CC BY
37
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Экспериментальное изучение противовирусной активности препарата «Гриппферон» в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/2009 in vitro
С. Я. ЛОГИНОВА1, С. В. БОРИСЕВИЧ1, В. Н. ЩУКИНА1, Г В. БОРИСЕВИЧ1, В. П. БОНДАРЕВ1, В. А. ШЕВЦОВ2
1 Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» — «Вирусологический центр», Сергиев Посад;
2 Главный государственный центр санитарно-эпидемиологического надзора Министерства обороны Российской Федерации, Москва
Experimental Study of Grippferon Antiviral Activity Against Mexican Pandemic Influenza Virus A/H1N1/2009 in vitro
S. YA LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, V. N. SHCHUKINA, G. V. BORISEVICH, V. P BONDAREV, V. A SHEVTSOV
Virological Centre, Central Research Institute No. 48, Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Chief State Centre for Sanitary and Epidemiologic Inspection, Ministry of Defense of the Russian Federation, Moscow
Проведённый анализ эффективности Гриппферона и препаратов сравнения Реальдирона и Реаферона-ЕС в отношении вируса гриппа А (НШ1)/2009 в чувствительный постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в изученный концентрациях эффективно подавляет цитопатическую активность вируса и формирование специфического гемагглютинина.
Ключевые слова: грипп A(H1N1)/2009, гриппферон, противовирусная эффективность, культура клеток.
Analysis of the efficacy of Grippferon vs. the reference drugs Realdiron and Reaferon-EC against the influenza virus A(H1N1)/2009 in susceptible static cell cultures showed that in the concentrations tested it was efficient in inhibition of the virus
cytopathic activity and generation of specific hemagglutinin. ^
Key words: influenza virus A (H1N1)/2009, Grippferon, antiviral efficacy, cell culture.
Грипп и ОРВИ остаются серьёзной проблемой для здоровья людей практически во всех странах мира и вызывают ежегодные эпидемии, во время которых заболевает от 5 до 15% всего населения планеты, а во время пандемий число заболевших возрастает в 4—6 раз [1]. Развитие современного скоростного транспорта, тесные международные контакты, массовые миграции населения, паломничество и туризм способствуют быстрому распространению гриппа по всему миру. С годами процесс распространения вирусов гриппа и других возбудителей ОРВИ будет только ускоряться [2, 3]. В середине апреля 2009 г. в Мексике и США от больных людей были выделены первые штаммы нового пандемического вируса гриппа А, позже названного как вирус гриппа А/Н1Ш/2009 (или А (И1Ш) — 2009) [4]. Этот грипп в литературе встречается и под другими наименованиями — «мексиканский», «калифор-
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 141306 Московская обл., Сергиев Посад-6. Вирусологический центр
нийский». Пандемический грипп А/Н1Ш/2009 с апреля 2009 г. зарегистрирован практически во всех странах мира. Летальность среди госпитализированных пациентов составила около 1,0% [5]. К августу 2010 г. констатировали завершение пандемии гриппа А/НШ1/2009. В эпидсезон 2010—2011 гг. возбудитель гриппа А/Н1Ш/2009 полностью вытеснил подтип А/Н3Ш. При этом в сезон 2010/2011 гг. он доминировал на территории Европы и Северной Азии [6].
Учитывая сохраняющуюся актуальность пандемического подтипа вируса гриппа необходимо было оценить в отношении него эффективность отечественного препарата «Гриппферон». Являясь основным фактором стимуляции клеточного иммунитета, интерферон обеспечивает включение важнейших защитных механизмов противовирусной защиты особенно в тех случаях, когда интерфероны 1-го типа подавляются возбудителем. При этом интерферон подавляет репродукцию вирусов на стадии, обязательной для всех вирусов: они блокируют начало трансляции. Следовательно, интерфероны являются препара-
Є
Таблица 1. Результаты оценки эффективности Гриппферона по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм А/California/07/2009 (^N1) в культуре клеток MDCK через 72 ч после инфицирования
Препарат Схема внесения препарата Доза препарата, МЕ/мл Частота выявления ЦПД Коэффициент подавления ЦПД, %, Х±а^
Гриппферон, серия №1 -24 ч 1х104 9/3G 70,0+0,0
+ 1 ч 1х104 12/3G 60,0+0,0
Гриппферон, серия №2 -24 ч 1х104 7/3G 76,7+3,4
+1 ч 1х104 12/3G 60,0+0,0
Реаферон-ЕС -24 ч 1х105 7/3G 76,7+3,4
1х104 8/3G 73,3+3,4
+1 ч 1х105 9/3G 70,0+0,0
1х104 8/3G 73,3+3,4
Реальдирон -24 ч 1х105 7/3G 76,7+3,4
1х104 7/3G 76,7+3,4
+1 ч 1х105 8/3G 73,3+3,4
1х104 8/3G 73,3+3,4
Контроль (без препарата) 3G/3G
тами универсально широкого антивирусного действия. Никакие иные противовирусные препараты не обладают в полном объёме функциональными свойствами, присущими или даже подобными интерферонам.
