CC BY
20
УДК 615.065
экспериментальное исследование влияния иммобилизированных субтилизинов на репродуктивную токсичность. II. посТНАТАЛьНЫй пЕРИОД
Татьяна Геннадьевна БОРОВСКАЯ1, Анна Владимировна ВЫЧУЖАНИНА1, Валерия Александровна МАШАНОВА1, Татьяна Аннавна ЭМЕДОВА2, Светлана Владимировна МИШЕНИНА2, Павел Геннадьевич МАДОНОВ2
1 НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ 634028, г. Томск, просп. Ленина, 3
2 Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52
Введение иммобилизированных субтилизинов в 10-кратной терапевтической дозе вызывает ряд токсических эффектов, реализуемых в постнатальном периоде развития. Такие эффекты, как сниженная жизнеспособность, замедление сроков физического развития, скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, снижение способности к обучению, замедление выполнения безусловных рефлексов, выявлялись у потомства крыс, получавших иммобилизированные субтилизины во время беременности.
Ключевые слова: иммобилизированные субтилизины, репродуктивная токсичность, постнатальный период.
Лекарственные препараты принадлежат к числу химических веществ, способных оказывать неблагоприятное воздействие на воспроизводящую функцию и потомство, что определяет необходимость изучения их репродуктивной токсичности. В соответствии с методическими указаниями [3, 4], все новые лекарственные средства должны подвергаться изучению репродуктивной токсичности на лабораторных животных (крысах). Это исследование предполагает изучение возможности применения нового лекарственного средства во время беременности (тератогенность, эмбриотоксичность в антенатальном и постна-тальном периодах).
Цель исследования - изучить возможное эм-бриотоксическое и тератогенное действие лекарственного средства на основе иммобилизирован-ных субтилизинов при введении его во время
беременности, реализуемое в постнатальном периоде развития. Для этого было исследовано его влияние на продолжительность беременности, снижение индекса выживаемости, нарушение физического развития потомства, изменение скорости формирования у потомства сенсорно-двигательных рефлексов, снижение способности к обучению и адаптивному поведению.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали лекарственное средство на основе иммобилизированных субтилизинов (ЛПИС) - тромбовазим®. Его активной фармакологической субстанцией является иммобилизированный на полиэтиленоксиде с помощью технологии радиационного синтеза субтилизин. Субтилизин тромбовазима® состо-
Боровская Т.Г. - д.б.н., проф., зав. лабораторией фармакологии репродуктивной системы, e-mail: [email protected]
Вычужанина А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории фармакологии репродуктивной системы
Машанова В.А. - младший научный сотрудник лаборатории фармакологии репродуктивной системы Эмедова ТА. - аспирант кафедры акушерства и гинекологии
Мишенина С.В. - к.м.н., доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины
Мадонов П.Г. - д.м.н., зав. кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины, e-mail: [email protected]
ит из 275 аминокислот, его молекулярная масса 27,7 кДа. В настоящее время зарегистрированы две лекарственные формы препарата с одинаковым названием. Показание к применению парентеральной формы - лечение острого инфаркта миокарда с подъемом сегмента ST, у энтеральной формы - лечение хронической венозной недостаточности.
При изучении возможного эмбриотоксическо-го и тератогенного действия ЛПИС, реализуемого в постнатальном периоде развития, лекарственное средство вводили перорально крысам-самкам с 6 по 20 день беременности в дозе 1950 ЕД/кг (10-кратная терапевтическая доза) [3]. Контрольные животные получали растворитель (физиологический раствор) в те же сроки в эквивалентном объеме. Самок оставляли до родов и на весь период вскармливания. Крысята выращивались до двухмесячного возраста. Фиксируемые показатели у крыс-самок: день родов, динамика массы тела, продолжительность беременности, численность помета. Фиксируемые показатели у крысят: динамика массы тела, индекс выживаемости до 28 дня жизни, сроки физического развития, скорость формирования сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания [3]. В одномесячном возрасте изучалось поведение крысят в условиях «открытого поля» [2]. В двухмесячном возрасте крысята тестировались на способность к обучению в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» и адаптивному поведению в тесте Хендерсона в модификации Бондаренко [1]. При изучении влияния ЛПИС на постнатальное развитие все исследуемые показатели фиксировались отдельно для крысят-самцов и для крысят-самок. Для этих экспериментов использовали 20 самок и 10 самцов.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами вариационной статистики. Вычисляли среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (т), результаты представляли в виде X ± т. Различие
Таблица 1
Динамика массы тела крыс, которым вводили ЛПИС с 6 по 20 день беременности
Дни беременности ЛПИС Контроль
1-7 31,90 ± 3,78 33,90 ± 1,93
7-14 35,70 ± 2,88 34,80 ± 2,65
14-20 63,70 ± 4,43 69,20 ± 4,29
1-20 131,30 ± 5,86 137,90 ± 5,26
Примечание. Здесь и в табл. 2-4 * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо при р < 0,05.
