CC BY
20УДК 547.458.1:615.456.1:616-006.04:615.849.12
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕЛЕВОГО МАТЕРИАЛА «БОРГИАЛ»
A.В. Карамышева1, Г.В. Сон1,
И.А. Маклакова1, Н.М. Перова1, С.А. Успенский2, П.Л. Иванов2,
B.Н. Хабаров2, М.А. Селянин2
'ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115522, г Москва
2АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», 111123, г Москва
Проведены экспериментальные исследования биологического действия отечественного препарата на основе гиалуроновой кислоты (ГК) и бора на белых крысах. Установлено, что препарат не оказал неблагоприятного воздействия на организм животных: гематологические, биохимические и иные показатели, характеризующие состояние систем и органов у животных, подвергавшихся воздействию исследуемых соединений, не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей контроля. На основании первого этапа исследований можно говорить о возможности использования данного нетоксичного соединения для задач нейтрон-захватной терапии.
Ключевые слова: гиалуроновая кислота, бор, комплекс, нейтрон-захватная терапия, токсичность.
Введение. Одной из основных проблем успешного клинического применения метода борнейтрон-захватной терапии является создание борсодержащих препаратов, которые должны селективно накапливаться в злокачественных опухолях, не оказывая при этом повреждающего воздействия как на окружающие здоровые ткани, так и общего неблагоприятного влияния на организм человека в целом, при поступлении бора в количествах, обеспечивающих его необходимую концентрацию в опухоли. Разработанные на сегодня соединения в большей части не обеспечивают терапевтический эффект и обладают при этом общей токсичностью и местным раздражающим действием [1, 2].
В последние годы внимание ученых привлекла гиалуроновая кислота (ГК) благодаря ее способности специфически связываться с основным поверхностно-клеточным рецептором CD44, сверхвыраженным в различных раковых клетках [3-7]. Более того, ГК обладает физико-химическими и биологическими свойствами, обуславливающими биосовместимость, биодеградацию без образования реакционноспособ-
ных токсических продуктов.
В поиске новых решений российскими учеными разработана технология твердофазной модификации ГК - созданы новые комплексы ГК целенаправленного действия, в состав которых входят различные химические элементы, например, бор, катионы металлов (цинка, серебра, золота и др.). В качестве таких материалов в ООО «Лаборатория ТОСКАНИ» создан «Материал гелевый борсодержащий стерильный на основе модифицированной гиалуроновой кислоты «БОРГИАЛ», где концентрации каждого из компонентов препарата обеспечивают клиническую эффективность, не оказывая при этом необратимого повреждения окружающих здоровых тканей и жизненно важных систем и органов человека.
Актуальность проблемы разработки и, соответственно, оценки биологической безопасности новых гелевых лечебных материалов для онкологии не вызывает сомнения, так как эти изделия имеют прямой контакт с поражёнными тканями человека, обуславливая тем самым поступле-
Перова Нина Михайловна (Perova Nina Mikhaelovna), к.м.н., начальник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора, г. Москва, vniiimt34@mail.ru
Карамышева Анна Валериевна (Karamysheva Anna Valeriyevna) с.н.с. отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ», г. Москва, vniiimt34@mail.ru
Маклакова Ирина Александровна (Maklakova Irina Aleksandrovna), к.х.н., ведущий научный сотрудник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора, г. Москва, vniiimt34@mail.ru
Сон Григорий Валентинович (Son Grigory Valentinovich) с.н.с. отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора, г. Москва, vniiimt34@mail.ru
Успенский Сергей Алексеевич (Uspenskiy Sergey Alekseevich), к.х.н., ведущий научный сотрудник АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», s.a.uspenskii@mail.ru
Иванов Павел Леонидович (Ivanov Pavel Leonidovich), инженер-исследователь АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», г. Москва ivanovpl@inbox.ru
Хабаров Владимир Николаевич (Khabarov Vladimir Nikolaevich), к.х.н., генеральный директор АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», info@nc-martinex.ru
Селянин Михаил Анатольевич (Selyanin Mikhail Anatolyevich), президент Группы компаний Martinex, alo@martinex.ru
ние лекарственных средств с возможным неблагоприятным воздействием на организм пациента. В этой связи токсикологическое исследование вновь разработанных гелевых материалов, предлагаемых к применению в качестве внутриопу-холевых средств, целесообразно и необходимо.
