CC BY
46
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЧЕ ТАЙНОГО
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОЗОНО И БАКТЕРИОФАГОТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЕНИТАЛИЙ Г.О. Гречканев1, Т.М. Мотовилова1. Л.Г. Горшунова2, ИВ. Пономарева3, И.Н. Никишов4, Э.М И\ тинский , Т.А. Бойчеико , А.В. Тюнина , И.В. Зеленская8
7
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, Нижний Новгород ФГУП «НПО «Микроген» МЗ России, Нижний Новгород J ООО «Клинг ixa совр ел ¡енных т ехн ологи и « Сад ко », Hi 1жн г i и Но егород 4Мед ицинский институт БФУ им. И. Каи та, Кап иттград 5ГБОУ ВПО Кировская ГМА МЗ РФ, г. Киров йООО Медицинский центр «ДА ВИНЧИ», Ростое-на Дону
ООО Мед Центр Здоровья, Сходня, Московской обл.
Перинатальный центр ГБУЗ Детская краевая больница министерства здравоохранения Краснодарского края, Краснодар
Abstract
Article presents data about traditional and alternative approach are provided to treatment of infectious processes, the experimental assessment of advisability of application of bacteriophages and ozone is given at treatment of a genital inflammatory diseases.
Key words: inflammatory diseases, bacteriophages, о zo no therapy.
В статье представлены сведения о традиционном и альтернативном подходе к лечению инфекционных процессов, дана экспериментальная оценка целесообразности и перспектив совместного применения бактериофагов и медицинского озона при лечении воспалительных заболеваний гениталий.
Ключевые слова: воспалительные заболевания, бактериофаги, озонотерапия
Лечение воспалительных заболеваний гениталий у женщин является одной из наиболее насущных проблем практической медицины, поскольку с одной стороны распространенность этой патологии не имеет тенденции к снижению, а с
другой — комплексная терапия далеко не всегда достигает поставленных целей. Результатом является хронизация воспаления, формирование анатомических нарушений тазовых органов, их функциональная несостоятельность, ведущие к развитию расстройств менструального цикла, бесплодия, формированию синдрома тазовых болей, резкому снижению качества жизни в целом [3,7]. В настоящее время очевиден приоритет антибиотиков в лечении воспалительных процессов любых локализаций. При этом количество потребляемых антибактериальных химиопрепаратов, особенно, широкого спектра действия, постоянно увеличивается, однако необходимо признать, что принципиально это ситуацию не улучшает, напротив, вызывает формирование антибнотикорезистентности [1. 11. 13], сопровождается целым рядом побочных эффектов [9] и приводит к удорожанию лечения. В связи с этим задача повышения эффективности терапии воспалительных процессов женской половой сферы путем использования альтернативных методов лечения, находится на острие внимания клиницистов [4. 5]. Уже не одно десятилетие в России и за рубежом исследуются возможности терапевтического применения медицинского озона, в т.ч. в лечении воспалительных заболеваний, а также ведутся разработки по применению в этой области препаратов бактериофагов [7]. С нашей точки зрения, совместное использование озонотерапии и б актерно фаготерапии в комплексном лечении воспалительных процессов гениталий представляется весьма целесообразным и теор етически перспективным.
Цель исследования. Целью исследования явилась доклиническая оценка в условиях in vitro возможности совместного применения медицинского озона и бактериофагов, а также предварительное обоснование методики использования данных лечебных факторов в терапии инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых органов.
Материалы и методы исследования.
1. Препарат «Пиобактериофаг комплексный жидкий» производства цеха бактериофагов Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов «ИмБио» филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России
2. Озонатор «Medozons ВМ» производства г. Арзамас Нижегородской области
3. Лабораторное оборудование цеха бактериофагов «Имбио».
Использованный в нашем опыте пиобактернофаг представляет собой смесь стерильных фильтратов фаголизатов различных микроорганизмов. В эксперименте были использованы производственные штаммы микроорганизмов Escherichia coli. Enterococcus и Klebsiella цеха бактериофагов, использующиеся в контроле серийных препаратов.
В стерильном флаконе с соблюдением правил асептики смешивали пио бактериофаг и свежеприготовленный озонированный физиологический раствор в соотношении 1:1. Для этого последовательно применяли следующие насыщающие концентрации о зо но -кислородной смеси - 1500. 3000. 5000, 8000 и 10000 (мкг/л).
