CC BY
14
УДК 615.065
экспериментальное исследование влияния иммобилизированных субтилизинов на репродуктивную токсичность. i. антенатальный период
Татьяна Аннавна ЭМЕДОВА1, Светлана Владимировна МИШЕНИНА1, Павел Геннадьевич МАДОНОВ1, Татьяна Геннадьевна БОРОВСКАЯ2, Анна Владимировна ВЫЧУЖАНИНА2, Валерия Александровна МАШАНОВА2
1 Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52
2 НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ 634028, г. Томск, просп. Ленина, 3
При изучении возможных эмбриотоксических свойств иммобилизированных субтилизинов, реализуемых в антенатальном периоде развития, установлено, что при его введении крысам-самкам в дозе 195 ЕД/кг в течение всего периода беременности токсических эффектов не выявлялось. При дозе 1950 ЕД/кг возрастает гибель плодов после имплантации, у живых плодов увеличивается количество наружных кровоизлияний, патологических изменений внутренних органов, тормозятся процессы оссификации.
Ключевые слова: иммобилизированные субтилизины, репродуктивная токсичность, антенатальный период.
В современной фармакологии для полноценного изучения лекарственного препарата необходимо выполнение экспериментальных исследований их репродуктивной токсичности. Эксперименты проводятся на различных животных, преимущественно грызунах, оценивается способность лекарственного препарата оказывать токсическое воздействие на репродуктивные органы с последующим снижением половой функции и способности к размножению, а также патологическое воздействие на развитие потомства [3, 4]. Результаты экспериментов по репродуктивной токсичности дают возможность, во-первых, оценить риск применения препарата и предотвратить развитие бесплодия у пациентов, во-вторых, исключить негативное влияние на плод, с последующим влиянием на новорожденного ребенка.
Цель исследования - изучить возможное эм-бриотоксическое и тератогенное действие лекарственного средства на основе иммобилизирован-ных субтилизинов при введении его во время беременности, реализуемое в антенатальном периоде развития.
Задачи исследования соответствуют основным критериям токсичности при изучении влияния на антенатальный период развития. Предстояло исследовать изменение динамики массы беременных крыс, увеличение показателей эмбриональной гибели, размера и массы плодов, изменение распределения крысят по полу, появление в потомстве плодов с увеличением (уменьшением) точек оссификации, с патологическими изменениями наружных и внутренних органов.
Эмедова Т.А. - аспирант кафедры акушерства и гинекологии
Мишенина С.В. - к.м.н., доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины
Мадонов П.Г. - д.м.н., зав. кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины, e-mail: [email protected]
Боровская Т.Г. - д.б.н., проф., зав. лабораторией фармакологии репродуктивной системы, e-mail: [email protected]
Вычужанина А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории фармакологии репродуктивной системы
Машанова В.А. - младший научный сотрудник лаборатории фармакологии репродуктивной системы
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали лекарственное средство на основе иммобилизированных суб-тилизинов (ЛПИС) - тромбовазим®. Активной фармакологической субстанцией тромбовазима® является иммобилизированный на полиэтилен-оксиде с помощью технологии радиационного синтеза субтилизин. Субтилизин тромбовазима® состоит из 275 аминокислот, его молекулярная масса 27,7 кДа. В настоящее время зарегистрированы две лекарственные формы препарата с одинаковым названием. Показание к применению парентеральной формы - лечение острого инфаркта миокарда с подъемом сегмента ST, энтераль-ной формы - лечение хронической венозной недостаточности.
Для исследования репродуктивной токсичности ЛПИС препарат применялся в жидком виде, вводился перорально. Приготовление доз для введения осуществлялось в день введения в необходимом количестве. ЛПИС вводился крысам в терапевтической дозе 195 ЕД/кг и в дозе 1950 ЕД/кг (максимальная доза) в соответствии с Руководством по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ [4].
Эксперименты выполнены на половозрелых животных: аутбредных крысах сток CD массой 250-300 г, в возрасте 2,5-3 мес., полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (НИИФиРМ, г. Томск). Дизайн экспериментов одобрен этическим комитетом НИИФиРМ. Крысы содержались в неполной барьерной системе в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животные были адаптированы в виварии в отдельной комнате в течение трех дней до начала введения. Во время этого периода осуществляли ежедневный осмотр их внешнего состояния.
