CC BY
84
Эксплантационное культивирование овариальной ткани
Ключевые слова: овариальная ткань, криоконсервации, культивирование
Keywords: cultivation, human ovarian tissue, cryopreservation
Семёнова М.Л.1, Филатов М.А. 1, Малинова И.В2, Комарова Е.В2, Киселева М.В. 2
1 МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, Российская Федерация)
119991, Российская Федерация, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 Биологический факультет
2 МРНЦ им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России (Обнинск, Российская Федерация)
249036, Российская Федерация, Калужская область, г. Обнинск, ул. Маршала Жукова, д. 10
Ovarian explant cultivating
Semenova M.L.1, Filatov M.A. 1, Malinova I.V. 2, Komarova E.V. 2, Kiseleva M.V. 2
1 Lomonosov Moscow State University (Moscow, Russian Federation)
1-12, Leninskie Gory, Moscow, Russian Federation, 119991 Faculty of Biology
2 A. Tsyb MRRC (Obninsk, Russian Federation)
10, Zhukov street, Kaluga region, Obninsk, Russian Federation, 249036 E-mail: mlsemenova@gmail.com
Поскольку криоконсервация яичниковой ткани постепенно входит в состав основных направлений развития репродуктивных технологий, исследование фолликулогенеза и разработка эффективных методик In vitro культивирования фолликулов представляет собой важнейшую задачу. Главной проблемой аутотрансплантации замороженной и впоследствии оттаявшей яичниковой ткани, взятой у онкологических больных, является опасность трансплантации раковых клеток обратно пациенту. В этом отношении, замороженная - оттаявшая фолликулярная культура - более заманчивая цель в долгосрочной перспективе, потому что она устранила бы любой риск реимплантации остаточных раковых клеток и, теоретически, могла бы продуцировать зрелые ооциты, избегая гибели фолликулов, вызванной ишемией или нормальной атрезией. Несмотря на то, что методы культивирования фолликулов In vitro значительно усовершенствовались благодаря продолжающимся активным исследованиям, проблемы роста и созревания ооцитов в таких системах остаются актуальными.
Культура фолликулов или фрагментов кортикального слоя яичника представляют из себя эксплантационную систему, направленную на получение In vitro ооцитов, способных к оплодотворению. На сегодняшний день существуют различные методики, позволяющие культивировать фрагменты яичников и отдельные фолликулы млекопитающих, однако протоколы, дающие стабильные результаты в настоящее время отсутствуют. Все методики их культивирования можно условно разделить на две большие группы: 2D и 3D системы. Фактически фолликулы, состоящие из большого числа клеток, сами являются 3D объектами, но при их культивировании без объемных субстратов (матриксов) говорят о культивировании в 2D системе. Целью нашего исследования является разработка эффективных методик In vitro культивирования фолликулов овариальной ткани для получения зрелых ооцитов, способных к оплодотворению и дальнейшему развитию.
Материалы и методы: Для проведения экспериментальных работ были выбраны 3D альгинатные субстраты: единичные фолликулы мыши инкапсулировали в каплю
альгинатного гидрогеля. Всего в ходе данных серий экспериментов (4 серии по 48, 21, 17, 47 образцов соответственно в каждую серию) было обработано 133 образца. В 72 случаях из 133 наблюдался выход ооцита из фолликула. В двух случаях было зафиксировано выделение первого редукционного тельца.
В ходе культивирования фолликулов на средах с различными комбинациями сыворотки и фолликулостимулирующего гормона было выявлено, что при использовании сред, содержащих 0.1 МЕ FSH, наблюдалась более интенсивная пролиферация фолликулярных клеток в ряде образцов. В ходе культивирования часть образцов (клетки которых наиболее интенсивно пролиферировали, либо обладали морфологическим характеристиками, характерными для вторичных многослойных фолликулов) переносилась из среды с ФСГ в среду, содержащую ФСГ и ХГЧ для окончательного созревания ооцитов, также часть образцов изымалась для проведения процедуры ЭКО или анализа с использованием флуоресцентного микроскопа. Хотя общая динамика роста фолликулярных клеток выше в средах с добавлением ФСГ, формирование ооцитов с первыми редукционными тельцами наблюдалось и при культивировании образцов в средах без добавления ФСГ с последующим переносом образцов в среду, содержащую ФСГ и ХГЧ. По-видимому, это связано с тем, что на более ранних стадиях фолликулогенеза основную роль играют ростовые факторы, вырабатываемые клетками теки и гранулезы. Экспозиция таких фолликулов в среде, содержащей избыточные количества гормонов, может приводить к слишком ранней инициации заключительной фазы роста, что должно неблагоприятно сказываться на ооците, хотя соматические клетки фолликула могут иметь признаки активной пролиферации и фолликулы значительно увеличиваются в размерах. Необходимым условием для повышения эффективности процедуры получения зрелых ооцитов в культуре In vitro является добавление коктейля ростовых факторов. Дальнейшая разработка технологии позволит перейти к эксплантаци-онному культивированию фолликулов и фрагментов овариальной ткани человека.
Г4б
Международная научно-практическая конференция «РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОНКОЛОГИИ» 22-23 мая 2015. Обнинск, Калужская область, Россия
