CC BY
22УДК 615.06 : 617.5
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БИОАКТИВНОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ СУСТАВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
A.В. Карамышева1, Г.В. Сон1, Н.М. Перова1, М.В. Мнихович1,
С.А. Успенский2, П.Л. Иванов2,
B.Н. Хабаров2, М.А. Селянин2
1ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийсий научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115478, г. Москва, Российская Федерация
2АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», 111123, г. Москва Российская Федерация
Проведено токсикологическое исследование биологического действия отечественного препарата (ГИАЛРИПАЙЕР-10) на основе модифицированной гиалуроновой кислоты на белых крысах. Установлено, что препарат не оказывает неблагоприятного воздействия на организм животных: гематологические, биохимические и иные показатели, характеризующие состояние систем и органов у животных, подвергавшихся воздействию исследуемых соединений, не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей контроля. На основании данного этапа исследований можно говорить о возможности использования нетоксичного соединения в реконструктивной хирургии, для замещения мягких тканей и в травматологии для замещения суставной жидкости. Также такой препарат актуально использовать в таких областях медицины как стоматология и косметология.
Ключевые слова: гиалуроновая кислота, аскорбиновая кислота, Гиалрипайер, синовиальная жидкость, артрит, травматология.
Введение. В современном мире количество людей, страдающих заболеваниями суставов, растет с каждым годом. По данным Всемирной организации здравоохранения болезнью суставов страдают около 4% населения земного шара. Самой распространенной формой поражения сустава является артроз, в индустриальных странах страдает до 90% людей старше 65 лет [1,2]. В структуре причин инвалидности в России остеоартроз занимает третье место после заболеваний сердечно-сосудистой системы и злокачественных новообразований. За последние 3 года в России заболеваемость артрозом увеличилась на 25% [3].
Отсюда профилактика, лечение и реабилитация остеоар-троза представляют собой не только медицинскую, но и социально-экономическую проблему.
В последнее время хорошо себя зарекомендовали и нашли широкое применение внутрисуставные препараты на основе гиалуроновой кислоты (ГК), которые помимо противовоспалительного, амортизирующего и обезболивающего действия обладают структурно-модифицирующим эффектом [4].
Дальнейшие исследования в области создания внутрисуставных противовоспалительных препаратов привели к созданию комплекса на основе ГК, аскорбиновой кислоты, ме-
Карамышева Анна Валериевна (Karamysheva Anna Valeriyevna), старший научный сотрудник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийсий научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115478, г Москва, vniiimt34@mail.ru
Сон Григорий Валентинович (Son Grigory Valentinovich), старший научный сотрудник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийсий научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115478, г Москва, vniiimt34@mail.ru
Перова Нина Михайловна (Perova Nina Mikhaelovna), кандидат медицинских наук, начальник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийсий научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115478, г Москва, vniiimt34@mail.ru
Мнихович Максим Валерьевич (Mnikhovich Maxim Valerievich), кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела токсикологических испытаний и исследований материалов и медицинских изделий ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора (Всероссийсий научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники), 115478, г Москва, vniiimt34@mail.ru, ведущий научный сотрудник Центральной патологоанатомической лаборатории ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН (ФГБУ НИИМЧ РАМН), 117418, г Москва, mnichmaxim@yandex.ru Успенский Сергей Алексеевич (Uspenskiy Sergey Alekseevich), кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», 111123, г Москва, s.a.uspenskii@mail.ru
Иванов Павел Леонидович (Ivanov Pavel Leonidovich), научный сотрудник АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», 111123, г Москва, ivanovpl@inbox.ru
Хабаров Владимир Николаевич (Khabarov Vladimir Nikolaevich), кандидат химических наук, генеральный директор АНО «Международный научно-исследовательский центр инновационных технологий МАРТИНЕКС», 111123, г. Москва, info@nc-martinex.ru
Селянин Михаил Анатольевич (Selyanin Mikhail Anatolyevich, президент группы компаний Мартинекс, 111123, г. Москва, alo@martinex.ru
тионина и цистеина. Такой препарат помимо выполнения функций временного эндопротезирования обладает мощной антиоксидантной защитой. Исследования показали [5,6], что совместное действие компонентов препарата обладают синер-гетическим эффектом при антиоксидантной защите.
Помимо травматологии, такой комплекс может найти широкое применение в таких областях как косметология, контурная пластика, стоматология и др.
Целью исследования являлось получение информации о возможном нежелательном воздействии такого препарата на организм человека при практическом его применении.
Задачей исследования было изучение и оценка биологического действия вновь разработанного препарата (ГИАЛРИ-ПАЙЕР-10) в эксперименте, который бы наиболее близко отвечал условиям практического применения материалов, с целью экстраполяции результатов на организм человека.