Целью наших исследований являлось изучение эффективности препарата «Гриппферон» в отношении экспериментальной гриппозной инфекции, вызванной пандемическим вирусом гриппа A/H1N1/2009 in vitro.
Материал и методы
Вирус. В работе использовали вирус гриппа, штамм A/Califomia/07/2009 (H1N1), полученный из ФГУ «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Культура клеток. Использована постоянная культура клеток почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Исследуемый препарат. Препарат Гриппферон (интерферон альфа-2) производства «ФИРН М», Россия, серии №№ 1 и 2.
Референс-препараты. Реаферон-ЕС — производства ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА», серия 09. Реальдирон — производства НПО «Фермент», экспериментальный завод ИОС «Санитас», Рига, Латвия.
Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:
— снижение уровня цитопатического действия вируса под воздействием препарата;
— снижение уровня образования вирусспецифическо-го гемагглютинина;
— коэффициент ингибирования (Ки, %).
Оценка противовирусной эффективности используемых лекарственных препаратов осуществлена в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ [7]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Стьюденту [8].
Результаты и обсуждение
Исследования активности препарата Гриппферон проводили по определению подавления цитотоксичности вируса и формирования специфичного гемагглютинина вируса в монослое культуры клеток MDCK.
Как правило, исследуемый препарат интерферона вносят в культуру за сутки до инфицирования вирусом в связи с тем, что развитие максимального протективного эффекта наступает не ранее чем через 10 ч после внесения препарата. На чувствительность монослоя культуры клеток к интерферону влияют также и другие факторы: количество клеток на пробирку, их плотность, возраст, длительность инкубации с интерфероном, доза вируса, рН среды и время учёта результатов [9, 10].
Для изучения противовирусной эффективности препараты интерферона вносили в поддерживающую среду за 24 ч и через 1 ч после инфицирования. Использовали монослой культуры клеток двухсуточного возраста, инфицирующая доза вируса составила 0,1 ЦПД50/клетку. В течение всего срока наблюдения визуально учитывали цитопа-тический эффект, вызванный в культуре клеток вирусом, с использованием светового микроскопа (объектив х10, окуляр х15), а также определяли уровень специфического гемагглютинина.
Результаты оценки эффективности интерферона по подавлению цитопатической активности и образования специфического гемагглютинина вируса гриппа свидетельствуют, что в первые 24 часа после инфицирования вирус в культуре клеток накапливается в незначительных концентрациях, не вызывая деструкции клеток. В 20% монослоя инфицированных клеток отмечены цитопатические изменения в виде округления клеток и увеличения ядра, выявлен также низкий уровень накопления вирусспецифического гемагглютинина (4 ГА). В присутствии референс-препаратов (Реаферон-ЕС, Реальдирон), а также исследуемых серий Гриппферона через 24 ч после инфицирования возбудитель в клетках не обнаруживался.
Через 72 ч после инфицирования цитопатиче-ский эффект отмечен во всех инфицированных клетках контрольной группы (табл. 1). При внесении Гриппферона в дозе 1х104 МЕ/мл в культуру
Є
Влияние Гриппферона на уровень формирования специфического гемагглютинина вируса гриппа А(Ж№)/2009.
клеток за 24 ч до инфицирования отмечен более выраженный противовирусный эффект: ингибирование цитопатической активности вируса гриппа А составило 70,0 и 76,7% для образцов препарата №№ 1 и 2 соответственно. При внесении исследуемых препаратов интерферона в культуральную среду через 1 ч после инфицирования монослоя клеток эффективность подавления ЦПД вируса составила 60%. Важно отметить, что результаты противовирусной эффективности иссле-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
дуемого Гриппферона сопоставимы с таковыми для референс-препаратов: Реаферона-ЕС и Реальдирона. Реаферон-ЕС и Реальдирон при внесении их за 24 ч до заражения клеток подавляли 73,3—76,7% цитопатической активности вируса. Сравнение средних величин ингибирующей активности исследуемых образцов препарата Гриппферона и референс-пре-паратов показало отсутствие достоверных отличий (^<0,05). Реаферон-ЕС и Реальдирон при внесении их через 1 час после инфицирования клеток подавляли 70,0—73,3% цитопатической активности вируса. Достоверные различия эффективности исследуемых образцов препарата и референс-препаратов отсутствуют (^<0,05).
