер один среди хронических инфекций крупного рогатого скота на всех континентах мира [1,2,3,4]. Напряженность эпизоотической ситуации с туберкулезом среди крупного рогатого скота в мире намного выше, чем эпидемическая. Так, ежегодно, выявляется больных туберкулезом 8-10 млн. человек, а среди крупного рогатого скота - 6 млн. голов [5], соответственно 1,75 больных на 1 млн. населения и 5 тысяч на 1млн. животных в мире. Почти половина населения планеты инфицирована микобактериями туберкулеза. Ежегодно 1 человек, не излеченный от этого заболевания, может инфицировать 15-20 и более людей. Общее количество больных туберкулезом достигает 50-60 млн. В Украине ежегодно выявляется более 30 тыс. больных на впервые диагностированный туберкулез и его рецидивы, из них туберкулез с бактериовыделением составляет около 1/3. Это говорит о недостаточно поставленной микробиологической диагностике туберкулеза. Такие рутинные методы микробиологической диагностики туберкулеза, как трехразовая микроскопия мазка по Циль-Нильсену, посев на среду Левенштейна - Иенсена и Финна - 2 с последующей идентификацией микобактерий и определением чувствительности их к антибактериальным препаратам имеют ряд недостатков. Так, микроскопия мазка по Циль - Нильсену позволяет выявить только кислотоустойчивые микобактерии, не идентифицируя их, а выделение культуры на указанных питательных средах позволяет получить результат для клинициста от 3-4 недель до 2-3 месяцев [ 6]. Такие методики не дают клиницисту возможности получать достоверную информацию относительно лекарственной чувствительности к препаратам, а врач соответственно, не может
© Власенко В.В., Власенко И.Г., Лысенко А.П., Войцицкая О.М., 2012
37
провести своевременную рациональную коррекцию режима
антибактериальной терапии. Следует отметить и то, что микобактерии туберкулеза чрезвычайно устойчивы к действию высоких температур, способны выдерживать автоклавирование. Так, Straus et Gamaleia, еще в 1891 году сообщали, что при введении в вены кролика убитых продолжительным нагреванием при 130°С туберкулезных бацил, возникают поражения, идентичные тем, которые вызывают живые культуры, в том числе и казеозное перерождение; при введение в брюшную полость кролика, морской свинки, собаки автоклавированных бацил развивается типичный туберкулезный перитонит [7]. Немного позднее, Grancher и Ledoux - Lebard (8) в 1901 году, сообщали, что высушенные культуры возбудителя туберкулеза, которые подвергались действию сухого жара, оказались более устойчивыми, они сохраняли свои свойства после нагревания в течении 2 и 3 часов при 100°С. Возможно этим объясняется тот факт, что исследуемые препараты туберкулина ППД для млекопитающих отечественных и зарубежных производителей давали рост характерный для возбудителя туберкулеза [9]. Учитывая вышеизложенное, украинскими и белорусскими учеными была разработана и внедрена микробиологическая методика ускоренного обнаружения микобактерий туберкулеза на ранних стадиях развития заболевания с помощью питательной среды ВКГ и антисывороток к M. bovis [10,11].
Целью нашего исследования явилось выявление возбудителя туберкулеза из туберкулина и изучение биохимических свойств микобактерий, выделенных на среде Влакон.
Материалы и методы.
В работе использовали 2-3 недельные культуры микобактерий M. bovis, M. tuberculosis H37 Rv, M. avium 1603, M. fortuitum 342, M. kansasii, выращенные на среде Гольберга и среде Влакон. Полученные культуры из туберкулина ППД пересевали на среду Гольберга без малахитового зеленого дважды, после чего делали посев на среду Гольберга с малахитовым зеленым и полученную культуру использовали для биохимических исследований. Для изучения биохимических свойств микобактерий использовали следующее тесты:
- реакция восстановления нитратов;
- гидролиз твина 80;
- дегидрогеназная активность с глюкозой;
- дегидрогеназная активность с глицерином.
В качестве контроля использовали среду Гольберга. Методика биохимических реакций следующая.