Материалы и методы исследования. Материал представляет собой прозрачное бесцветное или слегка окрашенное в голубой или желтый цвет однородное студенистое вещество на основе водного раствора гиалуроновой кислоты и сополимера гиалуроновой кислоты с аскорбилфосфатом натрия или магния, полученного методом твердофазной модификации [7], в который введены функциональные добавки в виде аминокислот. Компоненты ГИАЛРИПАЙЕР-10 и их количество приведены в таблице 1.
Материал выпускается в стеклянных шприцах или флаконах. Все образцы стерилизованы паровым методом в соответствии с МУ 287-113 или ГОСТ Р ИСО 11134.
Испытания образцов проводили с применением сани-тарно-химических и токсикологических видов их оценки. Санитарно-химические испытания проводят с помощью интегральных и специфических методов - оценивается химическая стабильность материала, природа мигрирующих из изделий химических соединений и их потенциальная опасность; устанавливающие стерильность и апи-рогенность материала. Оценка возможного токсического действия представленных на испытания материалов проводилось в соответствии с документами: ГОСТ Р ИСО 10993-
2009, ГОСТ ISO 10993-2011, ГОСТ Р 52770-2007, ГОСТ Р 51148-98. Требования к образцам и документации, представляемым на токсикологические, санитарно-химические испытания, испытания на стерильность и пирогенность». ГФ XII. ОФС 42-0061-07. Пирогенность.
Для оценки показателей, характеризующих функциональное состояние органов и систем организма в эксперименте на крысах, использовали следующий перечень тестов: интегральные показатели (внешний вид, поведение животных, состояние кожных покровов и слизистой, шерсти, потребление пищи и воды); функции печени оценивались по показателям: активность аланиновой трансаминазы (АЛТ, Ед/л), аспараги-новой трансаминазы (АСТ, Ед/л) , щелочной фосфатазы (ЩФ, Ед/л), содержание креатинина (мг/дл). Рассчитывали также коэффициент де Ритиса (отношение аспарагиновой к алани-новой трансаминазе) как диагностический критерий. Выбор тестов был определён необходимостью оценить состояние систем и органов, отвечающих за метаболизм, детоксикацию и способность к элиминации. Все биохимические показатели определяли на полуавтоматическом фотометрическом анализаторе «Stat Fах 1904 Plus» в комплексе с проточной кюветой «Mosguito 2400», производства фирмы «Awarenes ТеЛпо^у inc», США. Гематологические показатели периферической крови: содержание гемоглобина, подсчет числа эритроцитов определяли на анализаторе «Stat Fах 1904 Plus», подсчет лейкоцитов в камере Горяева при помощи микроскопов МБИ-15, «ЛОМО», СССР и Olympus CX41RT с видеокамерой EVS color VEC-335. Цветной показатель определяли с помощью СФ HITACHI U-2800, «Hitachi».
Возможное аллергенное действие материалов изучали в опыте на белых крысах с применением провокационной вну-трикожной пробы и проведении серологической диагностической реакции с сывороткой крови с целью выявления наличия комплекса «антиген-антитело» по реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК). При наличии сенсибилизирующего эффекта у испытуемого материала в месте введения аллергена образуется гиперемия, отек, папула, шелушение кожи, реакция воспламенения (воспаления), инфильтраты, некроз.
Таблица 1
Состав ГИАЛРИПАЙЕР-10
Состав, ГИАЛРИПАЙЕР-10 масс. % производство
Гиалуронат цинка 0,5-0,7 Shiseido CO., LTD Kakegawa factory, Япония
Мод. ГК с витамином С фосфат № 0,3-0,8 ТУ 9358-005-12466809-98 (ФСП 42-0093-0221-00)
Цистеин^ 0,1-0,3 Sigma-Aldrich, США
Глутатион^ 0,3-0,5 Panreac, Испания
Хлористый натрий 0,1-0,2 Amresco, Германия
Фосфатный буфер 1,0 Amresco, Германия
Вода дистиллированная до 100 ВФС 42-2619-76
Дополнительным тестом при оценке сенсибилизирующего действия служило определение коэффициента массы имму-нокомпетентных органов (тимуса и селезенки) и их соотношение. Контролем служили крысы, которым в аналогичных условиях вводили стерильный физиологический раствор. По окончании эксперимента животных умерщвляли путем дека-питации, изучали гематологические и биохимические показатели крови, определяли весовые коэффициенты внутренних органов по формуле:
К = М / М
органа, мг тела, г
Морфологическую оценку токсического и общераздражающего воздействия биоактивной композиции проводили на серийных срезах внутренних органов, залитых в парафин и окрашенных гематоксилином и эозином по стандартной методике.
