Возможности культивирования in vitro овариальной ткани Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Возможности культивирования in vitro овариальной ткани

Ключевые слова: овариальная ткань, культивирование

Keywords: ovarian tissue, in vitro growth

Отой Т.1, Абакушина Е.В.2, Каприн А.Д.3

1 Университет Ямагути (Ямагути, Япония)

2 МРНЦ им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России (Обнинск, Российская Федерация)

249036, Российская Федерация, Калужская область, г. Обнинск, ул. Маршала Жукова, д. 10

3 ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России (Обнинск, Российская Федерация)

249036, Российская Федерация, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королёва, д. 4

Opportunity for in vitro growth of ovarian tissue

Otoi T.1, Abakushina E.V.2, Kaprin A.D.3

1 Yamaguchi University (Yamaguchi, Japan)

1677-1 Yoshida, Yamaguchi-shi, Yamaguchi, 753-8511

2 A. Tsyb MRRC (Obninsk, Russian Federation)

10, Zhukov street, Kaluga region, Obninsk, Russian Federation, 249036

3 NMRRC (Obninsk, Russian Federation)

4, st. Korolev, Kaluga region, Obninsk, Russian Federation, 249036 E-mail: abakushina@mail.ru

Проблемы бесплодия или потери репродуктивной функции вследствие различных заболеваний и негативных последствий их лечения являются очень актуальными. Например, за последний год только с вновь выявленными онкологическими заболеваниями зарегистрировано 290 707 пациентов женского пола, среди которых 3 388 детей от 0 до 17 лет и около 23 000 женщин репродуктивного возраста, которые будут подвергнуты химио- и/или лучевой терапии, в результате которой многие из них станут бесплодными (Каприн и др., 2014). Другую группу составляют женщины с преждевременным истощением фолликулярного резерва, и они могли бы иметь детей при условии понимания и направленного воздействия на тонкие механизмы гаметогенеза. Развитие современных биотехнологических методов даёт надежду на сохранение репродуктивного потенциала молодых женщин с помощью криоконсервации гамет, в том числе и ранних фолликулов в ткани яичника и восстановление фертильности за счет реимплантации ткани яичников или её культивирования in vitro. Однако раннее развитие фолликулов является очень длительным процессом, а детальные молекулярно-клеточные механизмы процесса созревания яйцеклеток остаются до конца не изученными. Очевидно, что изучением молекулярных механизмов, опосредующих взаимодействие яйцеклетки с клетками гранулезы и экстраклеточного матрикса, является актуальной фундаментальной научной проблемой.

Для изучения фолликулогенеза и культивирования ооцитов были предложены различные модели на животных (Abakushina, et al., 2011; Telfer, et al., 2008). Для этого фолликулы или фрагменты ткани яичников погружались в 3D матрикс, в роли которого использовали коллаген типа II, альгинатный гель, или выращивались на специальных мембранах. В экспериментальных работах по выращиванию in vitro яйцеклеток из ткани яичника мыши удалось получить зрелый ооцит (Eppig, O'Brien, 1996). Однако, для более крупных животных такие работы требуют достаточно длительного культивирования. На примере выращивания вторичных фолликулов приматов было показано, что они способны развиваться до стадии антраль-

ного фолликула при культивировании в 3D системе (Xu, et al., 2010). Убедительно доказано, что жизнедеятельность яйцеклетки зависит от её локального окружения внутри фолликула. Формирование и поддержание связей, способствующих двунаправленным взаимодействиям между ооцитом и клетками гранулезы, является ключом в развитии ооцитов у всех видов животных. Необходимо понимание физиологических потребностей ооцитов при взаимодействии с клетками гранулезы, теки и, возможно, стромы. При культивировании больших фолликулов млекопитающих использование матриц позволило поддержать трехмерную архитектуру фолликулов in vitro и способствовало их росту и дифференцировке у крупного рогатого скота и человека (Telfer, et al., 2008). Однако культивирование примордиальных фолликулов человека in vitro остается перспективой будущего, а ведь именно из них складывается фолликулярный резерв. Инкапсуляция фолликулов в альгинатные гидрогели была использована для поддержания роста in vitro вторичных фолликулов человека (Xu, et al., 2009), макак-резус и павиана (Xu, et al., 2011). Полагают, что такая имитация внеклеточного матрикса в естественных условиях способствует проникновению питательных веществ, кислорода, гормонов и факторов роста и обмену между фолликулом и культуральной средой. Однако было зарегистрировано, что жесткость капсулы альгината влияет на развитие фолликула, тормозит их рост и снижает стероидогенез в мышиных фолликулах, встроенных в альгинатный гель. Использование 3D коллагенового матрикса для роста ооцитов, выделенных из ранних антральных фолликулов коров, как было показано нами, сохраняет жизнеспособность ооцитов, способствует формированию фолликулоподобных структур после второго дня культивирования и увеличивает их размер при групповом культивировании, в отличие от альгинатного геля (Abakushina, et al., 2011; Абакушина, Отой, 2014). Однако на сегодняшний день еще не было получено зрелой яйцеклетки человека, выращенной in vitro из примордиального фолликула, хотя работы в этом направлении ведутся и имеют определенный успех (Telfer, et al., 2008).