двух сравниваемых величин считалось статистически значимым в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5 % (р < 0,05). В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический ^критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок был использован непараметрический и-критерий Манна - Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовался критерий углового преобразования Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Внешний вид самок, получавших ЛПИС с 6 по 20 день беременности, не отличался от такового в контроле (крысы вели себя активно, имели гладкий шерстяной покров, хороший аппетит). Введение ЛПИС не влияло на динамику массы тела беременных крыс (табл. 1). Беременность всех животных закончилась благополучными родами на 22-23 день беременности, что соответствует видовой норме. Численность крысят в пометах в экспериментальной и контрольной группах оказалась сходной (табл. 2). Сравниваемые группы крысят не отличались друг от друга по срокам отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз (табл. 2). Внешних аномалий развития у потомства крыс самок опытной
Таблица 2
Индекс выживаемости и физическое развитие крысят, полученных от крыс-самок, которым вводили ЛПИС с 6 по 20 день беременности
Показатель ЛПИС Контроль
Индекс выживаемости 1-4 день жизни 4-7 день жизни 7-14 день жизни 14-21 день жизни 21-28 день жизни 1-28 день жизни 86,67 ± 9,46 94,76 ± 3,18 58,16 ± 6,80* 86,05 ± 5,21* 84,00 ± 11,08 34,81 ± 6,97* 99,17 ± 0,83 100,00 ± 0,00 98,13 ± 1,88 97,17 ± 1,50 100,00 ± 0,00 94,54 ± 2,43
День родов 22,60 ± 0,16 22,70 ± 0,15
Число крысят в помете 15,30 ± 0,15 14,80 ± 0,47
Отлипание ушной раковины 3,19 ± 0,05 2,96 ± 0,14
Появление волосяного покрова 4,11 ± 0,10 3,89 ± 0,09
Прорезание резцов 7,65 ± 0,23 7,14 ± 0,19
Открытие глаз 15,38 ± 0,08 15,54 ± 0,14
Опускание семенников 24,75 ± 0,51* 23,24 ± 0,09
Открытие влагалища 39,59 ± 0,69* 33,23 ± 0,69
Таблица 3
Способность крысят, полученных от крыс-самок, которым вводили ЛПИС с 6 по 20 день беременности, удерживаться на горизонтальной веревочке и формирование сенсорно-двигательных рефлексов
на 5 и 15 день жизни
Показатель ЛПИС Контроль
Самки Самцы Самки Самцы
5 день жизни
Способность удерживаться передними лапами: число животных1, % 97,22 ± 2,78 90,00 ± 5,53* 96,67 ± 3,33 100,00 ± 0,00
время удерживания, с 7,33 ± 1,70 4,05 ± 0,54 7,52 ± 0,93 5,18 ± 0,63
Число подтягивающихся животных, % 86,11 ± 7,35 62,50 ± 10,03* 89,17 ± 4,49 92,50 ± 3,82
«Рефлекс избегания края», число животных1, % 69,44 ± 8,10 65,00 ± 10,67 77,50 ± 10,17 85,00 ± 6,67
Время переворачивания на плоскости, с 5,83 ± 0,72* 5,93 ± 1,04* 3,14 ± 0,38 3,10 ± 0,31
15 день жизни
Время удерживания передними лапами, с 20,23 ± 3,51* 16,55 ± 1,89* 26,73 ± 2,46 29,07 ± 4,01
Способность удерживаться задними лапами, число животных1, % 81,48 ± 7,58 87,50 ± 8,54 94,17 ± 3,94 96,67 ± 3,33
Способность подтягиваться передними лапами, число животных1, % 100,00 ± 0,00 92,50 ± 5,34 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00
Примечание. ^ - число животных со сформировавшимся рефлексом.
