CC BY
8
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-313-316 УДК 616.72-007.248 Яковенчук Н. М.
ЕКСПРЕС1Я СУДИННОГО ЕНДОТЕЛ1АЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТУ В СУГЛОБОВОМУ ХРЯЩУ ТА СУБХОНДРАЛЬН1Й К1СТЦ1 ПРИ АРТРОЗ1 (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ)
КЗ «Сумська обласна кшшчна лжарня» (м. Суми)
Зв'язок публшацм з плановими науково-дослщ-ними роботами. Стаття е фрагментом дослiдження по темi «Вивчити загальш ланки в механiзмi патогенезу остеопорозу, остеоартрозу та остеохондрозу хребта для обг"рунтування пiдходiв шдвищення ефективностi дiагностики, профiлактики та лтуван-ня». Шифр теми ЦФ.2017.1.НАМНУ, № державно! реестраци 0117и001021.
Вступ. Артроз - це дегенеративне захворювання суглобiв. Патологiчний процес супроводжуеться не ттьки втратою суглобового хряща, але страждають i iншi елементи суглоба: пщвищуеться ремоделю-вання субхондрально! кiстки, прогресують запальн1 явища в суглобовiй капсулу проявляеться слабкiсть зв'язок i м'язiв. Основнi клiнiчнi симптоми захворювання - це суглобовий бть i обмеження рухливосп, що порушуе яшсть життя хворого. На сьогоднi патогенез порушень в суглобовому хрящi розглядають в едностi зi станом субхондрально! кiстки [1]. У пато-генезi патологи визначають роль цтого ряду чинни-кiв, якi шдукують змiни метаболiзму i структури суглобового хряща, там як металопротешази (ММРз), агрекенази, цитокiни, хемокiни, фактори росту. В полi зору дослщнимв перебувае судинний ендоте-лiальний фактор росту (VEGF), котрий е важливим медiатором енхондрально! осификаци; розвитку I росту скелета [2-4]. Доведено, що VEGF продукують гiпертрофованi хондроцити, це призводить до сти-муляци ангюгенезу, що пов'язано з капiллярною ш-вазiею суглобового хрящ з пщлегло! субхондрально! кiстки в умовах артрозу. К^м того, встановлено, що VEGF експресують хондроцити суглобового хряща в нормi та у разi прогресування патолопчних сташв, таких як артроз [5,6].
Однак виникае цта низка питань, пов'язаних з дослщженням особливостей його експреси в ар-трозному хрящу в рiзних зонах на раншх стадiях артрозу, а також в пщлеглш субхондральнiй мстщ, ви-значення чи е взаемозв'язок мiж експресiею VEGF в суглобовому хрящi та субхондральнiй кiстцi. Вщпо-вiдi на цi питання можуть бути отримаш при вико-ристанш експериментальних моделей на тваринах.
Мета дослщження: на основi iммуногiстохiмiч-ного дослщження вивчити експресiю VEGF в суглобовому хрящi i субхондральнш кiстцi в умовах мо-делювання артрозу у тварин.
Об'ект I методи дослщження. Об'ектом до-слщження було вивчення експреси VEGF хондро-цитами суглобового хряща i остеоцитами субхондрально! мстки колiнного суглоба щурiв в умовах моделювання остеоартрозу шляхом оварюектоми. Вiдомо, що метод оварюектоми тварин широко ви-користовують для дослщження остеопорозу. Однак вщомо, що в умовах дефiциту естрогешв розвива-ються не тiльки остеопоротичш, але й артротичн1
змiни в суглобах, що було доведено з використан-ням експериментального моделювання i в клЫч-них умовах [7,8]. Експеримент на 12 лабораторних щурах був виконаний в експериментально-бюлопч-но! клЫц ДУ «1нститут патологи хребта та суглобiв iм. проф. М.1. Ситенка НАМН Укра!ни» з додержан-ням правил гуманного вiдношення до експериментальних тварин та асептики зпдно «европейсько! конвенци про захист хребетних тварин, що вико-ристовують для дослщних та iнших наукових цтей» та статтi 26 Закону Укра!ни про захист тварин вщ жорстокого поводження вiд 21.02.2006 № 3447-М «Правила поводження з тваринами, що викорис-товуються в наукових експериментах, тестуванш, навчальному процесi, виробницв бiологiчних пре-паратiв» [9,10].
Шсля премедикаци та введення тварин в наркоз, був виконаний поперечний пошаровий розрiз передньо! черевно! стшки до 1,5 см. Пiнцетом були видтеш роги матки та яечники, тсля перев'язки шовного ниткою !х вiдсiкали. Рану ушивали поша-рово. Тварин дослщно! i контрольно! груп виводили з експерименту через 3 мк. тсля операци.
