CC BY
14УДК 615.37:616.9: 616.011.17
экспериментальное обоснование влияния иммунотерапии на механизм формирования госпитальных штаммов - возбудителей гнойно-воспалительных процессов смешанной candida-бактериальной природы
Шаталова Е.В. (профессор кафедры), Парахина о.В. (ассистент кафедры)*, чугуев А.с. (студент лечебного факультета)
Курский государственный медицинский университет (кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии), Курск, Россия
©Коллектив авторов, 2016
На популяционном уровне изучены механизмы формирования госпитальных штаммов возбудителей нозокомиальных инфекций (НИ) через иммунокомпрометированный организм по клинически значимым признакам. Установлено, что применение иммуномодуля-торов способствует снижению числа антибиотикорезистентных и вирулентных особей в популяциях возбудителей НИ.
Ключевые слова: госпитальные штаммы, иммунотерапия, смешанные инфекции, структура популяции
experimental study of immunotherapy influence of the mechanism of formation of hospital strains -causative agents of purulent-inflammatory processes of mixed
candida-bacterial nature
shatalova E.v. (professor of the chair), Parachina o.v. (assistant of the chair), chuguev A.s. (student of medical faculty)
Kursk State Medical University (Chair of microbiology, virology, immunology), Kursk, Russia
©Collective of authors, 2016
At the population level, the mechanisms of formation of hospital strains of nosocomial infections through immunocompromising the body by clinically significant signs have been studied. It was found that the use of immunomodulators reduces the number of antibiotic-resistant and virulent individuals in the populations of nosocomial infections pathogens.
Key words: immunotherapy, mixed infection, hospital strains, population structure
Контактное лицо: Парахина О.В., e-mail: [email protected]
введение
Одна из основных причин возрастания частоты нозокомиальных инфекций (НИ) - широкое распространение госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов, которые формируются в условиях стационара. Распространение госпитальных штаммов, прежде всего, стафилококков, псевдомонад, энтеробактерий и в последнее время - грибов рода Candida, обусловлено рядом особенностей последних, отражающихся на эпидемиологии внутрибольничных инфекций. Это обсеменение госпитальной среды носителями, контаминация медицинских приборов с образованием биопленки, длительная персистенция в окружающей среде, разнообразные механизмы устойчивости к антимикробным препаратам и, что особенно важно, скопление в стационарах иммунокомпрометированных больных за счет основного заболевания [1]. Все это помогает этим микроорганизмам быстро адаптироваться, выживать и получать селективные преимущества в больничной среде с накоплением в популяции вирулентных особей.
Особое беспокойство у врачей разных специальностей вызывает возрастание частоты гнойно-воспалительных процессов смешанной Candida-бактериальной природы. Это обусловлено выраженной тяжестью клинических проявлений, трудностями диагностики и химиотерапии таких больных [2].
Цель настоящего исследования - изучение динамики изменений структуры популяции возбудителей гнойно-воспалительных процессов смешанной этиологии по признакам вирулентности и лекарственной устойчивости в условиях иммуносупрессии организма и под влиянием иммуномодуляторов.
материалы и методы
Эксперименты выполняли на мышах линии СВА, прошедших карантинный режим вивария Курского ГМУ и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Контрольные и опытные группы состояли из животных одной массы и одного пола, полученные из вивария одновременно. Требования Международного Комитета, изложенные в конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (г. Страсбург, Франция, 18 марта 1986 г.), в работе были полностью соблюдены.
Для создания иммуносупрессии в организме животных нами была выбрана модель термического ожога III-В степени площадью 30% поверхности тела, который вызывали с помощью прибора для нанесения дозированного ожога [Минухин В.В., Шамрай В.Г. Устройство для нанесения дозированного ожога мелким животным // Деп. во ВНИИМИ. - 1985. - № Д-9976]. Через сутки после ожога рану инфицировали смесью суточных бульонных культур (по 0,1 мл 2 млрд. взвеси), выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами (Candida albicans + Pseudomonas aeruginosa). Популяции микробов из инфицированной ожоговой раны получали путем отпечатков с ее поверхности стерильными бархатными штампами на поверхность плотных питательных сред (ЦПХ-агар - для синегнойных бактерий и среда Сабуро - для грибов). Структуру популяции по признакам лекарственной устойчивости исследовали путем пересева 100 изолированных колоний со сред первичного посева на
■
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МИКОЛОГИЯ
чашки с МПА, содержащем 25 мкг/мл антибиотиков: карбенициллин, стрептомицин, полимиксин и кана-мицин (для синегнойных бактерий); амфотерицин В, леворин и нистатин (для C. albicans); по признакам патогенности - на 5% кровяной агар (гемолитическая активность) и на чашки Петри со свернутой лошадиной сывороткой (протеолитическая активность для псевдомонад).
