CC BY
7leiomyomas on reproductive outcomes.): 225-236. Minerva Ginecologica, 225-236.
3. Hauptmann S., Köhler G. (march 2014). Etiology, Pathogenesis, and Malignant Potential of Uterine Leiomyoma. Current obstetrics and gynecology report, 186-190.
4. Kroon B., Johnson N., Chapman M., Yazdani A., Hart R. (51(4) august 2011). Fibroids in infertility-consensus statement from ACCEPT. Australasian CREI Consensus Expert Panel on Trial evidence. Australasian CREI Consensus Expert Panel on Trial evidence (ACCEPT) group. The Australian & New Zealand journal of obstetrics and gynaecology, 289-295.
5. Shannon K. Laughlin, Jane C. Schroeder, Donna Day Baird. (march 2010). New Directions in the Epidemiology of Uterine Fibroids. Seminars in Reproductive Medicine, 204-217.
6. Uterine Myoma, Myomectomy and Minimally Invasive Treatments. (2015).
7. Министерство здравоохранения Российской Федерации. (2015). Миома матки: диагностика, лечение и реабилитация. Клинические рекомендации (протокол лечения). Москва.
8. Татарчук Т. Ф., Косей Н. В., Джулин В. А. (декабрь 2014). Новая эра в лечении миомы матки у женщин различных возрастных групп. Репродуктивная эндокринология, 9-19.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИИ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА АНТИБИОТИКОВ НА ПРИМЕРЕ РИФАМПИЦИНА
д. б. н. Сипливая Л. Е. д. м. н. Сипливый Г. В. к. ф. н. Кукурека А. В. к. ф. н. Тарасова О. В.
Российская Федерация, г Курск Курский государственный медицинский университет
Abstract. Perspective direction of reducing the systemic toxicity of antibiotics is the development of new technologies focused, organ-specific and controlled delivery to the lesion. To this end, in recent years new drugs are being developed forms: spansuly, films or drug delivery systems by its immobilization in cellular media. The aim is to decrease immunosuppressive, pro-oxidant and hepatotoxicity rifampicin, through the use of immobilization techniques in erythrocyte vehicles. The effect on the degree of incorporation of rifampicin in erythrocyte vehicles such factors as the concentration of antibiotic solution and incubation time therein. The degree of inclusion of rifampicin erythrocyte vehicles independent of incubation time and concentration increase in antibiotic solution increases considerably the percentage of inclusion in the carrier erythrocyte. Thus free erythrocyte vehicles include antibiotics retain the ability for 9 days and erythrocyte vehicles antibiotic are stable for 48 hours. The effect of the free and immobilized antibiotic on the development of humoral immune response, the intensity of oxidative processes, processes of cytolysis and cholestasis in infected animals staphylococcus. It has been established that the introduction of infected animals rifampicin intensified immunosuppression caused by the introduction of staph. It is shown that increase in infections caused by staphylococcus concentration of conjugated dienes and malondialdehyde, while superoxide dismutase and glutathione activity was reduced compared with intact rats. The introduction of the antibiotic dose-dependently increased the infection caused by the decrease in the activity of antioxidant enzymes and increase the level of diene conjugates and malondialdehyde. With the introduction of rifampicin in high doses increases the risk of symptoms of hepatotoxicity. It was found that the five-time injection of rifampicin on the background of staphylococcus infection intensified process of cytolysis and cholestasis.
Keywords: rifampicin, antibiotics, red blood cells, directed transport, cellular carriers
Клинические наблюдения последних десятилетий свидетельствуют о значительном снижении эффективности антибиотиков, широко применяемых в терапевтической и хирургической практике. Побочное действие лекарственных препаратов, их малая эффективность нередко объясняются и труднодоступностью их в очаг поражения и в этом
плане антибиотики занимают особое место среди других групп лекарственных средств, так как имеют низкий химиотерапевтический индекс.
Для снижения системной токсичности антибиотиков используют их введение с препаратами-корректорами. Перспективным направлением снижения системной токсичности антибиотиков является разработка новых технологий целенаправленной, органоспецифической и контролируемой доставки их в очаг поражения. С этой целью в последние годы ведутся разработки новых лекарственных форм: спансул, плёнок или систем доставки лекарственного средства путём его иммобилизации в клеточные носители.
Целью работы является снижение иммуносупрессорного, прооксидантного и гепатотоксического действия рифампицина, путём использования технологии иммобилизации в эритроцитарные носители (ЭН).
В экспериментальных исследованиях использовали лекарственные и вспомогательные вещества, реактивы и растворители, отвечающие требованиям нормативной документации. В работе использовали отечественный препарат рифампицин производства АО "Ферейн". Исследования выполнены на крысах Вистар массой 150-180 г. Модель генерализованной стафилококковой инфекции воспроизводили путём заражения животных суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus (штамм "Жаев") внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз стафилококка, содержащих 1-108 микробных тел в объёме 0,5 мл. Антибиотик перед введением растворяли в изотоническом растворе натрия хлорида и вводили внутримышечно с интервалом 24 часа в дозах 10 и 20 мг/кг. Для включения антибиотика в эритроцитарные носители использовали метод гипоосмотического гемолиза [1]. Разовая доза рифампицина, введенного в ЭН (РВЭН) составила 20 мг/кг. ЭН с включенным антибиотиком вводили внутривенно двукратно с интервалом 24 часа.
Гуморальный иммунный ответ (ГИО) индуцировали однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 2*108 клеток на 0,1кг массы тела. Интенсивность развития ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации путём определения в селезёнке числа клеток, образующих антитела (АОК) к ЭБ [3].
