CC BY
12
УДК 637.5:574.2
Лысенко А.П., проф. д.вет.н.,* Власенко В.В., проф. д. б.н,** Власенко И.Г., к.б.н.** Архипов И.Н., аспирант*© *РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», г.
Минск
**Винницкий государственный аграрный университет
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ФОРМ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА В АВТОКЛАВИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТАХ
Наведены даны использования куриных ембрыоныв для виявления жизнеспособных форм возбудителя туберкульоза. Показан рост возбудителя туберкулеза в хориоалантоисной жидкости, что о дает возможность выявления жизнеспособных форм в ППД туберкулине
Ключевые слова: эмбрионы кур 10-дневной инкубации, суспензии Я M. bovis 8, ППД туберкулин, питательные среды ВКГ и Влакон
Более ста лет для диагностики туберкулеза у человека и животных применяют туберкулин. Важным этапом его приготовления является автоклавирование для инактивации патогенного штамма продуцента при температуре 121°С 30-60 мин. В последнее время появились сообщения о том, что из туберкулинов удается выделять жизнеспособные, измененные формы микобактерий туберкулеза (МБТ) [1,3]. В препаратах туберкулинов обнаружены светопреломляющие некислотоустойчивые зерна и другие морфологические формы, которые, вероятно, терморезистентны и содержат жизнеспособные злементы МБТ [4,5].
Изоляты из туберкулинов, полученные с использованием стимулятора роста и питательиой среды ВКГ [1], скорее всего можно рассматривать, как (труднокультивируемые бактерии с отсутствующей или дефектной клеточной стенкой) [2], которые вы-растают при активации терморезистентных структур МБТ. Они не обладают выраженной патогенностью, но способны персистировать в организме морских свиноки при пасажировании вызывать патологические процессы [1]. Восстановление МБТ удалось зарегистрировать не только на среде ВКГ [1 ], но и у животных после введення туберкулина в диагностической дозе. Значение зтих фактов трудно оценить без изучения феноменов, возникающих после введення туберкулина, с точки зрения наличия в препарате жизнеспособных структур. Кроме того, важной задачей становится разработка методов получения полностью стерильного диагностикума.
© Лысенко А.П., Власенко В.В., Власенко И.Г., Архипов И.Н., 2009
76
Целью работы явилось изучение возможности использование куриных эмбрионов для выявления жизнеспособных форм вавтоклавированных препаратах.
Материалы и методы. В опыте использовали эмбрионы кур 10-дневной инкубации.
Эмбрионам с соблюдением стерильности вводили:
- туберкулин очищенный (ТО) для млекопитающих серии 66 УП «Витебская биофабрика», по 0,2 мл (3 РЭК);
- суспензию M.bovis 8 в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, подвергнутую 30 мин автоклавированию при 1210С, по 0,1 мг в 0,2мл (3 РЭК);
- ППД туберкулин для птиц серии 1 Курской биофабрики (10 мг растворено в 10 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия) по 0,2 мл (3 РЭК);
- по 0,2 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия (контроль).
Куринные эмбрионы инкубировали в термостате 10 суток при 370С,
после чего вскрывали, стерильно отбирали хориоалантоисную жидкость, из которой делали мазки и смешивали со антисептиком - стимулятором роста Влакон (1:2). Смесь инкубировали при 370С 24 ч, и высевали на свежеприготовленные питательные среды ВКГ и Влакон (по 2 чашки Петри). Посевы инкубировали 4 суток при 370С.
Результаты исследований. Установлено, что при овоскопии РЭК контрольной и опытных групп оставались живыми весь период инкубации. При вскрытии эмбрионов хориоалантоисная жидкость и желточный мешок РЭК контрольной группы были желтого цвета. Хориоалантоисная жидкость РЭК опытных групп была с красноватым оттенком, а желточный мешок зеленоватого цвета, что свидетельствует о гипоксии инфицированных эмбрионов.
В мазках из хориоалантоисной жидкости РЭК опытных групп, окрашенных по Циль-Нильсену, были обнаружены мелкие шары, диплококки, иногда единичные фуксинофильные палочки. В мазках от эмбрионов, инфицированных автоклавированной суспензией M. bovis 8 обнаружены единичные рубиново-красные элементы и крупные шарообразные структуры .
Материал от каждого инфицированного и контрольного РЭК после инкубации в стимуляторе роста ВКГ высевали на питательные среды ВКГ и Влакон (по 2 чашки). Результат оценивали, как «+» если, хотя бы на одной из чашек, отмечался рост колоний. Дополнительным контролем служил посев туберкулинов после инкубации в антисептике - стимуляторе роста Влакон.