Дослiдження було проведено з дотриманням норм бюетики (протокол № 155 вщ 29.06.2016 р).
Використано метод пстолопчного дослщження [11] стану колiнного суглобу у тварин тсля оварюектоми для визначення артрозних змш в суглобi з наступною оцшкою VEGF методом iммуногiстохi-мiчного аналiзу за використання моноклональних антитт, якi реагують з нативним та денатурованим VEGF людини та мишi (антитiло проти VEGF 165А [6В7] (аЬ69479). Позитивним е виявлення бтку VEGF.
Результати дослщження та !х обговорення. За
гiстологiчним дослiдженням встановлено, що через 3 мк. у щурiв пiсля оварюектоми в суглобовому хрящу колшного суглоба, якш покривае вiдростки стегново! та великогомтково! кiсток, мали мiсце пстопатолопчш змiни. Передусiм зафiксовано слаб-ко виражене розшарування матриксу суглобового хряща, що найбтьше проявлялося в медiальнiй частинi стегново! кiстки. Знижена щтьшсть хондро-цитiв та порушено !хнш розподiл в зонах суглобового хряща (рис. 1).
Суглобова поверхня зберкала цткшсть, тобто не виявлено и узураци, однак у поверхневш зонi за клiтинним складом встановлено порушення ^тин-но! оргашзаци. Мали мкце клiтини з пiкнотичними ядрами на тл хондроцитiв з великими слабко ба-зофiльними ядрами, що свщчить про активацiю в таких кл^инах бiосинтетичних процесiв. Виражен1 змши зафiксовано в промiжнiй зонi. Подекуди на дтянках розташовувалися невеликi клони хондро-цитiв, що включали 2-3 кл^ини, якi межували з без-
Рис. 1. Порушена кл^инна оргашзащя суглобового хряща. Клони хондроцитiв. Безкл^инш дiлянки. Пiкноз хондроцитiв. 3
мк. пiсля оварюектомм. Гематоксилш та еозин. Зб. 200.
кл^инними дтянками. В глибокш зонi суглобового хряща виявлено розширеш лакуни без хондроцитiв. В субхондральнш кiстки зафiксовано низьку щть-нiсть остеоцитiв та дiлянки з мтротрщинами.
Таким чином, оварюектомiя, яка супроводжуеть-ся порушенням функцiонування естрогешв, через 3 мiс. призводить до порушення структурно!' оргаш-зацií суглобового хряща та прилегло! субхондраль-но! кiстки. Встановленi змiн в суглобовому хрящу за морфолопчною класифiкацiею [12] можуть бути вщнесеш до першо! та початку друго! стадií артрозу.
Шсля постановки iммуногiстохiмiчноí реакцií VEGF на проксимальному вiддiлi стегново! тстки тварин, яким моделювали артроз, встановлено, що на раннiх термiнах розвитку в суглобовому хрящу артрозних змш хондроцити мають позитивну iмму-нореактившсть у всiх зонах суглобового хряща (рис. 2). У разi постановки реакцп VEGF у контрольних тварин iммунопозитивна реакцiя виявлена в зош п-пертрофованого хряща. Аналогiчнi даш представлено в лiтературi: доведено, що в нормальному суглобовому хряш^ цей фактор синтезують в основному ппертрофоваш хондроцити, якi експресують кола-ген X типу разом з шшими факторами, що сприяе мiнералiзацií матриксу [13]. Гiпертрофiя хондроци-тiв е ключовим кроком в ендохондральнш оссифн кацií i лсно пов'язана з артрозом, однак ймовфно, VEGF не регулюе гiпертрофiю хондроцилв безпосе-редньо, а процес мiнералiзацiя / осифiкацiя вщбу-ваеться через непрямий мехашзм [13,14].
Нами в умовах експериментально шдуковано-го артрозу виявлено, що поряд з високим рiвнем бюсинтезу VEGF в глибокш зош, тдвищуеться щть-нiсть хондроцилв з позитивною iммунореактивнiс-тю на VEGF в дiлянках промiжноí та поверхнево( зон (рис. 2).
За даними л^ератури у пацiентiв з артрозом виявлено, що експреая VEGF збтьшуеться в суглобовому хрящi, синовiальнiй оболонцi i синовiальний рiдинi, субхондральнш шстц та сироватцi кров1 [13]. Також тдвищеш рiвнi рецепторiв VEGF були за-реестрованi в хондроцитах у хворих на артроз [15]. Також доведено, що висока експреая VEGF значно попршуе перебiг артрозу [16].
