CC BY
9
гиена и санитария 5/2009
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2009 УДК 614.777
3. И. Жолдакова', О. О. Синицына2, А. Т. Лебедев3, Н. В. Харчевникова4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ФОТОТРАНСФОРМАЦИИ ПРОФЛАВИН АЦЕТАТА
'Вед. науч. сотр. НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва; доктор мед наук, проф.; руководитель лаборатории НИИ ЭЧ и ГОС им. А. Н. Сысина РАМН, доктор мед. наук; 'доктор хим. наук, проф. кафедры органической химии химического факультета Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова; 4ст. науч. сотр. НИИ ЭЧ и ГОС им. А. Н. Сысина РАМН, канд. хим. наук. (т. 499-246 71-73)
Методом масс-спектрометрической высокоэффективной жидкостной хроматографии изучили динамику процессов фототрансформации профлавин ацетата при действии излучения видимого диапазона. Профлавин ацетат предложен в качестве фотосенсибилизатора при фотодинамическом обеззараживании воды. Идентифицированы продукты фототрансформации красителя при различном времени облучения. С использованием соотношений структура—активность и информации из баз данных по токсичности веществ дана оценка опасности идентифицированных продуктов и выделены наиболее опасные. Ключевые слова: фототрансформация, профлавин ацетат, опасность продуктов трансформации
Z. I. Zholdakova, О. О. Sinitsyna, А. T. Lebedev, N. V. Kharchevnikova . - EXPERIMENTAL STUDY OF PROFLAVINE ACETATE PHOTOTRANSFORMATION PROCESSES
Changes in proflavine acetate phototransformation processes upon exposure to visible-range irradiation were studied by high performance liquid chromatography. Proflavine acetate was offered as a photosensitizer during photodynamic water disinfection. Dye transformation products upon time-varying exposure to irradiation were identified. By using structure-activity relationships and information from toxicity databases, the authors evaluated the hazard of the identified products and identified the most hazardous ones.
Key words: phototransformation, proflavine acetate, hazard of transformation products.
Одним из существенных физических факторов воздействия на воду водных объектов является инсоляция. Считается, что под влиянием естественного облучения и биоокисления, которое в классической гигиене принято называть самоочищением водных объектов, многие вещества трансформируются до безопасных соединений. Снижение концентрации исходного вещества при трансформации оценивали как уменьшение токсичности и опасности. На этом была построена классификация опасности веществ по их стабильности [6]. Затем было установлено, что в процессе самоочищения могут образовываться более опасные вещества, и была разработана классификация опасности по стабильности с учетом токсичности образующихся продуктов [7]. Однако изучению процессов трансформации веществ в воде под влиянием инсоляции и сравнительной оценке опасности продуктов фототрансформации посвящены лишь единичные работы. Так, было установлено [3], что в модельном водоеме на свету пирокатехин может превращаться в более токсичное соединение гидрохинон. Другие одно- и двухосновные фенолы превращаются на свету в соединения, придающие воде окраску.
В течение ряда лет изучается возможность применения облучения видимым светом для обеззараживания воды на основе фотодинамического эффекта. Этот физико-химический метод обеззараживания, альтернативный хлорированию, состоит в облучении видимым светом воды, в которую вносят специальное вещество-сенсибилизатор. Обеззараживание является результатом физико-химических реакций, протекающих в растворе.
Процесс фотосенсибилизации заключается в том, что молекулы, не поглощающие свет в интервале длин волн, соответствующем видимой области, подвергаются фототрансформации в присутствии других молекул, поглощающих это излучение
[1,4, 12]. Сенсибилизаторами в различных фотохимических реакциях, в частности в процессах фотоокисления различных веществ, могут выступать красители. Легкость перехода этих соединений в так называемое возбужденное состояние обусловлена относительно низкой энергией, необходимой для данного процесса.