Целью токсикологических исследований явилось моделирование и оценка в эксперименте возможности использования в практической медицине нового гелевого материала «БОРГИАЛ».
Задачей исследования было изучение и оценка биологического действия вновь разработанных материалов в эксперименте, который бы наиболее близко отвечал условиям практического применения материалов, с целью экстраполяции результатов на организм человека.
Материалы и методы исследования. «БОРГИАЛ» синтезирован по методу, описанному в работе [8]. Состав геля (% масс.): ГК (натриевая соль) производства SHISEIDO CO., LTD KAKEGAWA FACTORY, Япония - 0,1-0,5; сополимер ГК с кислотой борной 10В в соотношении 1:1 (доля стабильного изотопа бора 10В в борной кислоте 97-99,6°/о) производства В/О «ИЗОТОП» (код продукта 70 1331 2009) - 0,1-1,0; хлористый натрий (Ultra Pure Grade, 99,99°%) производства «Amres-co», Германия - 0,05-0,1; фосфатный буфер марки PBS pH 7,4 производства «Amresco», Германия - 1,0; вода для инъекций (ФС 42-2620-97) - до 100. Все образцы стерилизованы паровым методом в соответствии с МУ 287-113.
Токсикологические исследования включают:
- санитарно-химические испытания, где с помощью интегральных и специфических методов оценивается химическая стабильность материала, природа мигрирующих из изделий химических соединений и их потенциальная опасность;
- токсикологические исследования - эксперимент на лабораторных животных, максимально приближенный к реальным условиям клинического применения изучаемого материала, с целью получения данных о реакции организма животных на воздействие чужеродного агента; опыты in vitro;
- испытания, устанавливающие стерильность и апироген-ность материала.
Изучение токсического действия представленных на испытания материалов проведено в соответствии с документами: Стандарты серии ГОСТ Р ИСО 10993-1-2009 «Оценка биологического действия медицинских изделий»: «Ч. 1. Оценка и исследования»; «Ч. 2. Требования к обращению с животными»; ГОСТ ISO 10993-4-2011 «Ч. 4. «Исследование изделий, взаимодействующих с кровью»; ГОСТ ISO 10993-6-2011 «Ч. 6. Исследование местного действия после имплантации»; ГОСТ ISO 10993-9-2011 «Ч. 9. «Основные принципы идентификации и количественного определения потенциальных продуктов деградации»; ГОСТ ISO 10993-10-2011 «Ч. 10. исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия»; ГОСТ Р ИСО 10993-11-2009 «Ч. 11. Исследование общетоксического действия». ГОСТ ISO 10993-12-2011 «Ч. 12. Приготовление проб и контрольных образцов». ГОСТ Р ИСО 10993-18-2009 «Ч. 18. Исследование химических свойств материалов»; ГОСТ Р 52770-2007 «Изделия медицинские. Требования безопасности. Методы санитарно-химических и токсикологических испытаний». ГОСТ Р 51148-98 «Изделия
медицинские. Требования к образцам и документации, представляемым на токсикологические, санитарно-химические испытания, испытания на стерильность и пирогенность». ГФ XII. ОФС 42-0061-07. Пирогенность.
Для оценки показателей, характеризующих функциональное состояние органов и систем организма в эксперименте на крысах, использовали следующий перечень тестов: интегральные показатели (внешний вид, поведение животных, состояние кожных покровов и слизистой, шерсти, потребление пищи и воды).
Функции печени оценивались по показателям: активность аланиновой трансаминазы (АЛТ, Ед/л), аспарагиновой тран-саминазы (АСТ, Ед/л), щелочной фосфатазы (ЩФ, Ед/л), содержание креатинина (мг/дл). Рассчитывали также коэффициент де Ритиса (отношение аспарагиновой к аланиновой трансаминазе) как диагностический критерий. Выбор тестов был определён необходимостью оценить состояние систем и органов, отвечающих за метаболизм, детоксикацию и способность к элиминации чужеродных агентов. Все биохимические показатели определяли на полуавтоматическом фотометрическом анализаторе «Stat Fах 1904 Plus» в комплексе с проточной кюветой «Mosguito 2400», производства фирмы «Awareness Тейшюк^ inc», США.