Структуру популяций изучали у животных, не получавших иммуномодуляторы (на 14 сутки после инфицирования раны), а также по истечении 7 и 14 суток с момента инфицирования и применения иммуномо-дуляторов.
Показателями для оценки состояния уровня иммунной защиты были: фагоцитарная активность ней-трофилов периферической крови (% активных фагоцитов), фагоцитарное число (среднее количество фагоцитируемых микроорганизмов в расчете на один фагоцит), которые определяли по общепринятым методикам. По наличию лизосомальных катионных белков (КБ) в цитоплазме лейкоцитов периферической крови в мазках, окрашенных бромфеноловым синим, выявляли активность бактерицидных систем лейкоцитов [Шубич М.Г. // Цитология. - 1974. - Т. 16, №10].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Office XP» с применением критерия Стьюдента и Вил-коксона-Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
После изучения клональной структуры (100 колоний каждого штамма) популяций возбудителей гнойно-воспалительных процессов смешанной этиологии (C. albicans и P. aeruginosa) установлено, что в составе популяций всех изученных штаммов (12 штаммов грибов и 12 - псевдомонад), которые при определении антибиотикочувствительности методом стандартных дисков были отнесены к устойчивым, резистентные особи (клоны) составляли от 72,0% до 85,0% у P. aeruginosa и от 58,0% до 72,0% - у C. albicans (исходные культуры, табл. 1).
Ta6nu^ 1
Структура популяции возбудителей и влияние иммунотерапии на механизм ее формирования
Изучаемые признаки % особей в популяции (из 100 колоний) Р
Исходная монокультура Отнелеченных животных (ожог +инфицирование) От леченых животных (галавит + лидокаин)
Показатели в разные сроки исследования
14 сутки после инфицирования 7 сутки после лечения 14 сутки после лечения
Устойчивость к: Популяция P. aeruginosa
карбенциллину 72,0 100,0 58,0 47,0 <0,01
стрептомицину 75,0 100,0 50,0 30,0 <0,01
полимиксину 15,0 95,0 42,0 34,0 <0,01
канамицину 85,0 100,0 55,0 40,0 <0,01
Гемолиз 85,0 100,0 50,0 38,0 <0,01
Протеолиз 72,0 100,0 45,0 25,0 <0,01
Устойчивость к: Популяция C. albicans
Амфотерицину В 58,0 95,0 45,0 30,0 <0,01
Леворину 65,0 100,0 50,0 34,0 <0,01
Нистатину 72,0 100,0 55,0 42,0 <0,01
Гемолиз 55,0 85,0 30,0 25,0 <0,01
Примечание: достоверность различий с данными контрольной группы (нелеченные животные с ожогом и инфекцией) .
При анализе данных, полученных нами, в динамике инфекционного процесса от иммуносупрессированных животных выявили достоверное изменение структуры популяции микроорганизмов в сторону возрастания числа клонов, резистентных к антибиотикам (табл. 1). Причем, отметим, что нарастание числа антибиотикорезистентных клонов в популяциях культур происходило при отсутствии селективного влияния антибиотиков, так как лечения животных антибиотиками не проводили.
Кроме того, в динамике инфекционного процесса наблюдали также достоверное увеличение в популяциях возбудителей числа клонов, обладающих признаками вирулентности: гемолиз - от 85,0% в популяциях грибов до 100,0% - в популяциях псевдомонад; проте-олитически активных клонов в популяциях псевдомонад достоверно возросло с 72,0% у исходных культур до 100,0% на 14 сутки исследования после инфицирования (табл. 1). Таким образом, можно констатировать, что к концу эксперимента изначально гетерогенные популяции микроорганизмов становятся однородными по содержанию высоковирулентных и устойчивых к антибиотикам клонов (Р < 0,01).
Учитывая то, что иммуносупрессирующий организм животных способствует селекции наиболее вирулентных, с множественной лекарственной устойчивостью особей из состава популяции штаммов возбудителей, т.е. имеет место формирование штаммов с признаками «госпитальных» через иммунокомпро-метированный организм, возникает необходимость разработки способов повышения антиинфекционной резистентности организма, в конечном итоге - предупреждения формирования госпитальных штаммов.