Взаимодействие молекул сенсибилизатора в возбужденном состоянии с молекулярным кислородом, постоянное введение которого является обязательным условием данного метода, может приводить к образованию активных форм кислорода: синглетного кислорода, супероксид-анион-радикала и гидроксильного радикала. Кроме того, возбужденный сенсибилизатор может как восстанавливаться, так и окисляться, в результате чего образуются полуокисленные и полувосстановленные радикалы сенсибилизатора и субстратов.
При обеззараживании фотодинамическим методом после внесения сенсибилизатора в воду, обсемененную микроорганизмами, проводят инкубацию (обычно 0,5—1 ч) в течение которой краситель проникает внутрь микробной клетки. Раствор подвергают облучению видимым светом от искусственного источника либо солнечным светом. Активные формы кислорода и органические свободные радикалы очень реакционноспособны и могут вступать во взаимодействие с биомолекулами, что приводит к окислительной деструкции и гибели микробной клетки.
Одним из сенсибилизаторов, предложенных в качестве реагента для фотодинамического обеззараживания воды, является профлавин ацетат (ПА):
Пороговые дозы ПА (в мг/кг) и продуктов его фототраксформа-цни при разной степени фотодеструкции
Критерии
Степень деструкции, %
25
100
Биохимические, физиологические 0,002 0,0005 0,01
Морфологические 0,01 0,002 0,01
Цитотоксические 0,05 Эффект не выявлен Цитогенетические Эффект не выявлен
Этот краситель относится к фотосенсибилизаторам, активность которых определяется фототрансформацией самой молекулы красителя [5]. При этом могут образовываться продукты более опасные, чем исходный фотосенсибилизатор. В связи с этим ранее [10] нами были проведены исследования токсичности ПА и продуктов его трансформации.
Динамику деструкции красителей изучали по изменению их электронных спектров поглощения в зависимости от длительности облучения растворов. Анализ кривых распада позволил определить оптимальное время облучения растворов красителей для последующих токсикологических исследований. Время облучения раствора ПА при исходной концентрации 1 мг/л, необходимое для 25% деструкции составляет 8 мин, для близкой к 100% деструкции красителя — 1 ч. Токсичность ПА и продуктов его 25% и 100% деструкции изучили в острых, подострых и хронических экспериментах на крысах при энтеральном поступлении. Изучили мутагенное действие в полиорганном микроядерном тесте на полихроматофильных эритроцитах костного мозга и эпителиальных клетках толстой кишки и мочевого пузыря крыс, цитотоксическое действие по комплексу показателей в клетках толстой кишки и мочевого пузыря, местное раздражающее, кожно-резорбтивное, сенсибилизирующее и иммунотоксическое действия. Пороговые дозы ПА и продуктов его фотодеструкции, установленные по комплексу физиологических, биохимических, структурно-функциональных, цитотокси-ческих и цитогенетических показателей, представлены в таблице.
Результаты свидетельствуют, что при облучении, приводящем к 25% деструкции, токсичность раствора повышается. Более длительное облучение сенсибилизатора, приводящее к его полной деструкции, очевидно, способствует разрушению опасных продуктов трансформации ПА.
Целью данной работы является идентификация продуктов фототрансформации, образующихся при различном времени воздействия облучения, оценка их опасности и выделение наиболее опасных продуктов.
Анализ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обра-щеннофазовом варианте на приборе фирмы "Agilent 1100" с масс-спектрометрическим детектором MSD SL (колонка Agilent ZORBAX 300SB-C3, 2,1 х 12,5 мм, 5 (цгп) с использованием градиентного элюирования. Для регистрации использовали масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (электроспрей) в режиме положительно за-
ряженных ионов. Изучили фототрансформацию водных растворов ПА с концентрацией 5, 10 и 20 мг/л при облучении видимым светом в течение 1— 5 ч, а также фототрансформацию ПА с концентрацией 5 мг/л при малых временах облучения 5, 15 и 30 мин. При оценке токсичности идентифицированных продуктов фототрансформации использовали информация из баз данных TOXNET [17] и CPDB [13], а также соотношения структура—биологическая активность. Квантовохимические расчеты электронных параметров проводили с помощью программы МОРАС 6.0, коэффициентов распределения октанол/вода — программы Molinspiration [15].