Статистическая обработка результатов наблюдений проводилась с использованием компьютерной программы вычисления оценки среднеквадратического отклонения результатов измерения от нормального распределения и вычисления доверительных границ погрешности результатов измерений. В таблицах с результатами испытаний приведены значения М±т.
Результаты и обсуждение. Изучение возможного токсического действия проводили в условиях подкожной имплантации материала «ГИАЛРИПАЙЕР-10» белым крысам-самкам. Наблюдение за животными через 30 мин после введения разрешающей дозы, через 24 часа эксперимента не выявило наличия аллергической реакции - гиперчувствительности замедленного типа. На протяжении всего периода наблюдения не отмечено гибели опытных животных, изменений внешнего вида, поведения, поедаемо-сти корма, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных. При обследовании животных с помощью лабораторных методов исследования изменений гематологических и биохимических показателей не выявлено.
Результаты обследования животных с помощью лабораторных методов исследования приведены в таблицах 2, 3.
Как следует из результатов, приведенных в таблицах 2-3, обследование животных с помощью лабораторных методов не выявило отличий в изучавшихся показателях у опытных крыс по сравнению с контролем.
Значения относительной массы внутренних органов опытных и контрольных крыс приведены в таблице 4.
Как следует из результатов, приведенных в таблицах 2-4, обследование животных с помощью методов лабораторного исследования не выявило отличий в изучавшихся показателях у опытных крыс по сравнению с контролем.
По результатам эксперимента с использованием провокационной внутрикожной пробы, сенсибилизирующего действия вытяжек из образцов, о наличии которого судили по реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК), и раздражающего действия на кожу не обнаружено. РДТК составила 3,2 и 3,6% при значении показателя 10-15%, рассматриваемом как слабая реакция. На вскрытии животных макроскопически не выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей подопытных животных. Образцы материала заключены в тонкие прозрачные соединительно-тканные капсулы без признаков воспаления. Весовые коэффициенты масс внутренних органов в том числе иммунокомпетентных (тимус, селезёнка) опытных животных не имеют статистиче-
ски достоверных отличий от аналогичных показателей контроля. Вытяжки из образцов не проявили гемолитического действия в опытах «in vitro» с изолированными эритроцитами кроликов: гемолиз 0,11 и 0,15% при допустимом значении показателя менее 2%.
Результаты проведенных исследований показали, что нет различий в изученных показателях органов и систем, отвечающих за детоксикационную функцию печени и выделительную функцию почек, у животных при воздействии ГИАЛРИ-ПАЙЕР-10.
Анализируя все показатели, по которым оценивали сенсибилизирующее действие ГИАЛРИПАЙЕР-10: отрицательная провокационная внутрикожная проба; значения показателя дегрануляции тучных клеток, равные 3,2 и 3,6%, отсутствие отличий от контроля весовых коэффициентов иммунокомпе-тентных органов - тимуса и селезенки и соотношения показателей весовых коэффициентов тимус/селезенка можно сделать вывод о том, что изученный материал не обладает аллергенным действием.
Оценивая морфологическую структуру внутренних органов лабораторных животных, можно сделать следующее заключение, что ГИАЛРИПАЙЕР-10 не обладает местно раздражающим эффектом. Токсического воздействия на внутренние органы лабораторных животных не оказывает.
Заключение. Результаты проведенных исследований не выявили изменений в гематологических, биохимических и иных показателях, характеризующих состояние жизненно важных систем и органов у животных, подвергавшихся воздействию исследуемых соединений, что позволяет сделать вывод о возможности применения изученного материала по назначению. Материал гелевый на основе модифицированной гиалуроно-вой кислоты водосодержащий стерильный ГИАЛРИПАЙ-ЕР-10 ТУ 9398-004-58568834-2009, организация-изготовитель ООО «Лаборатория ТОСКАНИ» нетоксичен, стерилен, отвечает требованиям нормативной документации.