Принимая во внимание патогенез ожоговой болезни, для восстановления иммунологической реактивности организма животным вводили галавит (внутримышечно в дозе 200 мкг/мышь сразу после воспроизведения ожоговой травмы 1 раз в сутки в течение 3 дней) с лидокаином (внутрибрюшинно в те же сроки в дозе 8 мкг/кг массы тела). При этом предполагали возможность их синергидного действия и, соответственно, повышения терапевтического эффекта за счет неодинакового механизма их действия. Нами установлено, что сочетанное применение данных препаратов обладало выраженным иммуномодулирующим эффектом на все изучаемые показатели, достоверно (Р<0,01) усиливая и превышая их уровни даже интактных животных. Так, активность фагоцитоза и фагоцитарное число у леченых животных на 14 сутки исследования составили 62,1+1,2 и 2,9+0,02 соответственно (табл. 2).
Отметим, что показатель КБ у леченых животных уже на 7 сутки исследования составил 0,1+0,03, а на 14 сутки - достоверно превысил средний гистохимический показатель КБ интактных животных - 0,26+0,03 (табл. 2). Это важно, поскольку известно, что наличие катионных белков в цитоплазме лейкоцитов периферической крови является весомым показателем при гнойно-воспалительных процессах любой этиологии.
Таблица 2
Влияние иммунотерапии на показатели антиинфекционной защиты организма
Группы животных
Изучаемые Интактные Ожог + инфицирование Лечениегалавитс лидокаином
показатели Показатели в разные сроки исследования (сутки) М+m (n=25)
7 - 14 7 14 7 14
Активность фагоцитоза (%) 60,5+0,12 30,2+2,8 27,6+1,7* 50,2+1,8 62,1+1,2**
Фагоцитарное число 2,1+0,05 0,7+0,02 0,6+0,03* 1,2+0,05 2,9+0,02**
КБ-тест (средний гистохимический показатель) 0,1+0,02 КБ не обнаружены 0,1+0,03 0,26+0,03 *
Примечание: х = Р<0,01 - достоверность различий с данными интактных животных; хх = Р<0,01 - достоверность различий с данными контрольной группы (ожог + инфицирование) .
Особого внимания заслуживают впервые полученные нами данные о существенных изменениях в составе популяций возбудителей гнойно-септических процессов на фоне иммунокоррекции. Применение галавита с лидокаином на 14 сутки исследования способствует достоверной (Р<0,01) элиминации из состава популяций клонов с выраженным вирулентным потенциалом (от 25,0% до 38,0% - у псевдомонад и 25,0% - у грибов) и антибиотикорезистентностью (от 30,0% до 47,0% - в популяциях псевдомонад и от 30,0% до 42,0% - в популяциях грибов) (табл. 1).
Следовательно, есть основания предположить, что
результатом этих изменений будет снижение клинических проявлений инфекционного процесса и повышение эффективности антибактериальной терапии.
выводы
1. Популяции возбудителей нозокомиальных инфекций гетерогенны по признакам вирулентности и устойчивости к антибиотикам.
2. На фоне выраженной иммуносупрессии в динамике инфекционного процесса в организме создаются условия, когда из исходных гетерогенных популяций возбудителей гнойно-воспалительных процессов формируются штаммы с признаками «госпитальных».
3. Применение галавита с лидокаином обеспечивает выраженный протективный эффект за счет высокоэффективной коррекции антиинфекционной резистентности организма животных, что способствует достоверной элиминации из состава популяций микроорганизмов клонов, обладающих клинически значимыми признаками (выраженный вирулентный потенциал и антибиотикорезистентность), и, в конечном итоге, предупреждению формирования штаммов с признаками «госпитальных» нозокомиальных инфекций.
Благодарность.
Авторы выражают благодарность ОБУЗ «Курская городская больница скорой медицинской помощи» в лице заведующей бактериологической лабораторией С.В. Пигаревой за организационную поддержку исследования.
цитированная литература
1. Зайцев С.Н. Эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями - важнейший компонент системы управления качеством стационарной медицинской помощи // Вопр. экспертизы и качества мед. помощи. - 2010. - №4. - С. 24-28.
2. Шеховцова О.В., Шаталова Е.В., Жалнина Т.С. Влияние гнойно-воспалительного процесса Candida-бaктериaльной этиологии на проявление гиперчувствительности замедленного типа // Проблемы медицинской микологии. - 2010. -Т. 12, №2. - С. 143-144.
Поступила в редакцию журнала 20.07.2016 Рецензент: П.В. Калуцкий