группы, как и в контроле, при рождении не было. Потомство крыс, получавших ЛПИС в 10-кратной терапевтической дозе, характеризовалось более поздними сроками опускания семенников и открытия влагалища по сравнению с контролем (см. табл. 2). В опытных группах крысята родились с нормальной массой тела, но впоследствии (на 21 и 28 дни жизни) они набирали вес хуже, чем контрольные животные.
Наряду с этим установлено, что потомство самок, получавших ЛПИС, характеризовалось сниженной жизнеспособностью, отставанием в физическом развитии, в скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов. Индексы выживаемости потомства в первые дни и до 14 дня жизни в сравниваемых группах оказались сходными. Впоследствии количество крысят потомства самок экспериментальных групп стало сокращаться. Проявление этого токсического эффекта не зависело от принадлежности крысят к полу. На 28 день жизни численность пометов экспериментальной группы сократилась более чем в 2,5 раза.
При изучении способности крысят удерживаться на горизонтальной веревочке на 15 день жизни оказалось, что у опытной группы время удерживания передними лапами достоверно снижено по сравнению с контрольными группами (табл. 3). При исследовании способности к обучению потомства в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» все животные в первый день опыта обладали «норковым» рефлексом (заходили в темный отсек камеры). Во второй день
опыта у потомства экспериментальной группы этот показатель оказался статистически значимо меньше, чем у животных группы контроля. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение ЛПИС в 10-кратной терапевтической дозе беременным самкам приводит к снижению способности их потомства к обучению. Введение ЛПИС беременным самкам в 10-кратной терапевтической дозе не приводило к нарушению адаптивного поведения их потомства, но крысята осуществляли эту реакцию в течение более продолжительного времени, чем контрольные. При постановке теста Хендерсона в модификации Бондаренко установлено, что все крысята опытной и контрольной групп подныривали под край внутреннего цилиндра. Однако у животных опытной группы отмечалось увеличение по сравнению с контролем времени плавания во внутреннем и внешнем цилиндре, время поднятия на сетку и повышенная эмоциональность, что можно охарактеризовать как повышенную психомоторную активность (табл. 4).
Поскольку для ЛПИС не характерны фармакологические эффекты, присущие психотропным препаратам, вышеуказанная патологическая пост-натальная симптоматика представляет собой проявления энцефалопатии, возникшей по причине фетоплацентарной недостаточности. Вероятно, высокие дозы ЛПИС создают гемодинамические проблемы в фетоплацентарном комплексе, что затрудняет двустороннюю диффузию. Сниженное поступление нутриентов наряду с избыточным накоплением продуктов метаболизма в организ-
Таблица 4
Поведение крысят, полученных от крыс-самок, которым вводили ЛПИС с 6 по 20 день беременности, в «открытом поле», способность к обучению и к избавлению от стресс-реакции на 30 день жизни
Показатель ЛПИС Контроль
Самки Самцы Самки Самцы
Тест «открытое поле»
Количество пересеченных квадратов 57,04 ± 2,42* 58,30 ± 2,75* 50,83 ± 1,92 53,13 ± 1,27
Количество поднятий на задние лапы 6,68 ± 1,43 5,43 ± 0,88 7,50 ± 1,41 5,79 ± 0,55
Количество заглядываний в отверстия 14,45 ± 1,89* 13,83 ± 1,00* 22,64 ± 0,86 19,39 ± 1,07
Количество фекальных шариков 2,19 ± 0,42 2,0,4 ± 0,23 1,70 ± 0,35 2,22 ± 0,20
Тест «условный рефлекс пассивного избегания»
Время пребывания в светлой камере, с 1 день 13,89 ± 1,04 16,88 ± 1,81 15,35 ± 2,18 16,40 ± 1,45
2 день 127,61 ± 10,72* 144,65 ± 8,87* 175,45 ± 3,14 170,30 ± 4,39
Тест Хендерсона в модификации Бондаренко
Количество подныривающих крысят, % 100,00 100,00 100,00 100,00
Время плавания во внутреннем цилиндре, с 40,88 ± 4,08* 29,94 ± 3,50* 21,60 ± 1,70 18,25 ± 1,78