В дослщженш субхондральноí тстки пiсля постановки реакцií на VEGF лише поодинокi остеоци-
ти мали позитивну iMMyHopeaK^BHicrb щодо VEGF. В основному пщвищену щiльнiсть кттин, KOTpi експресують VEGF, зафтсовано в кiстково-мозкових порожнинах, де розташовуються мультипотентн1 клiтини попередникi хондроцитiв, остеобласпв, ен-дотелiоцитiв та iнших [17]. На дтянках визначено набряк тсткового мозку.
Вiдомо, що VEGF сприяе мiграцií та диференщ-юванню остеобласпв, а зниження позитивних iм-мунореактивних остеоцилв негативно впливае на процес ремоделювання та метаболiзм кiстки, в щх умовах пiдвищуеться адипогенез [18,19]. Недавш дослiдження показали критичну роль VEGF в про-цесi ендохондрально!' осифiкацií в умовах артрозу, зокрема, тдвищення резорбцп хряща з утворенням кiстковоí тканини. Тобто, отриманi нами даш, щодо низького рiвня VEGF в тстковш тканинi и тдвищення його рiвня в артрозному хрящi свiдчать про порушення балансу тстково-хрящово!' взаемодií вже на раншх стадiях розвитку артрозу.
Рис. 2. Експреая VEGF хондроцитами в умовах експериментально шдукованого артрозу у щурiв. lммуногiстохiмiчна реакцiя на VEGF. Зб. 200.
Висновки. На основi iммуногiстохiмiчного дост-дження визначено, що в умовах артрозу експреая VEGF в^д^чаеться у клiтинах всiх зон суглобового хрящу. В субхондральнш тстки рiвень експресií VEGF низький. Розумшня значення взаемозв'язку суглобового хряща та субхондрально( кiстки через систему VEGF при артрозi буде сприяти поглиблен-ню знань про механiзми та вдосконаленню патоге-нетичних пiдходiв до консервативно( стратегií лту-вання.
Перспективою подальших досл1джень буде ви-значення експресп VEGF в суглобовому хрящу хворих на остеоартроз на матерiалi отриманим тсля хiрургiчного лтування.
Лггература
1. Korzh NA, Dedukh NV, Yakovenchuk NN. Osteoporoz i osteoartroz: patogeneticheski vzaimosvyazannyie zabolevaniya? (obzor literatury). Ortopediya, travmatologiya i protezirovanie. 2013;4:102-10. [in Russian].
2. Dai J, Rabie AB. VEGF: an essential mediator of both angiogenesis and endochondral ossification. J. Dent Res. 2007;86(10):937-50. DOI: 10.1177/154405910708601006
3. Nagao M, Hamilton JL, Kc R, Berendsen AD, Duan X, Cheong CW, et al. Vascular Endothelial Growth Factor in Cartilage Development and Osteoarthritis. Scientific Reports. 2017;7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-13417-w
4. Zelzer E, Olsen BR. Multiple roles of vascular endothelial growth factor (VEGF) in skeletal development, growth, and repair. Curr Top Dev Biol. 2005;65:169-87. DOI: 10.1016/S0070-2153(04)65006-X
5. Pfander D, Körtje D, Zimmermann R, Weseloh G, Kirsch T, Gesslein M, et al. Vascular endothelial growth factor in articular cartilage of healthy and osteoarthritic human knee joints. Ann Rheum Dis. 2001;60:1070-3.
6. Pufe T, Petersen W, Tillmann B, Mentlein R. The splice variants VEGF121 and VEGF189 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor are expressed in osteoarthritic cartilage. Arthritis Rheum. 2001;44:1082-8. Available from: https://doi.org/10.1002/1529-0131(200105)44:53.0.CO;2-X
7. Povoroznyuk VV, Grigoreva NV. Osteoartroz u zhenshin v postmenopauze: faktory riska i svyaz s kostnoj tkanyu. Endokrinologiya. 2012;6(8):64-71. [in Russian].
8. Yakovenchuk NM, Dedukh NV. Morfologiya suglobovogo hryasha ta subhondralnoyi kistki pislya modelyuvannya osteoporozu. Visnik problem biologiyi i medicini. 2017;4,3(141):324-7. DOI: 10.29254/2077-4214-2017-4-3-141-324-327 [in Ukrainian].