Установили, что в результате облучения концентрация ПА снижалась по мере увеличения длительности воздействия. Полная трансформация вещества при исходной концентрации 5 мг/л происходила через 60 мин, при исходной концентрации 10 мг/л — через 3 ч, 20 мг/л — через 5 ч. При этом в растворах после облучения образовывался осадок коричневого цвета, количество которого увеличивалось с увеличением времени облучения и исходной концентрации ПА и коррелировало с уменьшением концентрации красителя. Масс-спектры указанных осадков не содержали пиков высокой интенсивности с массами до 2000 мн. Остаточный раствор при анализе методом ВЭЖХ дал лцшь небольшие пики ионов с соотношением масса/заряд (vh/z) 284, 301, 330, 351. При анализе растворов с исходной концентрацией 20, 10, 5 мг/л ПА после 5 ч облучения наблюдали пики ионов с m/z 129, 235, 341, 447, 553, 659, 762, масс-спектры которых (метод тандемной масс-спектрометрии — МС/МС) свидетельствуют об однородной природе указанных фрагментов (основной фрагментный ион в спектрах имеет m/z 129). Сходную последовательность меньшей интенсивности наблюдали для фрагментного иона 169 (169, 275, 381 и так далее). Так, если через 1 ч интенсивность пиков наиболее легких из указанных веществ увеличивалась, то далее их концентрация оказывалась почти постоянной. Можно предположить, что при облучении происходит окисление с образованием продуктов гидроксилирования, легко подвергающихся диме-ризации, таких как, например, гидроксилирован-ные производные профлавина. Такой механизм окисления характерен для различных полианилинов и полифенолов [8]. Образование димеров и полимеров возможно как через образование С—С связей, так и по амино- и гидроксигруппе через образование N—С и О—С связей. Подобные, как правило, нерастворимые в воде полимеры, сами могут подвергаться окислению растворенным кислородом с образованием сшитых продуктов. Ионы с инкрементом 106 усл. ед. могут представлять собой растворимые продукты полимеризации амино-фенолов, образование которых возможно в результате деструкции полимеров. В этом случае речь должна идти о повторяющемся фрагменте.
а
N =
;ена и санитария 5/2009
Например, ион с m/z = 235 может иметь вид:
Ионы с массой 129 и 169 могут являться продуктами глубокой деструкции указанных полимеров. Например:
"NH
NH Na m/2=129l
Для иона с m/z = 172 можно написать следующую формулу:
(X /ОН
ОСг:
N Н
Таким образом, идентифицировали с определенной степенью достоверности, в частности, следующие продукты глубокой фототрансформации: орто-бензохинона диимин (m/z = 129), 2-гидро-кси-1,4-бензодиазин (m/z =169) и 2-гидрокси-1,4-бензоксазин (m/z = 172).
После 3—5 ч облучения основу продуктов составляют олигомерные соединения, которые трудно контролировать методами масс-спектрометрии.
При изучении фототрансформации водных растворов ПА с концентрацией 5 мг/л при облучении видимым светом в течение 5, 15, 30 и 60 мин выявили нестабильность и высокую реакционную способность соединений, образующихся на начальных стадиях трансформации ПА. Среди продуктов идентифицировали соединение 7-аминохи-нолин-3-карбоновой кислоты.
СООН
Количество этого соединения нарастает к 30-й минуте облучения. В пробах, полученных после 60 мин облучения, содержание этого соединения уменьшается в 8 раз, а в пробах, полученных после облучения в течение 2 ч, оно не регистрируется вовсе.
К 60-й минуте в спектре продуктов доминирует соединение, идентифицированное нами как эндо-пероксид:
СН,СОО~
Ранее эндопероксид был идентифицирован [5] в результате анализа электронных спектров поглощения при облучении раствора ПА с концентрацией 2,69 мг/л, близкой к концентрации раствора, который мы анализировали методом ВЭЖХ-МС (5 мг/л). Следует отметить, что эндопероксид очень реакцион-носпособен и при более длительном облучении подвергается дальнейшей трансформации. Как и 7-ами-нохинолин-3-карбоновая кислота, этот продукт фототрансформации не детектировался в пробах, полученных через 2 ч облучения.