Гематологические показатели периферической крови: содержание гемоглобина определяли на анализаторе «Stat Fах 1904 Plus», подсчет числа эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови проводили при помощи микроскопов МБИ-15, «ЛОМО», СССР и Olympus CX41RT с видеокамерой EVS color VEC-335.
Возможное аллергенное действие материалов изучали в опыте на белых нелинейных крысах с применением провокационной внутрикожной пробы и проведении серологической диагностической реакции с сывороткой крови с целью выявления наличия комплекса «антиген-антитело» в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток (РДТК) в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-1-2009 «Оценка биологического действия медицинских изделий», Ч. 1. «Оценка и исследования»; ГОСТ ISO 10993-10-2011 «Ч. 10. исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия». Приложение Е «Изучение сенсибилизирующего действия на белых крысах».
По окончании эксперимента животных умерщвляли путем декапитации, изучали гематологические и биохимические показатели крови, определяли весовые коэффициенты внутренних органов по формуле:
K = М / М
органа, мг тела, г
Статистическая обработка результатов наблюдений проводилась с использованием компьютерной программы вычисления оценки среднеквадратического отклонения результатов измерения от нормального распределения и вычисления доверительных границ погрешности результатов измерений. В таблицах с результатами испытаний приведены значения М ± m.
Результаты и обсуждение. Схема эксперимента: двухкратные подкожные инъекции материала в высшей разовой дозе - 200 мг/кг с интервалом 7 дней, через неделю внутри-брюшинное введение в той же дозе.
Изучение общетоксического, раздражающего и сенсибилизирующего действия образцов проводили в условиях
Таблица 1
Биохимические показатели сыворотки крови крыс при изучении материала «БОРГИАЛ»
КОНТРОЛЬ
Показатель АЛТ, Ед/л АСТ, Ед/л Коэффициент де Ритиса ЩФ, Ед/л Креатинин, мг/дл
м 45,33 220,38 4,86 121,12 0,57
т 3,46 14,27 0,21 7,54 0,21
ОПЫТ
м 42,27 205,70 4,87 116,95 0,47
т 3,09 13,82 0,44 18,08 0,05
Таблица 2
Гематологические показатели периферической крови крыс при изучении материала «БОРГИАЛ»
КОНТРОЛЬ
Показатель L, тыс/мкл Ег, млн/мкл НЬ, г/л Цвет показатель
М±т 6,41±0,77 5,05±0,15 159,15±4,72 0,95±0,02
ОПЫТ
М±т 7,50±1,09 5,34±0,85 171,42±9,50 0,96±0,08
Таблица 3
Масса тела и весовые коэффициенты внутренних органов крыс при изучении материала
«БОРГИАЛ»
Показатели КОНТРОЛЬ
Масса тела 241,17±11,41 236,20±9,75
Тимус 0,80±0,05 0,81±0,11
Печень 25,57±0,62 26,13±1,00
Селезёнка 3,12±0,18 3,24±0,19
Тимус/селезёнка 0,26±0,02 0,25±0,19
Почки 5,89±0,10 6,14±0,18
Масса тела 1 252,48±20,75 245,20±11,70
субхронического эксперимента на нелинейных белых крысах-самцах массой тела 200-270 граммов по 6 особей в опыте и контроле при подкожных (2 в дозе 200 мг/кг или 0,25 мл препарата/кг) и внутрибрюшинных инъекциях геля с использованием внутрикожной провокационной пробы. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили 0,9% №С1 в том же объеме.
Результаты санитарно-химических испытаний: значение рН водной вытяжки из образца «БОРГИАЛ» составило 7,27 (допустимое по ТУ изготовителя 6,50-8,40). Формальдегид в вытяжке, определяемый методом СФ, не обнаружен в пределах чувствительности определения 0,003 мг/л при допустимом значении показателя 0,100 мг/л.