Время плавания во внешнем цилиндре, с 31,00 ± 2,91* 31,35 ± 5,03* 15,95 ± 2,08 11,65 ± 1,93
Время поднятия на сетку, с 9,12 ± 1,30* 10,47 ± 1,44* 5,45 ± 0,47 7,20 ± 0,97
Количество фекальных шариков 3,12 ± 0,19* 2,65 ± 0,23* 1,85 ± 0,23 1,35 ± 0,23
ме эмбрионов способно негативно влиять на внутриклеточный метаболизм в нейронах, изменять их функциональную активность. В современной неонатологии именно так трактуется одна из причин патологической неврологической симптоматики у новорожденных детей, матери которых страдают фетоплацентарной недостаточностью. Таким образом, введение ЛПИС в 10-кратной дозе вызывает ряд токсических эффектов, реализуемых в постнатальном периоде развития. У этого потомства выявлялись сниженная жизнеспособность, замедление сроков физического развития, скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов. При введении в терапевтической дозе токсические эффекты не отмечались (данные не представлены).
Приведенные выше сведения являются предметом добросовестного следования современной концепции оценки репродуктивной токсичности и представляют академический интерес в большей степени, чем практический. Дело в том, что ЛПИС (тромбовазим®) в инструкции по медицинскому применению имеет противопоказания к применению во время беременности. Принимая во внимание это обстоятельство, очень малове-
роятно, что женщина начнет лечить возникшую у нее хроническую венозную недостаточность тромбовазимом®, будучи беременной. Разумеется, нельзя исключать возможность возникновения незапланированной беременности в период приема ЛПИС, поэтому чрезвычайно важно не превышать рекомендуемую терапевтическую дозу.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бондаренко Н.А. Зависимость реакции поведения избавления из стрессогенной ситуации от типологической принадлежности животных // Деп. в ВИНИТИ. 1980. № 2038.
2. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высш. шк., 1991. 399 с.
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Ред. Н.Д. Бу-нятян, А.Н. Васильев, О.Л. Верстакова и др. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
4. Integration of Study Results to Assess Concerns about Human Reproductive and Developmental Toxicities. 2001. https://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/ 98fr/992079gd.pdf.
EXPERIMENTAL STUDY OF IMMOBILIZED SUBTILYZINES INFLUENCE ON REPRODUCTIVE TOXICITY. II. POSTNATAL PERIOD
Tatyana Gennad'evna BOROVSKAYA1, Anna Vladimirovna VYCHUZHANINA1, Valeriya Aleksandrovna MASHANOVA1, Tatyana Annovna EMEDOVA2, Svetlana Vladimirovna MISHENINA2, Pavel Gennad'evich MADONOV2
1 Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine 634028, Tomsk, Lenin av., 3
2 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
The introduction of immobilized subtilisins causes a number of toxic effects in the postnatal period of development. Reduced viability, slower physical development, speed of formation of sensory-motor reflexes, decreased ability to learn, delay of unconditioned reflexes were detected in the offspring of rats that received immobilized subtilisins during pregnancy.
Key words: immobilized subtilisins, reproductive toxicity, postnatal period.
Borovskaya T.G. - doctor of biological science, professor, head of laboratory ofpharmacology ofgenesial system, e-mail: [email protected]
Vychuzhanina A.V. - candidate of biological science, senior research associate of laboratory ofpharmacology of genesial system
Mashanova V.A. - junior researcher of laboratory ofpharmacology of genesial system
Emedova T.A. -post-graduate student of the department of obstetrics and gynecology
Mishenina S.V - candidate of medical sciences, associated professor of the department ofpharmacology,
clinical pharmacology and evidentiary medicine
Madonov P.G. - doctor of medical sciences, professor, head of department offor pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine, e-mail: [email protected]