Реакция восстановления нитратов. Нами было отобрано по 10 мг влажного веса культур со среды Гольберга и среды Влакон и суспензировано в 1 мл. 0,067 М фосфатного буфера (pH = 7,1), содержащего 0,1% нитрата натрия, взвеси инкубировали при 37°С 15-16 часов. Образование нитрат проверяли добавлением в каждую пробу по две капли 2%-ного (W/V) р -диметиламинобензальдегида в 1 мл 10%-ной НС. О принадлежности культуры к
38
микобактериям человеческого типа (методика Тсукамура) судили по изменению окраски.
Гидролиз теина 80 (0,067М). Для постановки реакция использовали следующие реактивы: 100 мл. М/15 фосфатный буфер pH 7; 0,5 мл. твина 80; 2 мл. основного нейтрального красного 0,1%-ного водного раствора. Все три реагента смешали и разделили полученную смесь по 4 мл в стерильные пробирки, автоклавировали 15 минут при 120°С. После чего, внесли по три платиновые петли каждой культуры в отдельную пробирку, герметизировали их и поместили в термостат. Реакцию учитывали через 4 часа на 5- и 10-е сутки. Положительным считали тест, если появилась розово - красная окраска до 10-го дня, отрицательным - если окраски нет.
Дегидрогеназная активность (проба Блоха) с глюкозой. Реакцию проводили в агглютинационных пробирках. Для чего отобрали по 1 мл. суспензии микробных клеток каждой культуры (10 мг/мл.) в фосфатном буфере pH 7,4-7,6 смешали с 1 мл 1%-ной глюкозой и 0,1 мл 0,02%-ного метиленового синего, сверху наслоили вазелиновое масло. В качестве контроля использовали пробирку с культурой, но без глюкозы.
Проба Блоха с глицерином. По две петли каждой культуры суспензировали в 0,5 мл 0,06 М фосфатного буфера (pH 7,0) с 1%-ным глицерином. К полученной смеси добавили по 0,5 мл метиленовой сини на физиологическом растворе в разведении 1:1000. На поверхность каждой жидкости наслоили вазелиновое масло.
Большинство кислотоустойчивых сапрофитов обесцвечивает метиленовую синь в первые 30 мин, возбудители туберкулеза - в течении 3-6-12 часов.
Результаты исследования.
В результате исследования установлено, что среда Влакон обладает повышенной биологической активностью по сравнению с контрольной средой. Так, в тесте редукция нитратов, культуры M. bovis на контрольной среде реакции не проявляли, тогда как на среде Влакон эти культуры давали положительную реакцию в 90% случаях. Эти же культуры в тесте гидролиз твина 80 из контрольной и опытной среды имели одинаковую активность (50%). Рассматривая культуру M. bovis, полученную на опытной среде, следует отметить, что дегидрогеназная активность с 1-% глюкозой через три часа составляла 30%, тогда как на контрольной она не проявилась. Через 12 часов в этой же реакции, активность культуры с обеих сред не имела отличия и составила 100% (табл.1,2.).
39
Таблица 1
Биохимические свойства микобактерий, полученных на среде Гольберга
№ Название биохимической реакции Среда Гольберга (контроль)
п/ п M. bovis M. tuberculo sis H37Rv M. avium 1603 M. fortuitum M. kansasii ппд Туберкулин c.19 Сухой ППД c.28
1. Редукция нитратов 10/0 10/90 6/0 10/90 5/100 5/40 5/60
2. Гидролиз - 5-е сутки 10/50 10/0 6/0 10/30 5/100 5/60 5/60
- 10-е сутки 10/50 10/0 6/0 10/30 5/100 5/60 5/80
3. Дегидрогеназна я активность с 1% глюкозой
- 3 часа 12/0 12/0 6/0 10/70 5/100 6/33,3 6/50
- 12 часов 12/100 12/91,7* 6/100 10/100 5/100 6/100 6/100
4. Дегидрогеназная активность с
глицерином - 3 часа 8/0 8/0 6/0 10/80 5/100 6/50 6/100
- 24 часа 8/100 8/87,5 6/100 10/100 5/100 6/100 6/100
Таблица 2.