Результаты токсикологических испытаний. Изучение суб-
хронической токсичности материала проводили в условиях подкожных и внутрибрюшинных введений образца «БОР-ГИАЛ» белым крысам-самцам в дозах, соответствующих терапевтическим. Контрольным животным вводили 0,9% №С1 в том же объёме. На протяжении всего эксперимента раздражающее действие не выявлено. На протяжении всего периода наблюдения не отмечено гибели опытных животных, изменений внешнего вида, поведения, потребления корма, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных. При обследовании животных с помощью лабораторных методов исследования изменений гематологических и биохимических показателей не выявлено. По результатам эксперимента с использованием провокационной внутрикожной пробы, сенсибилизирующего действия
вытяжки из образца, о наличии которого судили по РДТК, и исследуемые образцы стерильны и апирогенны. раздражающего действия на кожу не обнаружено. Наблюдение за животными через 30 мин., 1 и 24 часа после введения разрешающей дозы не выявило наличия аллергической реакции - гиперчувствительности замедленного типа. РДТК составила 0,2% при значении показателя 10-15%, рассматриваемом как слабая реакция. На вскрытии животных макроскопически не выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей подопытных животных. Образцы материала заключены в тонкие прозрачные соединительно-тканные капсулы без признаков воспаления. Весовые коэффициенты масс внутренних органов, в том числе имму-нокомпетентных (тимус, селезёнка), опытных животных, не имеют статистически достоверных отличий от аналогичных показателей контроля. Вытяжка из образца не проявила гемолитического действия в опытах in vitro с изолированными эритроцитами кроликов: гемолиз 0,07% при допустимом значении показателя менее 2%.
Результаты обследования животных с помощью лабораторных методов исследования приведены в таблицах (1-3).
Как следует из результатов, приведенных в таблицах 1, 2, обследование животных с помощью лабораторных методов не выявило отличий в изучавшихся показателях у опытных крыс по сравнению с контролем. Значения относительной массы внутренних органов опытных и контрольных крыс приведены в таблице 3.
Результаты проведённых исследований показали, что нет статистически значимых отличий от контроля в показателях, характеризующих жизненно-важные функции у животных при воздействии гелевых материалов «БОРГИАЛ». Анализируя все показатели, по которым оценивали сенсибилизирующее действие гелевых материалов: отрицательная провокационная внутрикожная проба; значения показателя дегрануляции тучных клеток, равное 0,2%, отсутствие отличий от контроля весовых коэффициентов иммунокомпетент-ных органов - тимуса и селезёнки и соотношения показателей весовых коэффициентов тимус/селезенка, можно сделать вывод о том, что изученные материалы не обладают аллергенным действием.
Заключение. Проведённые исследования не выявили изменений в гематологических, биохимических и иных показателях, характеризующих состояние систем и органов у животных, подвергавшихся воздействию исследуемых соединений, что позволяет сделать вывод о возможности применения изученных материалов для повышения эффективности нейтронного облучения при проведении нейтрон-захватной терапии радиорезистентных злокачественных опухолей. Все
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barth R.F, Solo-way A.H.. Goodman J.H., GahbauerR.A., Gupta N., Blue T.E., Yang W. and Tjarks W. Boron neutron capture therapy of brain tumors: an emerging therapeutic modality // Neurosurgery. - 1999. - Vol. 44. - P. 433-450.
2. Сиваев И.Б., Брегадзе В.И. Бор-нейтронозахватная терапия рака. Химический аспект. // Российский химический журнал. - 2004.
Т. XLVIII. - № 4. С. 109-125.
3. Toole B.P. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue // Nat. Rev. Cancer. - 2004. - Vol. 4. - P. 528-539.
4. ChoiaK.Y., Saravanakumarc G., Parkc J.H., Parka K. Hyaluronic acid-based nanocarriers for intracellular targeting: Interfacial interactions with proteins in cancer // Colloids Surf. B: Biointerfaces. -2012. - Vol. 99. - P. 82-94.
5. Stamenkovic I., AmiotM., Pesando J.M., Seed B. A lymphocyte molecule i
mplicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family // Cell. - 1989. - Vol. 56. -P. 1057-1062.