Определение активности смеси проводилось титрованием по методу Аппельмана - немедленно после смешивания, через 30 минут и через 1 час.
Степенью бактерицидной активности или «титром» бактериофага является то наибольшее разведение препарата, в котором среда становится прозрачной, т. е. рост культуры не наблюдается и произошел полный лизис микроорганизмов фаговыми частицами.
Готовили ряд последовательных десятикратных разведений серии препарата пнобактериофага и смеси «пиобактериофаг (той же серии) + физраствор» в питательной среде (бульон мясо-гидролизный) с обязательной сменой пипеток.
В первую пробирку с 4.5 мл питательной среды вносили градуированной пипеткой 0.5 мл препарата (или смеси) - разведение в 10 раз, то есть в 10"\ затем из первой пробирки переносили 0.5 мл содержимого во вторую пробирку, из второй - в третью и т.д.. то есть разведения 10 ". 10"' и т. д. Для контроля использовали пробирку с 4.5 мл питательной среды без фага. Для определения активности в отношении Enterococcus и Escherichia coli готовили разведения 10"* -10" . в отношении Klebsiella - 10"1 - 10'- .
Затем в каждую из пробирок с разведением и в контрольную вносили 0.03 мл взвеси суточной агаровой культуры, содержащей 109 микробных клеток в 1 мл. Инкубировали при температуре (37=Ы)°С.
Степень активности пиобактернофага и смеси его с озонированным физраствором определяли визуально по истечении времени инкубации: для клебсиелл и эшерихий - 4 часа, для энтерококков - 10 часов.
Обработку данных проводили в программе Microsoft Excel, для каждого ряда рассчитывали среднее арифметическое М. стандартную ошибку среднего арифметического - т. Достоверность различий в сравниваемых рядах проверяли с использованием критерия Стьюдента и принимали при 5% уровне значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
Для достижения обозначенной цели исследования нами были подобраны штаммы микроорганизмов, этиологически значимые в плане развития воспалительных заболеваний гениталий, а также изучено влияние озонированного физраствора, полученного при различных насыщающих концентрациях медицинского озона, на лизнрующие свойства бактериофагов. Тем самым воспроизводилась планируемая к практическому применению методика лечения -сочетанное или последовательное орошение различных отделов полового тракта озонированным физраствором и препаратами бактериофагов.
Планируя данный эксперимент, мы предполагали несколько возможных вариантов взаимодействия данных лечебных факторов:
• дозозависимое подавление литической активности бактериофагов озонированным раствором in vitro, которое обосновывало бы раздельное (комбинированное) использование указанных методов.
• нейтральное или стимулирующее действие озона на фаги, что позволило бы применять их одновременно (сочетанно).
В таблицах 1 и 2 представлены результаты тестирования литической активности фаговых частиц как в контроле, так и в ответ на воздействие озонированного физиологического раствора с различными насыщающими концентрациями озона.
Таблица 1. Активность фаговых частиц Пиобактериофага в эксперименте
Микроорганизм Активность Активность смеси «пиобактериофаг
пиобакте- -озонированный физраствор» с насыщающей
риофага концентрацией 5000-8000 мкг/л
Сразу после Через 30 мин Через 1 час
смешивания после смешивания после смешивания
Euter о coccus 1x10"° 1x10"° 1x10 0 1x10"0
Klebsiella oxytoca 1x10"' 1x10° 1x10"' 1x10°
Klebsiella pneumonia lxl0_i 1х10"5 1x10"5 1x10"5
E. coli О 26 1x10"° 1x10"° 1x10 0 1x10"°
E. coli О зз 1x10"° 1x10"° 1x10"° 1x10"°
E. COli О 124 1x10"' 1x10° 1x10 ' 1x10°
Таблица 2. Активность фаговых частиц Пиобактериофага в эксперименте
(продолжение)
Микроорганизм Активность Активность смеси «пиобактериофаг
пиобакте- -озонированный физраствор» с насыщающей
риофага концентрацией 10000 мкг/л
Сразу после Через 30 мин Через 1 час
смешивания после смешивания после смешивания
Entero coccus 1x10"° 1x10"° 1x10 0 1x10"°
Klebsiella oxytoca 1x10"3 1x10° 1x10"' 1x10°
Klebsiella pneumonia 1x10"' 1x10"5 1x10"5 1x10"5
E. coli О 26 1x10"° 1x10"° 1x10 0 1x10°
E. coli О зз 1x10"° 1x10"° 1x10° 1x10"°
E. Coli О 124 1x10"' 1x10° 1x10"' 1x10°
По данным тестирования контрольных образцов, препарат вызвал лизис энтерококков в разведении 10~б. кишечных палочек в разведении 10° - 10 Л клебсиелл - в разведении 10°.