При изучении возможного эмбриотоксическо-го и тератогенного действия ЛПИС, реализуемого в антенатальном периоде развития, препарат вводился беременным крысам-самкам перораль-но с 1 по 19 день беременности в терапевтической (195 ЕД/кг массы тела) и максимальной (1950 ЕД/кг массы тела) дозе. Контрольные животные получали растворитель (физиологический раствор) в те же сроки в эквивалентном объеме. В исследовании использовались данные контрольных групп прежних подобных экспериментов, обобщенные в группу «исторический контроль». Первый день беременности фиксировали
с помощью цитологической оценки вагинального мазка после подсаживания самок к интактным крысам-самцам. В течение периода беременности оценивалась динамика массы тела крыс (животных взвешивали на 1, 7, 14 и 20 дни беременности). Крысам на 20 день беременности проводилась эвтаназия (с помощью СО2-камеры). Затем их вскрывали и подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, число живых и мертвых плодов. Преимплантационную смертность определяли по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке, постимплантацион-ную смертность - по разности между количеством мест имплантации и количеством живых плодов [4]. Живые плоды выделялись, определялась их масса, краниокаудальный размер, пол. Проводился макроскопический осмотр плодов на наличие у них внешних патологических изменений. В дальнейшем исследовалось состояние их внутренних органов (по методу Вильсона) и процессов оссификации (по методу Доусона) [4]. Для проведения этих исследований использовались 20 крыс-самок опытной группы (две дозы), 10 контрольных самок и 10 крыс-самцов.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами вариационной статистики. Вычисляли среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (т), результаты представляли в виде X ± т. Различие двух сравниваемых величин считалось статистически значимым в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5 % (р < 0,05). В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический ^критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок был использован непараметрический и-критерий Манна - Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовался критерий углового преобразования Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате исследований установлено, что поведение и внешний вид крыс-самок, получавших ЛПИС в различные периоды беременности в исследуемых дозах, не отличались от таковых в контрольных группах. Крысы не проявляли признаков беспокойства и агрессии, имели хороший аппетит, были подвижны, имели гладкий шерстяной покров. Масса тела животных после 7-дневного введения ЛПИС в максимальной дозе не отличалась от фоновых значений (исторический контроль), но достоверно снижалась по сравне-
Примечание. Здесь и в табл. 2-4 обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия от величин соответствующих показателей: * - соответствующего контроля, # - исторического контроля.
Таблица 2
Влияние ЛПИС на эмбриональное развитие крыс, полученных от самок, которым вводили ЛПИС
с 1 по19 день беременности
Таблица 1
Прирост массы тела (г) беременных крыс, которым вводили ЛПИС с 1 по 19 день беременности
Группа Дни беременности
1-7 7-14 14-20 1-20
ЛПИС (195 ЕД/кг), п = 12 30,08 ± 1,63# 33,83 ± 2,53 47,17 ± 4,45 107,58 ± 7,12
ЛПИС (1950 ЕД/кг), п = 11 22,73 ± 4,38* 33,18 ± 4,03 47,64 ± 4,01 103,55 ± 5,94
Контроль, п = 12 33,33 ± 2,10# 34,17 ± 2,90# 46,83 ± 7,17 113,50 ± 9,73
Исторический контроль, п = 46 27,26 ± 1,34 31,41 ± 1,41 53,22 ± 1,69 111,89 ± 3,81
Группа Число желтых тел на 1 самку Число мест имплантации на 1 самку Число живых плодов на 1 самку Преимплан-тационная гибель, % Постимплан-тационная гибель, % Средняя масса плодов, г Средний размер плодов, мм
ЛПИС (195 ЕД/кг), п = 11 14,08 ± 0,78 11,58 ± 1,14 10,58 ± 1,07 17,91 ± 6,71 8,99 ± 3,08 2,43 ± 0,04 28,88 ± 0,86
ЛПИС (1950 ЕД/кг), п = 10 14,40 ± 0,52 12,50 ± 1,13 10,40 ± 1,28 14,41 ± 6,18 18,27 ± 4,90#* 2,37 ± 0,04 29,46 ± 0,37
Контроль, п = 11 14,10 ± 0,82 12,60 ± 0,85 12,30 ± 0,86 10,74 ± 2,83 2,49 ± 1,32 2,41 ± 0,06 29,43 ± 0,27