На пике накопления вируса гриппа в клетках при внесении Гриппферона за 24 ч до инфицирования в дозе 1х104 МЕ/мл наблюдали подавление формирования специфического гемагглютинина на 75% обоими исследуемыми образцами препарата Гриппферона (рисунок). Полученные результаты противовирусной эффективности исследуемого интерферона сопоставимы с таковыми для Реаферона-ЕС и Реальдирона. Препараты изученных серий
Таблица 2. Сравнительная характеристика препаратов интерферона
Показатель
Гриппферон
Реаферон
Реальдирон
Способ применения Противопоказания
Побочные действия
Применение у детей и беременных
Местно
Индивидуальная непереносимость компонентов препарата
Аллергические реакции
Разрешён к применению у беременных и у детей в соответствии с возрастной дозировкой
Внутривенно, внутримышечно, подкожно, ректально, наружно Повышенная чувствительность к компонентам препарата; выраженные нарушения функции печени и почек; сердечно-сосудистые заболевания; эпилепсия Гриппоподобный синдром: тошнота, рвота, поносы; нарушение картины крови; нарушения функции печени; головокружение, сонливость; понижение или повышение артериального давления, аритмии
Только в том случае, если ожидаемая польза матери превышает потенциальную угрозу для плода; следует прекратить грудное вскармливание
Внутримышечно, подкожно
Индивидуальная непереносимость компонентов препарата
Озноб, лихорадка, чувство усталости, вялость, головная боль, миалгия, боль в суставах, потеря аппетита (частично купируются парацетамолом); возможны незначительная лейкопения, тромбоцитопения, некоторые отклонения показателей функции печени (исчезают при отмене препарата или снижении его дозы) Возможно, если ожидаемый эффект терапии превышает риск для плода (особенно в 1 триместре) или ребёнка
Є
Гриппферона по своей противогриппозной активности статистически достоверно не отличались (^<0,05).
Следует отметить, что 10-кратное увеличение дозы референс-препаратов до 1 х 105 МЕ/мл практически не отражается на противовирусной эффективности по сравнению с дозой этих же препаратов, равной 1х104 МЕ/мл, которая является достоверно достаточной для выраженного противовирусного эффекта, как в первые сутки инфицирования, так и на пике (72 ч) инфицирования.
Несмотря на сопоставимость противовирусной эффективности препарата Гриппферон и ре-ференс-препаратов Реальдирон и Реаферон-ЕС, особенностью препарата Гриппферон, капли на-
ЛИТЕРАТУРА
1. Слепушкин А. Н. Грипп и другие ОРВИ // под ред. В.И. Покровского, Г.Г. Онищенко, Б.Л. Черкасского Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. М.: «Медицина», 2003. 184—214.
2. Колобухина Л. В. Вирусные инфекции дыхательных путей // Рус. мед. журн. 2000. № 8. 1—23.
3. Семёнов Б. Ф, Гервазиева В. Б., Сверновская В. В. Распространённость и структура острых респираторных вирусных инфекций // Журн. микробиол. 2002. № 5. 79—86.
4. Чучалин А. Г. Грипп А/НШ1: уроки пандемии // Пульмонология. 2010. Приложение. 3—8.
5. www.en.wikipedia.org/wiki/2009_flu/pandemic_by_country.
зальные является его местное противовирусное действие (табл. 2). Введение Гриппферона в носовую полость обеспечивает локальные концентрации препарата непосредственно в очаге поражения. При этом практически отсутствуют побочные эффекты, свойственные парентеральному введению высоких доз интерферона. Препарат Гриппферон разрешён к применению во всех возрастных группах, в том числе и у детей с рождения, а так же в течение периода беременности.
Результаты изучения противовирусной активности Гриппферона свидетельствуют о целесообразности использования его в качестве средства профилактики и раннего этиотропного лечения ОРВИ и гриппа.
6. www.euroflu.org/cgi-files/bulletin_v2.cgi
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2005.
8. Лакин Г. Ф. Биометрия. М., «Высшая школа». 1990.
9. Dianzani F., Viano I., Santiano M. et al. Effect of cell density on development of the antiviral state in interferon-producing cells: a possible model of in vivo conditions / Proc Soc Exp Biol (N.Y.). 1977. 155: 5: 445—448.
10. Lodemann E., Diederich J., Sattler U., Wacker A. Induction of interferon in L cells by polyinosinic-polycytidylic acid in the presence of cationic compounds. II. Basic dyes // Arch. Ges. Virusforsch. 1973. Bd. 40, No. 2. 87—92.