Биохимические свойства микобактерий, полученных на среде Влакон
№ п/ п Название биохимическо й реакции Среда Влакон (опыт)
M. bovis M. tuberculosis H37Rv M. avium 1603 M. fortuitum M. kansasii ппд Туберкул ин c.19 Сухой ППД c.28
1. Редукция нитратов 10/90 10/90 6/83,3 10/100 5/100 5/80 5/80
2. Гидролиз - 5-е сутки 10/50 10/0 6/0 10/30 5/100 5/60 5/60
- 10-е сутки 10/50 10/0 6/0 10/30 5/100 5/60 5/60
3. Дегидрогеназная активность с 1%
глюкозой - 3 часа 12/30 12/0 6/100 10/70 5/100 6/50 6/66,7
- 12 часов 12/100 12/100* 6/100 10/100 5/100 6/100 6/100
4. Дегидрогеназная активность с 6/100
глицерином - 3 часа 8/100 8/50 6/83,3 10/80 5/100 6/100
- 24 часа 8/100 8/100 6/100 10/100 5/100 6/100 6/100
Примечание:
В числителе - количество проб, а в знаменателе количество положительных проб в процентах
* Комплекс M. bovis включает M. bovis и BCG
40
Эта же закономерность, но более выраженная, проявилась в реакции дегидрогеназной активности с глицерином, то есть в культурах с Влакон через три часа наблюдалась положительная реакция в 100% случаях, в то время как с культурами, полученными с контрольной среды, реакции не наблюдалось. Через 24 часа результаты тестов были идентичны на контрольной и опытной среде - 100%.
При исследовании культур M. tuberculosis H37Rv, полученных с контрольной и опытной среды в реакции редукции нитратов, гидролиз твина 80, дегидрогеназная активность с 1% глюкозой достоверных различий не наблюдалось, то есть результаты совпали в 100% случаях. Исключением явилась реакция дегидрогеназной активности с глицерином, где культуры со среды Влакон проявили активность в 50% случаев, а в культурах с контрольной среды активности не наблюдалось. Учет этой реакции через 24 часа показал, что культуры с опытной среды проявляют активность в 100% случаев, в то время как с контрольной среды - 87,5%, то есть на 12,5% ниже.
При изучении редукции нитратов M avium 1603, полученных на среде Влакон, в 83,3% случаев были положительные результаты, тогда как с контрольной средой редукция нитратов не наблюдалась. То есть клетки микобактерий, полученные со среды Влакон, имели большую ферментативную активность. Биохимический тест гидролиз твина 80, различий между культурами, полученными с контрольной и опытной среды, не выявил. Анализируя дегидрогеназную активность с 1% глюкозой, следует заметить, что культуры полученные со среды Влакон через 3 часа имели положительную реакцию в 100% случаях, тогда как на контрольной среде этот результат был получен только через 24 часа. Аналогичная закономерность наблюдалась в реакции дегидрогеназной активности с глицерином. То есть культуры с опытной среды (Влакон) через 3 часа имели выраженную активность в 83,3% случаев а через 24 часа - в 100%, тогда как на контрольной среде активность проявилась только через 24 часа.
Анализируя тест редукции нитратов микобактериями M. fortuitum следует отметить, что культуры со среды Влакон всего в 10% случаев давали больше положительных результатов, чем с контрольной среды. Результаты исследований культуры M. fortuitum по тестам гидролиз твина 80, дегидрогеназная активность с 1% глюкозой и с глицерином разницы в биохимической активности между культурами с контрольной и опытной сред не выявили.
Следует заметить, что M. kansasii полученные с опытных и контрольных сред за испытуемыми биохимическими тестами показали 100% совпадение результатов.
Культуры полученные с туберкулинов (ППД для млекопитающих), обладали от 30 до 60% выше ферментативной активностью как с контрольной так и с опытной сред по сравнению с M. bovis полученной с опытной среды.