9. Evropeyska konventsiya pro zahist hrebetnih tvarin, scho vikoristovuyutsya dlya doslidnih ta inshih naukovih tsiley. Strasburg, 18 bereznya 1986 roku: ofItsiyniy pereklad [Internet]. Verhovna Rada Ukrayni. Ofits. veb-sayt. (Mizhnarodniy dokument Radi Evropi). Dostupno: http: zakon.rada.gov. ua/cgi-bin/laws/main.cgi?nreg=994_137 [in Ukrainian].
10. Zakon Ukrayini № 3447-IV vid 21.02.2006 «Pro zahist tvarin vid zhorstokogo povodzhennya» (Stattya 26). [in Ukrainian].
11. Sarkisov DS, Perov YuL. Mikroskopicheskaya tehnika. M.: Meditsina; 1996. 544 s. [in Russian].
12. Mankin H, Dorfman H, Lippiellon L, Zarins A. Biochemical and metabolicabnormalitics in articular cartilage from osteoarthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. J. Bone Joint Surg. Am. 1971;53:523-37.
13. Hamilton JL, Nagao M, Levine BR, Chen D, Olsen BR, Im H-J. Targeting VEGF and its receptors for the treatment of osteoarthritis and associated pain. J. Bone Miner. Res. 2016;31:911-24. Available from: https://doi.org/10.1002/jbmr.2828
14. Yamairi F, Utsumi H, Ono Y, Komorita N, Tanaka M, Fukunari A. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) associated with histopathological changes in rodent models of osteoarthritis. J.Toxicol.Pathol. 2011;24:137-42. DOI: 10.1293/tox.24.137
15. Enomoto H, Inoki I, Komiya K, Shiomi T, Ikeda E, Obata K, et al. Vascular endothelial growth factor isoforms and their receptors are expressed in human osteoarthritic cartilage. Am J Pathol. 2003;162:171-81.
16. Yuan Q, Sun L, Li JJ, An CH. Elevated VEGF levels contribute to the pathogenesis of osteoarthritis. BMC Musculoskelet Disord. 2014;15:437. Available from: https://doi.org/10.1186/1471-2474-15-437
17. Hu K, Olsen BR. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. J Clin. Invest. 2016;126:509-26. Available from: https://doi.org/10.1172/JCI82585
18. Liu Y, Berendsen AD, Jia S, Lotinun S, Baron R, Olsen BR, et al. Intracellular VEGF regulates the balance between osteoblast and adipocyte diferentiation. J Clin Invest. 2012;122:3101-13. Available from: https://doi.org/10.1172/JCI61209
19. Mayr-Wohlfart U, Waltenberger J, Hausser H, Kessler S, Günther KP, Dehio C, et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone. 2002;30(3):472-7.
ЕКСПРЕС1Я СУДИННОГО ЕНДОТЕЛ1АЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТУ В СУГЛОБОВОМУ ХРЯЩУ ТА СУБХОНДРАЛЬ-Н1Й К1СТЦ1 ПРИ АРТРОЗ1 (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ) Яковенчук Н. М.
Резюме. На сьогодш патогенез порушень в суглобовому хрящi розглядають в едност 3i станом субхон-дрально! метки. В полi зору дослщнимв перебувае ендотелiальний фактор росту (VEGF), котрий е важливим медiатором ендохондрально! осификацп; розвитку i росту скелета. Метою дослщження було вивчення екс-преси VEGF хондроцитами суглобового хряща i остеоцитами субхондрально! мстки колшного суглоба щурiв в умовах моделювання остеоартрозу шляхом оварюектоми. Визначено, що на раншх термшах розвитку ар-трозних змш в суглобовому хрящу тсля постановки iммуногiстохiмiчно! реакци VEGF хондроцити мають по-зитивну iммунореактивнiсть у вах зонах суглобового хряща на вщмшшсть вщ контрольних тварин, у яких VEGF виявлено ттьки в зон ппертрофованого хряща. В дослщженш субхондрально! мстки встановлено, що лише поодинок остеоцити мали позитивну iммунореактивнiсть щодо VEGF. В основному пщвищену щть-шсть клп"ин, котрi експресують VEGF, зафтсовано в мстково-мозкових порожнинах, де розташовуються муль-ттотентш кл^ини попередник хондроцилв, остеобласлв, ендотелюцилв та шших. На дтянках визначено набряк мсткового мозку. Мае мкце порушення балансу шстково-хрящово! взаемодп вже на раншх а^ях розвитку артрозу. Розумшня значення взаемозв'язку суглобового хряща i субхондрально! мстки через систему VEGF в умовах артрозу сприятиме поглибленню знань про мехашзми розвитку порушень i буде сприяти вдосконаленню патогенетичних пiдходiв до консервативно! стратеги лтування.