Сведения о токсичности идентифицированных продуктов в литературе отсутствуют. Поэтому для сравнительной оценки токсичности продуктов трансформации ПА и выделения наиболее опасных мы использовали литературные данные о токсичности близких по структуре соединений.
1. Эндопероксид. Как известно [8, 9], перекис-ные соединения, в частности эндопероксиды, являются высоко реакционно-способными веществами. Некоторые перекисные соединения обладают мутагенными и канцерогенными свойствами. Механизм токсического действия связывают с окисляющей способностью перекисных соединений, способностью вызывать образование радикалов и окислять ряд ферментов, содержащих тиоло-вую группу. Под действием образовавшихся радикалов может происходить перекисное окисление липидов, входящих в структуру клеточных мембран, которое приводит к нарушению протонного градиента и выходу в цитоплазму гидролитических ферментов [2].
2. орто-Бензохинон диимин. В литературе имеются данные [16], что при биотрансформации канцерогенного соединения орто-метоксианилина под действием пероксидаз, ферментов, катализирующих реакции окисления по радикальному типу, сходные с реакциями фотомодификации, образуются метаболиты того же типа, что и при фототрансформации ПА. Так, образуется димер с азо-связью, а также диимин, который, гидролизуясь, переходит в хинонимин и метаболит, содержащий 3 метоксибензольных кольца. Установлено, что канцерогенность о-метоксианилина связана с образованием аддуктов диимина с гуанином, одним из оснований, входящих в состав ДНК. Кроме того, известно, что иминовая группировка связывается с тиоловыми фуппами, входящими в состав ферментов и глутатиона [17].
3. 2-Гидрокси-1,4-бензодиазин (2-гидрокси-хиноксалин) и 2-гидрокси-1,4-бензоксазин. Близким по структуре соединением является хи-ноксалин. Хиноксалин обладает мутагенной активностью в тесте Эймса на Б. ТурЫтигшт только на штамме ТА98 при условии метаболической активации [17]. Известно, что мутации на этом штамме вызываются интеркаляцией между основаниями ДНК. 2-Гидроксихиноксалин может превратиться в высоко реакционно-способное соединение ряда оксазиридина:
аз.
вероятно способное связываться с ДНК и белками.
4. 7-аминохинолин-З-карбоновая кислота. Соединение является амино-производным хинолина. Хинолин вызывает рак печени у крыс и мышей, обладает мутагенной активностью в тесте Эймса с метаболической активацией микросомами печени крыс, а также в микроядерном тесте, вызывает индукцию хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в гепатоциах крыс [17]. Анализ адцуктов хинолина с ДНК микросом печени крыс свидетельствует, что конечным метаболитом является 3—гидроксихинолин либо 2,3- или 3,4-эпоксихинолины [1]. Положение 3 в молекуле 7-аминохинолин-3-карбоновой кислоты замещено карбоксильной группой, что очевидно снижает вероятность биоактивации соединения по типу хинолина. Многие гетероциклические амины, к которым относится 7-аминохинолин-З-карбоновая кислота, обладают мутагенной активностью. В работе [14] получены регрессионные уравнения для прогноза мутагенной активности гетероциклических ароматических аминов в тесте Эймса на штамме ТА100 Б. ТурЫшипиш с метаболической активацией:
1Б ТА100 (ревертант/ммоль) = 0,92Р + 1,17 Е„омо -1.18Е1имо + 7,35
г = 0,877 и = 67 в = 0,708,