6. Stamenkovic I., Aruffo A., Amiot M., Seed B. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells // EMBO. -1991. - Vol. 10. -
P. 343-348.
7. Хабаров В.Н., Бойков П.Я.,
СелянинМ.А. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине // Практическая медицинА. М. - 2012. - 224 с. 8. Волков В.П., Зеленецкий А.Н., Иванов П.Л. и др. Способ получения борсодержащей гиалуроновой кислоты // Патент 2445978 РФ. 2012.Experimental study of biological effects of the gel material «BORGIAL»
A.V. Karamysheva1, G.V. Son1, I.A. Maklakova1, N.M. Perova1, S.A. Uspenskiy2, P.L. Ivanov2, V.N. Khabarov2, М.А. Selyanin2
'All-Russian Scientific and Research Organization for Medical Engineering. 115522, Moscow international Research Centre «Martinex», 111123, Moscow, Russian Federation
Experimental studies of the biological action of a domestic preparation based on of hyaluronic acid (HA) and boron were performed in white rats. It was established that the drug did not have adverse effects on animals. Haematological, biochemical, and other indicators characterizing the state of systems and organs in animals exposed to neutron capture therapy did not show statistically significant differences from those of the control. Based on the first stage of the studies, the use of this non-toxic compound could be suggested for solving problems of neutron capture therapy.
Key words: hyaluronic acid, boron, neutron capture therapy, toxicity.
Материал поступил в редакцию 23.04.2013 г
УДК: 614.35:[615.273:615.9]: 613.63
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ЕП К ГС З „
Ь.П. Кузьминов, ТС. Зазуляк, А.И.
ОЦЕНКА И ГИГИЕНИЧЕСКАЯ Галушка, О.И. Грушка, И.Ь. Паздерская
Л Л Я IT Д Я Я ЯМ ^^Я Я Я Л ЯМ Я Я Л Львовский национальный медицинский университет им. Данилы
И ЯМ £Ш II/■ Ь Ы Я #■ Я Я ЯЯ ЪШ Я ш Я Я ЯЯ Ж ЯЯ лл #1 Галицкого Минздрава Украины. 79010, r. Львов, Украина
ЭСЦИНАТА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Проведена токсикологическая оценка противоотечного препарата - L-лизина эсцината. Установлено, что L-лизина эсцинат относится к веществам умеренно опасным, обладает резорбтивно-токсическим и слабым местно-раздражающим эффектами при попадании на кожу, вызывает выраженное раздражение слизистих оболочек глаз, проявляет слабую кумулятивную активность, не создает реальной опасности развития отдаленных эффектов воздействия. ПДК L-лизина эсцината в воздухе рабочей зоны производственных помещений утверждена на уровне 2,0 мг/м3, аэрозоль, III класс опасности, с отметкой + «требует специальной защиты глаз».
Ключевые слова: L-лизина эсцинат, токсикологическая оценка, ПДК в воздухе рабочей зоны.
Введение. В XXI столетии успехи в разработке лекар- том числе путем создания новых лекарственных форм ственных средств связаны не только с синтезом новых с направленной доставкой к органу-мишени и контро-химических соединений, но и, в значительной степени, лируемой связью фармакона с рецептором [1, 2]. Перс улучшением свойств существующих препаратов, в спективным в разработке подобных лекарственных
Кузьминов Борис Павлович (Kuzminov Boris Pavlovich), д.м.н., проф., заведующий Центральной научно-исследовательской лабораторией и лабораторией промышленной токсикологии Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого (Украина), bkuzminov@yandex.ru. Зазуляк Татьяна Степановна (Zazulyak Tetyana Stepanovna), к.б.н., с.н.с.Центральной научно-исследовательской лаборатории и лаборатории промышленной токсикологии Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого (Украина),TetyanaZazulyak@gmail.com.
Галушка Александр Иванович (Galushka Aleksandr Ivanovich), с.н.с. Центральной научно-исследовательской лаборатории и лаборатории промышленной токсикологии Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого (Украина), toxcentr@rambler.ru.
Грушка Оксана Ивановна (Grushka Oksana Ivanovna), научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории и лаборатории промышленной токсикологии Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого (Украина), toxcentr@rambler.ru.
Паздерская Ирина Богдановна (Pazderskaya Irina Bogdanovna), научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории и лаборатории промышленной токсикологии Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого (Украина), toxcentr@rambler.ru.