Препарат той же серии после смешивания и контакта с озонированным физраствором с концентрациями озона 1500. 3000. 5000 и 8000 мкг/л не показал снижения активности ни в одном из образцов - непосредственно после смешивания, через 30 минут и через 1 час (р>0.05).
Как следует из таблицы 2. при воздействии озонированного физраствора, полученного с использованием концентрации озона 10000 мкг/л озонокисдородной смеси, была отмечена тенденция к снижению литнческой активности фаговых частиц на один порядок от первоначального титра (с 10"6 до 1 (У3 ) в отношении штамма Е. coli О 26-
Согласно современным требованиям, пи о бактериофаг должен лидировать бактерии в разведении не менее 10° для Staphylococcus, Enterococcus. Streptococcus. E.coli. Proteus и не менее 10"4 для P.aeruginosa. Klebsiella. Следовательно, имевшее место незначительное уменьшение литнческой активности фагов в ответ на воздействие максимальной насыщающей концентрации озона не является препятствием для их совместного использования.
Как известно, бактериофаги представляют собой вирусные частицы, активные против гомологичных видов бактерий. Препараты на основе вирулентных бактериофагов — это стерильные фильтраты бактериальных фаголизатов. которые назначают для применения внутрь и местно для орошения ран. слизистых, введения в полости. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловлено их бактерицидной активностью, а также иммуномодулирующим антигенными свойствами находящихся в фаголизатах компонентов разрушенных микробных клеток.
Бактериофаговая терапия обладает рядом важных свойств [б], она эффективна против лекарственно-устойчивых микроорганизмов и может использоваться в качестве альтернативной терапии пациентов, имеющих аллергию к антибиотикам [8. 9]. Кроме этого, бактериофаги обладают высокой специфичностью по отношению к таргетным бактериям и не оказывают влияния на другие микробы [4], что важно для поддержания баланса микроэкосистемы полового тракта [7] и организма в целом [9].
Известны свойства медицинского озона как антисептика, активного в отношении бактерий, вирусов, грибов и простейших. Кроме того, о зон от ер а пия эффективна при гипокснческих и иммунодефнцнтных состояниях, воспалительных процессах, нарушениях периферического кровообращения. Разработано множество путей введения озона в организм человека с лечебной целью: парентеральные - внутривенный, внутри артериальный, эн до лимфатический. внутримышечный, подкожный, внутрисуставный; локальные - интра на зальный, интравагинальныи, накожный, колоректальнын и т. д.
Есть данные и о клинической эффективности совместного использования озона и бактериофагов [8. 10]. однако широкое внедрение комбинации этих технологий требовало проведения эксперимента in vitro для выявления особенностей их взаимовлияния.
В ходе эксперимента нами не было выявлено снижения лизирующей способности фагов в отношении соответствующих культур после добавления к ним озонированного физраствора, приготовленного при использовании насыщающей концентрации вплоть до 10.000 мкг/л озона, а имевшее место ее снижение на 1 порядок по одному из штаммов Е. coli О^ не было критичным.
Рядом исследовании показано, что при воздействии озона на микроорганизмы происходят сдвиги в количественном соотношении фосфолипидов и полиненасыщенных жирных кислот в их мембранах с полной дезорганизацией оболочки. Это приводит к гибели микробов, невозможности размножаться и адсорбироваться на клетках макроорганизма. Озон способен подавлять различные виды бактерий, вирусов, грибов и простейших в зависимости от его от концентрации, а также качественного состава и количества микробов.
Тем не менее, установлено, что сложно организованные инкапсулированные вирусы (например, группа герпес-вирусов) и Грам(-) бактерии наиболее чувствительны к действию озона, что обусловлено высоким содержанием лнпндов в мембране оболочки, легко взаимодействующих с ним.