^K>40Bi слова: судинний ендотелiальний фактор росту, моделювання артрозу, колшний суглоб, суглобо-вий хрящ, субхондральна мстка.
ЭКСПРЕССИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА В СУСТАВНОМ ХРЯЩЕ И СУБХОНДРАЛЬНОЙ КОСТИ ПРИ АРТРОЗЕ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Яковенчук Н. Н.
Резюме. Патогенез нарушений в суставном хряще рассматривают в единстве с состоянием субхондраль-ной кости. В поле зрения исследователей находится сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который является важным медиатором эндохондральной осификации; развития и роста скелета. Целью исследования было изучение экспрессии VEGF хондроцитами суставного хряща и остеоцитами субхондральной кости коленного сустава крыс в условиях моделирования остеоартроза путем овариоэктомии. Установлено, что на ранние сроки развития в суставном хряща артрозных изменений хондроциты имеют положительную имму-нореактивность VEGF во всех зонах суставного хряща в отличии от контрольных животных, у которых VEGF
обнаружены только в зоне гипертрофированного хряща. В исследовании субхондральной кости установлено, что лишь единичные остеоциты имели положительную иммунореактивность по VEGF. В основном повышенную плотность клеток, которые экспрессируют VEGF, зафиксировано в костно-мозговых полостях, где располагаются мультипотентные клетки- предшественники хондроцитов, остеобластов, эндотелиоцитов и др. Так как VEGF отражает сосудистую инвазию, имеет нарушение баланса костно-хрящевого взаимодействия уже на ранних стадиях развития артроза. Понимание значения взаимосвязи суставного хряща и субхондральной кости через систему VEGF в условиях артроза будет способствовать углублению знаний о механизмах развития нарушений и способствовать совершенствованию патогенетических подходов в консервативной стратегии лечения.
Ключевые слова: сосудистый эндотелиальный фактор роста, моделирование артроза, коленный сустав, суставной хрящ, субхондральная кость.
EXPRESSION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN ARTICULAR CARTILAGE AND SUBCHONDRAL BONE IN OSTEOARTHRITIS (EXPERIMENTAL STUDY)
YakovenchukN. N.
Abstract. The pathogenesis of disorders in articular cartilage is considered in unity with the state of the subchondral bone. In the field of view of the researchers is vascular endothelial growth factor (VEGF), which is an important mediator of endochondral ossification; development and growth of the skeleton.
The aim of the study was to study the expression of VEGF by articular cartilage chondrocytes and osteocytes of the rat knee joint subchondral bone under conditions of osteoarthrosis modeling by ovariectomy.
Object and methods. The experiment was conducted on 12 laboratory rats. The method of ovariectomy is used, since it is known that along with the development of osteoporosis in animals' arthrosis develops. The histological study of knee joint condition in animals after ovariectomy was performed for the determination of changes in the joint with subsequent evaluation of VEGF by immunohistochemical study. The knee joints of healthy rats were used as a control for an immunohistochemical reaction.
Results. By histological examination it is established that after 3 months in rats after ovariectomy in the articular cartilage of the knee joint (of the femur and tibia), histopathological changes occurred. First of all, we observed a weakly pronounced fibrillation of articular cartilage matrix, which most manifested itself in the medial part of the femur; reduced chondrocyte density and disturbance in their distribution in articular cartilage zones. It has been established that at early stages of development of arthritic changes in articular cartilage, chondrocytes have positive VEGF immunoreactivity in all areas of articular cartilage, in contrast to control animals in which VEGF is detected only in the area of hypertrophied cartilage. In the study of the subchondral bone, it was found that only single osteocytes had positive VEGF immunoreactivity. Basically, an increased density of cells that express VEGF is found in the bone marrow cavities, where multipotent progenitor cells of chondrocytes, osteoblasts, endothelial cells, etc. are located. Since VEGF reflects vascular invasion, it shows an imbalance of bone-cartilage interaction at early stages of development osteoarthritis.
Conclusion. On the basis of immunohistochemical research it was determined that in conditions of osteoarthritis, expression of VEGF is observed in cells of all zones of articular cartilage. The level of VEGF expression is low in subchondral bone. Understanding the importance of the relationship between articular cartilage and subchondral bone through the system of VEGF in conditions of arthrosis will enhance the knowledge about the mechanisms of development of disorders and will contribute to the improvement of pathogenetic approaches in the conservative treatment strategy.
Key words: vascular endothelial growth factor, osteoarthritis modeling, knee joint, articular cartilage, subchondral bone.
Рецензент - проф. брошенко Г. А.
Стаття надшшла 23.03.2019 року