Международная научно-практическая конференция «РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОНКОЛОГИИ» 22-23 мая 2015. Обнинск, Калужская область, Россия

4П

На основании ряда последних исследований была предложена поэтапная многостадийная система развития фолликулов (Walters, et al., 2006). Данная система, в теории, позволяет получить зрелый ооцит, однако тонкий подбор ростовых факторов, гормонов и медиаторов необходим на каждом отдельном этапе. Также требуется детальная отработка методов выделения единичных фолликулов и подбор физических параметров культивирования ранних фолликулов. Роль многих факторов фолликулогенеза у человека еще предстоит оценить и изучить. Главная задача исследователей — это научиться активировать пул покоящихся примордиальных фолликулов in vitro, а также выявить эндокринные, паракринные и аутокринные факторы, необходимые для роста и созревания первичных фолликулов, что является ключевым доступом к неограниченному источнику зрелых ооцитов для их биомедицинских использований.

Нами при одиночном и групповом сокультивировании ранних антральных фолликулов черных японских коров с клетками кумулюса была предложена оригинальная методика группового культивирования в 3D коллагеновом матриксе (Abakushina, et al., 2011; Абакушина, Отой, 2014). На данной модели было показано, что фолликуло-подобные структуры формируются уже со второго дня культивирования кумулюс-ооцитарных комплексов, высокая жизнеспособность ооцитов сохраняется на протяжении 14 дней культивирования. Средний диаметр фолликуло-подобных структур при групповом культивировании был меньше, чем при индивидуальном, однако скорость формирования таких структур была достоверно выше. Метод группового культивирования может быть полезен для изучения различных механизмов фолликулогенеза и межклеточных взаимодействий ооцита и окружающих его клеток кумулюса.

Будущие перспективы метода культивирования фраг-

ментов овариальной ткани in vitro связывают с внедрением в лабораторную практику новых трехмерных многостадийных систем, воссоздающих естественные условия, в которых из ткани яичника можно будет выращивать зрелые яйцеклетки человека. Используя 3D поддерживающую матрицу, первичные и вторичные фолликулы смогут осуществлять билатеральные связи между соматическими и половыми клетками, создавая среду, благоприятную для роста ооцитов и синтеза стероидных гормонов. Очевидно, что следующим шагом исследований должны быть методы комплексной оценки морфологии фолликула, его функционального состояния и молекулярного портрета. Дополнительные исследования необходимы для демонстрации получения зрелой яйцеклетки in vitro и её пригодности для дальнейшего оплодотворения.

1. Каприн А. Д., Старинский В. В., Петрова Г. В. Москва: ФГБУ «МНИОИ им. П. А. Герцена» Минздрава России; 2014.

2. Abakushina E., Morita Y., Kaedei Y et al. Reprod Domest Anim. 2011, 46 (3): 423-427.

3. Telfer E. E., McLaughlin M., Ding C. et al. Hum. Reprod. 2008, 23: 1151-8.

4. Eppig J. J., O'Brien M. J. Biol Reprod. 1996, 54 (1):197-207.

5. Xu J, Bernuci MP, Lawson MS, et al. Reproduction. 2010, 140:685-97.

6. Walters K. A., Binnie J. P., Campbell B. K. et al. Reproduction. 2006, 131 (3): 515-23.

7. Xu M., Barrett S. L., West-Farrell E. et al. Hum Reprod. 2009, 24 (10): 2531-40

8. Xu M., Fazleabas A. T., Shikanov A. et al. Biol Reprod. 2011, 84 (4): 689-97

9. Абакушина Е. В., Отой Т. Материалы международной юбилейной конференции «100 лет Оттовской морфологии: от рутинной гистологии к молекулярной микроскопии» г. Санкт-Петербург, 29-31 мая 2014 г., с. 3, с.4

ГбО

Международная научно-практическая конференция «РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОНКОЛОГИИ» 22-23 мая 2015. Обнинск, Калужская область, Россия