Что же касается бактериофагов, то. несмотря на свою чрезвычайную вариабельность, в целом они являются достаточно простыми по строению вирусными частицами [2]. В составе капсидов бактериофагов содержится очень незначительное количество лнпндных структур, что может определять их низкую взаимосвязь с озоном в диапазоне общепринятых терапетических концентраций.
Предполагаем, что отсутствие значимого влияния озонированного физраствора на функциональные свойства фагов обусловлено их вирусной природой, поскольку лишенные липид содержащей оболочки фаги не представляют собой мишень для озона, что позволяет планировать совместное применение озонотерапни и фагов без угрозы снижения активности последних. Использование более высоких насыщающих концентраций озона в сочетании с бактериофагами потребует проведения дополнительной серии экспериментов, однако, исходя из потребностей рутинной гинекологической практики, это вряд ли целесообразно [12].
Заключение
Сочетанное применение бактериофаго- и озонотерапни при условии использования насыщающей концентрации озона до 10000 мгк/л включительно возможно и перспективно для лечения нифекционно-воспалительных процессов женской половой сферы.
Список литературы
1. Алеев И.А. Бактерии, резистентные к антибиотикам, как реальная угроза человечеству // Status Piaеsent. Гинекология, акушерство, бесплодный брак. 2012. № 2[8]. С.13-15.
2. Бактериофаги: биология и практическое применение / под ред. Э. Каттер, А. Судаквелидзе. М.: Научный мир. 2012. 640 с.
3. Боголепова Н.Ю.. Андреева М.В., Андреев В.А. Современные подходы к терапии воспалительных заболеваний матки // Матер. V Всероссийского конгресса «Амбулаторно -поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья». 12-15 марта 2013г. - М.. 2013. - С. 137-138.
4. Дарбеева О.С.. Майская Л.М.. Парфенюк Р.Л., Дурманова З.В. Пути совершенствования лечебно-профилактических бактериофагов // Биопрепараты. 2010. №3. С.53
5. Качалина Т.С., Гречканев Т.О. Озоновые технологии в акушерстве и гинекологии. Н.Новгород: Ызд-во НГМА. 2007. 292с.
6. Красильннков И.В.. Лыско К.А.. Отрашевская Е.В.. Лобастова А.К. Препараты бактериофагов: краткий обзор современного состояния и перспектив развития // Сибирский медицинский журнал (Томск). 2011. №2. С. 33-37,
7. Мотовилова Т.М.. Качалина Т.С.. Аникина Т.А. Оценка роли бактериофагов в этнотропной терапии инфекционно-воспалительных процессов на примере лечения хронического неспецифического эндометрита. Взгляд клинициста // Трудный пациент. 2013. №8-9. С. 20-26.
8. Ннкншов Н.Н.. Чандра-Д'Мелло Р.. Гречканев Г.О. Сочетание озоно- и бактериофаготерапии в комплексном лечении хронических воспалительных заболеваний придатков матки // Российский вестник акушера-гинеколога. 2008. Т. 8. №4. С. 66-70.
9. Урсова Н И. Антибиотик-ассоциированная диарея: выбор пробнотика с позиций медицины, основанной на доказательствах // Трудный пациент. 2013. № 2-3. С.22-30.
10. Chandra-D'Mello R.. Grechkanev G.. Nikishov N.. Fataliyeva G. Combined ozone & bacteriophage therapy as a component of a multi-pronged treatment of chronic inflammatory diseases of the female internal genitalia // Int. J. Gynecol. Obstet. 2009. Vol. 107. P, 139.
11. Marlies E.J.. Hulsher L.. Richard P. et al. Antibiotic prescribing in hospitals: a social and behavioural scientific approach // The Lancet Infectious Diseases. 2010. Vol. 1 (4). P.237-247.
12. Nikishov N.. Grechkanev G.. Motovilova T. et al Prospects for combined treatment of chronic 11011 specific endometritis with ozone and Bacteriophage therapy // Book of abstracts of 22nd World Congress & Exhibition. 28 June - 3 July 201?. Barcelona. Spain. P.36.
13. Tacconelli E. Antimicrobial use: risk driver of multidrug resistant microorganisms in healthcare settings // Cuit Opin Infect Dis. 2009. Vol. 22. P. 352358.