Оценку выраженности окислительного стресса проводили через 24 часа после заключительного введения препаратов путём определения в крови концентрации диеновых коньюгатов жирных кислот (ДК) и малонового диальдегида (МДА) [5, 6], в эритроцитах -активности супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы (ГР) [2]. Индикаторами синдрома цитолиза служили аланинаминотрансфераза (АлТ) и аспартатаминотрансфераза (АсТ), синдрома холестаза - активность щелочной фосфотазы (ЩФ) и концентрация общего билирубина (ОБ) [4].
C целью включения антибиотика в эритроцитарные носители нами модифицирована ранее известная методика. Аллогенные эритроциты отмывали раствором изотонического натрия хлорида, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 5 минут, до получения прозрачного, бесцветного супернатанта. Отмытые эритроциты подвергали гемолизу путем добавления 8 мл воды охлажденной до 0оС с последующей инкубацией при температуре -12 оС в течение 60 минут и центрифугированием при 8000 об/мин в течение 25 минут. К полученным эритроцитарным носителям добавляли 2 мл раствора антибиотика, полученного путем растворения антибиотика в воде охлажденной до 0 оС. Взвесь инкубировали 20 минут при температуре +4 оС, затем добавляли 1/9 объема натрия хлорида 9% для восстановления целостности цитоплазматической мембраны и инкубировали 30 минут при 37 оС, после чего эритроцитарные носители дважды отмывали раствором натрия хлорида изотоническим, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 10 минут.
Перед тем как определить количество антибиотика включенного в ЭН подбирали оптимальный осадитель белка. Для этого готовили модельные смеси - гемолизат эритроцитов+осадитель белка и центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут. В качестве осадителей белка нами были использованы трихлоруксусная кислота 10, 20 и 30% и хлорная кислота 5,10 и 15% в различных соотношениях. Установлено, что наиболее полное осаждение белка обеспечивает кислота трихлоруксусная 30% в соотношении 1:1.
Для определения количества инкапсулированного антибиотика проводили гемолиз эритроцитарных носителей путем замораживания. К полученному гемолизату добавляли 0,5 мл 30% кислоты трихлоруксусной и центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин.
Согласно фармакопейной статье биологическую активность рифампицина определяют методом диффузии в агар с использованием соответствующей тест-культуры, который отличается большой трудоемкостью, длительностью и неспецифичностью. Поэтому, для
12 № 8(12), Vol.2, August 2016
WORLD SCIENCE
количественного определения антибиотика включенного в эритроцитарные носители нами была разработана спектрофотометрическая методика. Выделение рифампицина проводили при помощи микроколоночного варианта гель-хроматографии с использованием Сефадекса G-10. Для спектрофотометрического определения в качестве аналитической была выбрана длина волны 334 нм. Время проведения анализа составляет 20 минут. Относительная ошибка определения не превышает ±2,5%.
Изучено влияние на степень включения рифампицина в ЭН таких факторов, как концентрация раствора антибиотика и время инкубации в нем. Установлено, что степень включения рифампицина в ЭН не зависит от времени инкубации, а увеличение концентрации раствора антибиотика от 0,1 до 2,5 мг/мл существенно повышает процент его включения в ЭН. Для изучения стабильности ЭН без и с включенным антибиотиком инкубировали в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре (4±2)оС. Показано, что свободные ЭН сохраняют способность включать антибиотики в течение 9 дней, а ЭН с антибиотиком стабильны в течение 48 часов.
В дальнейших исследованиях изучено влияние свободного и иммобилизованного антибиотика на развитие ГИО, интенсивность окислительных процессов, процессов цитолиза и холестаза у инфицированных стафилококком животных.
Установлено, что введение инфицированным животным рифампицина в дозах 10 и 20 мг/кг дозозависимо усиливало иммуносупрессию, вызванную введением стафилококка.
Показано, что инфицирование стафилококком вызывало увеличение концентрации ДК и МДА, в то же время активность СОД и ГР была снижена по сравнению с интактными крысами. Введение антибиотика дозозависимо усиливало вызванное инфицированием снижение активности ферментов АОС и повышение уровня ДК и МДА. При введении рифампицина в высоких дозах возрастает риск проявления их гепатотоксического действия. Установлено, что пятикратные инъекции рифампицина на фоне инфицирования стафилококком усиливали процессы цитолиза и холестаза. Активность АсТ возрастала в 4,0 раза, АлТ - в 4,9 раза, ЩФ - 4,7 раза, уровень ОБ - в 2,8 раза по сравнению с интактными животными.
Широкие перспективы открылись перед фармакотерапией с использованием технологии иммобилизации лекарственных препаратов. Установлено, что введение РВЭН инфицированным животным нормализовало иммунный ответ на ЭБ. Введение ЭН с включенным рифампицином инфицированным крысам нормализовало показатели ПОЛ, активность ферментов АОС, процессы цитолиза и холестаза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Генинг, Т.П. Использование форменных элементов крови для направленной доставки химиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения / Т.П. Генинг, И.И. Колкер, Ж.Ш. Жумадилов // Антибиотики и химиотерапия. - 1988. - Т.33, №11 - С. 867-870.
2. Макаренко, Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатаонредуктазы в эритроцитах больных с хроническими заболеваниями печени / Е.В. Макаренко // Лабораторное дело. - 1988. - №11. - С.48-50.
3. Мальберг, К. Метод локального гемолиза / К. Мальберг, Э. Зигль // Иммунологические методы: пер. с англ. - М.: Медицина, 1987. - С.262-267.
4. Николаев А.Я. Биологическая химия: Учебное пособие для мед. спец. вузов. -М.: Высшая школа,1989.-495с.
5. Стальная, И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича.-М.: Медицина, 1977. - С. 63-64.
6. Стальная, И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М. Медицина, 1977. - С. 66-68.