На основании полученных результатов мы считаем, что питательная среда Влакон обладает способностью повышать ферментативную активность
41
микобактериальных клеток. По видимому, эта способность дает возможность на среде Влакон получать рост микобактериальных клеток, тогда когда на общепринятых средах он отсутствует. Повышенная активность работы ферментов и натрий ^ калиевых насосов на питательной среде Влакон обусловлена стимулятором роста, который входит в состав среды. По-видимому, можно согласится, что на определенном этапе развития микобактерии туберкулеза имеют сходные с сапрофитами биохимические свойства о чем свидетельствуют такие тесты, как гидролиз твина 80, дегидрогеназная активность с 1% глюкозой и глицерином. Следует иметь в виду и то, что препараты для аллергической диагностики содержат живые морфологические формы, обладающие биохимическими свойствами микобактерий.
Выводы:
1. Питательная среда Влакон обладает способностью стимулировать биохимические процессы в клетках микобактерий, что дает возможность получить рост микобактерий с пониженной ферментативной активностью (жизнедеятельностью).
2. Проведенные биохимические тесты с культурами, полученными из туберкулинов, доказывают наличие живых морфологических форм, относящихся к роду микобактерий
3. Учитывая высокую чувствительность среды Влакон, она может быть рекомендована как питательная среда для контроля качества туберкулинов, используемых в гуманитарной и ветеринарной медицине.
Литература
1. Овдиенко Н.П. Эпизоотология крупного рогатого скота за рубежом // Ветеринария.-1989.-№ 8.-С.7-10.
2. Ткаченко O.A. Туберкульоз i мжобактерюзна шфекщя велико! рогато! худоби // Автор. дис.... докт. вет. наук.-Кшв-1999.-35 с.
3. Туберкулез животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич, А.Т.Борзяк, А.Ф. Кочмарский, О.В. Мартма и др.: Под ред. Ю.Я. Кассича.- К.: Урожай, 1990.-304с.
4. Юсковец М.К. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птиц.-Минск, 1963.-450 С.
5. Кузин А.И. Туберкулез сельскохозяйственных животных и его профилактика. -М.: Росагропомиздат, 1992.-189 с.
6. Фещенко Ю.1., Мельник В.М., Турченко Л.В., Власенко В.В. КлЫчна Оцшка Швидкого Виявлення Мжобактерш На Живильному Середовищ1 Вкг Украшський пуль монолопчний журнал 2003 №2 с. 15-18.
7. Straus et Gamaleia. Contribution a Vetude da poison taberculeux. Archives de medecini experim., 1891, p. 705.—Auclair. Etude, expcrimentale sur les poisons du bacilli tuberculeux. Paris, 1897.
8. Grancher и Ledoux - Lebard цитируется по Эд Нокарду, Э Легланчу Микробные болезни животных. Санкт - Петербург 1908 г. с. 124.
42
9. Лемиш А.П., Красникова Е.Л., Полоз А.И. Биохимические свойства культур микобактерий выращенных на питательной среде ВКГ.
10. Лысенко А.П., Красникова Е.Л. , Полоз А.И., Агеева Т.Н. Морфология и культуральные свойства микобактерий, выращенных на среде ВКГ II Ветеринарная наука производству - Науч. труды, - Минск 2002. -Выпуск 36 - с. 69-75.
11. Власенко В.В. Туберкулез в фокусе проблем современности. Винница: Наука, 1998.- 350с.
Summary
Vlasenko V.V., Vlasenko I.G., Lysenko AP., Voytsitskaya O.M.
RAPID METHOD FOR DETERMINING STERILITY TUBERCULIN PPD
FOR MAMMALS.
The paper presents the results of a selection agent of tuberculosis with tuberculin and the study of biochemical properties of mycobacteria in the environment Vlakon. The possibility of tuberculin test for sterility.
Key words: tuberculin, Mycobacterium, biochemical properties, nutrient medium.
Рецензент - к.б.н., доцент Турко 1.Б.
43