Исторический контроль, п = 46 13,91 ± 0,30 12,85 ± 0,32 12,02 ± 0,31 7,65 ± 1,23 6,38 ± 1,20 2,16 ± 0,03 29,24 ± 0,11
нию с контролем, что не отразилось на общем приросте массы тела за весь период беременности (табл. 1). Повышение исследуемого показателя по сравнению с фоном не является результатом действия ЛПИС, так как и в контроле он оказался увеличенным по сравнению с фоном. Фарма-кокинетика ЛПИС указывает на то, что наряду с высокой энтеральной биодоступностью оно не депонируется в тканях и, соответственно, не может вызвать существенных морфофункциональ-ных повреждений. Ранее изучено положительное действие терапевтических доз ЛПИС на периферическое кровообращение [1]. Влияние ЛПИС в терапевтической дозе на эмбриональное развитие крыс подтвердило предположение об отсутствии негативного влияния ввиду низкой тканевой кумуляции.
При введении ЛПИС в максимальной дозе (1950 ЕД/кг) число желтых тел, мест имплантации и преимплантационная гибель не отличались от контрольных значений. При этом число плодов имело выраженную тенденцию к снижению, достоверно возрастала постимплантационная гибель по сравнению с контролем и фоном (табл. 2).
Фетоплацентарный комплекс беременной самки уязвим для 10-кратного повышения дозы ЛПИС. Высокие дозы ЛПИС вызывают избыточную перфузию материнской части плаценты с формированием локальной гиперемии и последующего отека, что понижает диффузию в фетоплацентар-ном комплексе. Это предположение согласуется с особенностями формирования и функционирования фетоплацентарного комплекса крыс, у которых с 16 дня беременности происходит уменьшение материнской части плаценты до 32 % со снижением капиллярной перфузии [2].
Установлен дозозависимый эмбриотоксиче-ский эффект ЛПИС. Введение беременным крысам ЛПИС в максимальной дозе (1950 ЕД/кг) влияет на скорость процессов оссификации (табл. 3). На 20 день беременности выявилось снижение числа точек окостенения плюсны, количества плодов со сформировавшимися костями черепа по сравнению с контрольными и фоновыми показателями. При уменьшении дозы до терапевтической количество точек оссификации в экспериментальной группе уже не отличалось от величины показателя в контрольной и фоновой
Таблица 4
Патологические изменения внутренних органов плодов, полученных от самок, которым вводили ЛПИС с 1 по19 день беременности
Таблица 3
Влияние ЛПИС на состояние процессов оссификации плодов, полученных от самок, которым вводили ЛПИС с 1 по19 день беременности
Группа Количество точек оссификации, п Количество плодов со сформировавшимися костями черепа, %
плюсна пястье крестец грудина ребра
ЛПИС (195 ЕД/кг), п = 51 2,92 ± 0,06 2,49 ± 0,08 1,82 ± 0,15 1,90 ± 0,10 13,00 ± 0,00 90,20
ЛПИС (1950 ЕД/кг), п = 51 2,65 ± 0,12*# 2,25 ± 0,11 1,45 ± 0,17 1,53 ± 0,11 13,00 ± 0,00 72,55*#
Контроль, п = 56 3,00 ± 0,00 2,48 ± 0,07 1,93 ± 0,13 2,13 ± 0,09 13,00 ± 0,00 94,64
Исторический контроль, п = 263 2,93 ± 0,03 2,90 ± 0,02 1,30 ± 0,08 2,05 ± 0,07 13,00 ± 0,00 83,27
Группа Количество плодов в группе, п Количество плодов с аномалиями, %
с обширными кровоизлияниями с умеренными кровоизлияниями с полнокровием сосудов печени с холе-стазом с умеренными расширениями желудочков головного мозга с гемопе-рикардом
ЛПИС (195 ЕД/кг), п = 6 66 7,58*# 35,15# 74,24*# 27,27#* 4,55# 12,12
ЛПИС (1950 ЕД/кг), п = 6 60 10,00*# 31,67# 48,33# 0,0 3,33# 21,67*#
Контроль, п = 6 58 1,72# 34,48# 39,66# 0,0 3,45# 10,34
Исторический контроль, п = 25 270 23,03 10,00 23,70 12,96 11,48 8,15
группах. Анализ данных осмотра внутренних органов плодов методом Вильсона (п = 184, из них 126 плодов экспериментальных групп) показал, что введение ЛПИС в максимальной дозе с 1 по 19 день беременности приводило к возрастанию числа плодов с гемоперикардом (по сравнению с контролем и фоном) с обширными кровоизлияниями (по сравнению с контролем) (табл. 4). При снижении дозы до терапевтической число кровоизлияний не повышается. Совершенно очевидно, что ЛПИС обладает уникальной способностью к фетоплацентарному транспорту и проявляет свои фибринолитические свойства в крови эмбрионов.