где 1§ТА100 — логарифм величины мутагенной активности в тесте Эймса; ^ Р — логарифм коэффициента распределения октанол/вода; Еномо и Ешмо — энергии высшей заполненной и нижней свободной молекулярных орбиталей. Параметр 1£ Р для 7-аминохинолин-3-карбоновой кислоты имеет значение 0,57, значения Еномо и Ешмо составляют —8,85 и -1,095 эВ соответственно. Рассчитанное по приведенному уравнению значение ТА100 составляет — 1,19, что свидетельствует о практическом отсутствии мутагенной активности у соединения. Так, значение ^ ТА100 для очень слабого мутагена 1-аминонафталина составляет —1,01, для сильного мутагена 2-аминонафталина -0,39. Вывод об отсутствии мутагенной активности у 7-ами-нохинолин-3-карбоновой кислоты подтверждается проведенными нами расчетами относительной устойчивости двух последовательных интермедиатов на пути N-окисления ароматических аминов: гид-роксиламина и нитрениевого иона. Чем меньше разность теплот образования этих метаболитов, тем легче образуется нитрениевый ион, способный связываться с ДНК, и тем более мутагенным будет соединение [11]. Для 7-аминохинолин-З-карбоно-вой кислоты разность теплот образования этих метаболитов составляет 234 ккал/моль, тогда как для мутагенного и канцерогенного соединения орто-аминотолуола эта разность составляет 225,5 ккал/ моль, а для не проявляющих мутагенную и канцерогенную активность орто-, мета- и пара-амино-
бензотрифторидов — 240,5, 241,2 и 244,7 ккал/моль соответственно. Следовательно, согласно прогнозу, 7-аминохинолин-З-карбоновая кислота не должна обладать мутагенным эффектом.
Таким образом, согласно прогнозу, наиболее опасными продуктами фототрансформации ПА являются эндопероксид, 1,2-бензохинона диимин и 2-гидрокси-1,4-бензодиазин. Ни для одного из этих веществ не обоснована ПДК в воде, поэтому необходимо провести токсикологические исследования для выявления наиболее опасного из них. Для обеспечения безопасности обеззараживания необходимо также провести дополнительные исследования в полупроизводственных условиях с определением корреляции между содержанием показателя для контроля, исходного ПА и продуктов его фототрансформации.
Работа выполнена при финансовой поддержке правительства Москвы.
Литература
1. Введение в фотохимию органических соединений / Под ред. Г. О. Бейкера. - Л., 1976.
2. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсического действия. — Л., 1986.
3. Костовецкий Я. И., Жолдакова 3. И. // Сб. Гигиена населенных мест. — Киев, 1969. — Т. 8. — С. 75—80.
4. Кузнецова H А., Калия О. Л. // Рос. хим. журн. —
1998. - № 5. - С. 36-49.
5. Макаров Д. А., Кузнецова Н. А., Калия О. Л. „ Журн. физ. химии. - 2006. - Т. 80, № 2. — С. 336-343.
6. Методические указания к экспериментальному изучению процессов трансформации химических веществ при их гигиеническом регламентировании в воде. - М., 1984.
7. Методические указания "Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования". МУ 2.1.5.720—98. — М.,
1999.
8. Роберте Дж., Кассерио М. Основы органической химии. - M., 1968. - Т. 1, 2.
9. Рубин А. Б. Биофизика. Т. 2.: Биофизика клеточных процессов. — М., 2004.
10. Синицына О. О., Жолдакова 3. И., Полякова Е. Е. и др. // Гиг. и сан. — 2007. — № 5. — С. 57-60.
11. Харчевникова Н. В., Жолдакова 3. И., Журков В. С. // Гиг. и сан. - 1998. - № 4. - С. 62-65.
12. Эвери Г. Основы кинетики и механизмы химических реакций. - М., 1978.
13. Carcinogenic potency Database // University of California, USA // http-potency.berkeley.edu-pdfs/CPDВ.
14. Debnath A. K, Debhath G., Shusterman A. J., Hansch C. // Environ. Mol. Mutag. - 1992. - Vol. 19. - P. 37-52.
15. http://www.molinspiration.corn/cgi-bin/properties
16. Stiborovä M., Miksanovä M., Havlicek V. et al. // Mutât. Res. - 2002. - Vol. 500. - P. 49-66.
17. TOXNET httpL://toxnet. nlm.nih.gov/
Поступило 14.03.09