В таблице 1 представлены результаты посева материала от РЭК. Во всех случаях из материала эмбрионов опытных групп был получен рост «парафиновых» колоний.
77
Таблица 1.
Результаты посева материала от РЭК, которым были введены _автоклавнрованные препараты МБТ_
Группа РЭК Рост на питательных средах Микроскопия мазков по Ц-Н
ВКГ Влакон
Контроль - -
ТО + + Смесь некрупных синих шаров с прозрачной капсулой, иногда в виде диплококков и рубиново-красных полиморфных палочек
M.bovis автокл. + +
ППД для птиц + +
Контроль роста препаратов
ТО + +
ППД для птиц + +
В мазках, окрашенных по Циль-Нильсену, приготовленных из выросших колоний материала РЭК, инфицированных ТО обнаружена смесь некрупных синих шаров с прозрачной капсулой, диплококков и рубиново-красных полиморфных палочек (рис. 1).
ч
Л $
■ *■•* * I
• ^ и -А Т'
г%
-ч
*
Рис. 1. Рост материала РЭК, инфицированного ТО серии 66 (окраска по
Цнль-Ннльсену)
В мазках, приготовленных из колоний, выросших из материала РЭК, инфицированного автоклавированной суспензией M.bovis 8, обнаружены участки протопластов с крупными слоистыми клетками (рис. 2), а также некрупные синие шары с капсулой, иногда в виде диплококков, рубиново-красные полиморфные палочки (рис. 3).
78
Рис. 2, 3 Рост материала РЭК, инфицированных автоклавированной суспензией M.bovis 8 (окраска по Циль-Нильсену)
В мазках из выросших колоний материала РЭК, инфицированных ППД туберкулином для птиц обнаружена смесь некрупных синих шаров, участков протопластов с включениями рубиново-красных палочек (рис.4), а также отдельно лежащих рубиново-красных палочек (рис. 5 ).
Рис. 4, 5 Рост материала СПФ-эмбриона, инфицированного ППД туберкулином для птиц с. 1 (окраска по Циль-Нильсену)
Контрольный посев ТО и ППД туберкулина для птиц также во всех случаях дал рост на средах ВКГ и Влакон. В посевах ТО обнаруживались участки протопластов с включением рубиново-красных кокков, красные и синие шары с прозрачной оболочкой, отдельные рубиново-красные палочки.
В посевах ППД туберкулина для птиц серии 1 обнаруживались цепи из палочек, мелкие зерна, рубиново-красные элементы и единичные рубиново-красные палочки.
Выводы
1. Исследования, проведенные на куриных эмбрионах позволили выявить жизнеспособные формы возбудителя туберкулеза в автоклавированых препаратах.
2. Контрольный посев ТО и ППД туберкулина для птиц дал положительный результат во всех случаях на средах ВКГ и Влакон, а при микроскопии мазков с
79
колонии скультур обнаруживались участки протопластов с включением рубиново-красных кокков, красные и синие шары с прозрачной оболочкой, отдельные рубиново-красные палочки возбудителя туберкулеза.
Литература
1.Власеико В.В. Туберкулез в фокусе проблем современности// Винница: Наука, 1998.- 350 с.
2. Елисеева И.В., Бабич Е.М., Волянский Ю.Л., Скляр Н.И., Белозерский В.И. Роль латентних, труднокультивируемых и некультивруемых пер-систентных бактерий в патологии человека // Аналь! Мечниковского Института (Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины).- 2006.- N 1.
3. Лнсенко А.П., Лемиш А.П.. Красникова Е.Л., Архипов И.Н., Власен-ко В.В.,. Власенко И.Г., Васильев А.Н., .Петрик О.А, Сапсай В.И., Васильева И.Г., Притнченко А.Н., Рубникович Т.П. Изучение термической устойчивости микобактерий туберкулеза // Проблеми туберкулеза и бо-лезней легких. -2007. -№2 .- с.42-46
5. Лнсенко А.П., Лемиш А.П., Т.П. Новик, Архипов И.Н., Притнченко А.Н., Власенко И.Г. Виявление адаптивних форм микобактерий в туберкулинах //Современнне проблеми инфекционной патологии человека. Сборник научннх трудов.- Випуск 1.- Минск.-«Белпринт».-2008.- с.227-230.
. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Морфология измененннх форм микобактерий туберкулеза // Проблеми туберкулеза .-1988.-№4.-с.57-59.
Стаття надшшла до редакцИ 25.09.2009
80