Таким образом, можно утверждать, что ЛПИС в терапевтической дозе является безопасным для репродуктивного здоровья женщины. Одна-
ко установленный факт дозозависимой эмбрио-токсичности 10-кратной терапевтической дозы (1950 ЕД/кг) безусловно настораживает. С позиции клинициста можно рассматривать безопасный вариант применения ЛПИС в повышенной дозе только в случае продолжения гормональной контрацепции или использования барьерных методов, исключающих беременность. Можно позволить себе рассуждать о некоей безопасной промежуточной дозе, но фактологический материал проведенного исследования исключает подобного рода допущения. Возможно, компании-производителю ЛПИС следует провести дополнительные доклинические исследования для установления предельно безопасной терапевтической дозы для репродуктивной системы.
список литературы
1. Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Ершов К.И. и др. Опыт клинического применения нового лекарственного препарата Тромбовазим в сосудистой хирургии // Ангиол. и сосуд. хирургия. 2015. 21. (1). 99-104.
2. Мацюк Я.Р., Барабан О.В. Структура плаценты крыс в разные сроки нормально протекающей беременности // Журн. Гродненск. гос. мед. ун-та. 2012. (1). 54-58.
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Ред. Н.Д. Бу-нятян, А.Н. Васильев, О.Л. Верстакова и др. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
4. Integration of Study Results to Assess Concerns about Human Reproductive and Developmental Toxicities. 2001. https://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/ 98fr/992079gd.pdf.
experimental study of immobilized subtilyzines influence on reproductive toxicity. i. antenatal period
Tatyana Annovna EMEDOVA, Svetlana Vladimirovna MISHENINA,
Pavel Gennad'evich MADONOV, Tatyana Gennad'evna BOROVSKAYА2,
Anna Vladimirovna VYCHUZHANINA2, Valeriya Aleksandrovna MASHANOVA2
1 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
2 Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine 634028, Tomsk, Lenin av., 3
The study of the possible embryotoxic properties of immobilized subtilisins realized in the antenatal period showed that its administration to female rats at a dose of 195 U / kg throughout the pregnancy period did not reveal toxic effects. At a dose of 1950 U / kg, the death of embryos after implantation increased, and the number of external hemorrhages, pathological changes in internal organs, and inhibition of ossification increased in living embryos.
Key words: immobilized subtilisins, reproductive toxicity, antenatal period.
Emedova T.A. - post-graduate student of the department of obstetrics and gynecology
Mishenina S.V - candidate of medical sciences, associated professor of the department ofpharmacology,
clinical pharmacology and evidentiary medicine
Madonov P.G. - doctor of medical sciences, professor, head of department offor pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine, e-mail: [email protected]
Borovskaya T.G. - doctor of biological science, professor, head of laboratory ofpharmacology of genital system, e-mail: [email protected]
Vychuzhanina A.V. - candidate of biological science, senior research associate of laboratory ofpharmacology of genital system
Mashanova V.A. - junior researcher of laboratory ofpharmacology of genital system