Таблица 2
Биохимические показатели сыворотки крови при изучении ГИАЛРИПАЙЕР-10
КОНТРОЛЬ
Показатель АЛТ, Ед/л АСТ, Ед/л Коэффициент де Ритиса ЩФ, Ед/л Креатинин, мг/дл
M 44,23 219,38 4,86 120,11 0,59
m 3,66 14,77 0,31 7,88 0,21
ОПЫТ Материал ГИАЛРИПАЙЕР-10
M 45,08 217,80 4,78 119,61 0,61
m 3,80 13,56 0,88 11,13 0,19
Таблица 3
Гематологические показатели периферической крови крыс при изучении ГИАЛРИПАЙЕР-10
КОНТРОЛЬ
Показатель L, тыс/мкл &, млн/мкл Hb, г/л Цветной показатель
M±m 7,31±0,87 5,65±0,25 168,13±4,12 0,95±0,01
ОПЫТ Материал ГИАЛРИПАЙЕР-10
M±m 7,50±1,09 5,34±0,85 169,03±3,12 0,95±0,02
Таблица 4
Масса тела и весовые коэффициенты внутренних органов крыс при изучении ГИАЛРИПАЙЕР-10
Показатели контроль ГИАЛРИПАЙЕР-10
Масса тела 285,50±9,50 284,06 ±8,40
Тимус 1,15±0,15 1,24±0,14
Печень 30,96±1,46 30,88±1,29
Селезёнка 2,88±0,18 2,75±0,15
Тимус/селезёнка 0,46±0,08 0,51±0,09
Почки 5,96±0,06 5,57±0,09
Масса тела 1 286,75±10,70 285,80±10,67
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Felson D.T., Lawrence R.C., Dieppe P.A. et al. NIH Conference. Osteoarthritis: New insights. Part 1. The disease and risk factors. Annals of Internal Medicine. 2000, 133(8), 635-646.
2. Felson D.T., Lawrence R.C., Dieppe P.A. et al. NIH Conference. Osteoarthritis: New Insights. Part 2. Tritment approaches. Annals of Internal Medicine. 2000, 133(9), 726-737.
3. Фаломеева О.М., Дубинина Т.В., Логинова Е.Ю. и др. Заболеваемость населения России ревматическими заболеваниями в начале нового столетия. Терап. Архив. 2003, 75(5), 5-9.
4. Коваленко В.Н., Борткевич О.П. Остеоартроз. Практическое руководство. Морион, 2005, 592 с.
5. Listrat V, AyralX. et al. Arthroscopic
evaluation of potential structure modifying activity of hyaluronan (Hyalgan) in osteoarthritis of the knee. Osteoarthritis cartilage, 1997, 5, 153-160.
6. Хабаров В.Н., Михайлова Н.П., Селянин М.А. Оценка антиоксидантной эффективности биосоединений, перспективных для применения в
эстетической медицине.// ВЭМ. -2011. -Т. 10. -№1. -С.52-56.
7. Волков В.П. и др. Способ получения модифицированной аскорбиновой кислотой сшитой соли гиалуроновой кислоты и биоактивная композиция на её основе // Патент 2382050 РФ. 2010 г.
REFERENCES:
1. Felson D.T., Lawrence R.C.,Dieppe P.A., et al. NIH Conference. Osteoarthritis: New insights. Part 1. The disease and risk factors. Annals of Internal Medicine. 2000, 133(8), 635-646.
2. Felson D.T., Lawrence R.C.,Dieppe P.A. et al. NIH Conference. Osteoarthritis: New Insights. Part 2. Tritment approaches. Annals of Internal Medicine. 2000, 133(9), 726-737
(in Russian).
3. Falomeeva O.M, Dubinin T.V, Loginova E.J. et al. Morbidity Russia rheumatic diseases at the beginning of the new century. Therapy. Archive. 2003, 75 (5), 5-9 (in Russian).
4. Kovalenko V.N., Bortkiewicz O.P. Osteoarthritis. A practical guide. Morion, 2005, 592 p. (in Russian).
5. Listrat V Ayral X et al. Arthroscopic
evaluation of potential structure modifying activity of hyaluronan (Hyalgan) in osteoarthritis of the knee. Osteoarthritis cartilage, 1997, 5, 153-160. 6. Khabarov V.N., Mihaylova N.P., Selyanin MA.. Evaluation of antioxidant efficiency biosoedineny promising for use in aesthetic medicine. / / GAM. -2011. -Vol.10. - № 1. -P.52-56 (in Rusian).
7. Volkov. V.P et al. Patent RU 2382050 C1. Method for preparing modified ascorbic acid of cross-linked hyaluronic acid salt and based bioactive composition. 2010 (in Russian).
A.V. Karamysheva1, G.V. Son1, N.M. Perova1, M.V. Mnikhovich1, S.A. Uspenskiy2, P.L. Ivanov
V.N. Khabarov2, М.А. Selyanin2
TOXICOLOGICAL EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOSITIONS BASED ON A MODIFIED HYALURONIC ACID USED
TO TREAT AND PREVENT JOINT DISORDERS
1 Federal State Budgetary Institution «All-Russian Scientific -Research and Testing Institute of Medical Engineering», Federal Service for Surveillance in Healthcare, 115478, Moscow, Russian Federation
2 Autonomous noncommercial organization «International Research Center for Innovative Technologies MARTINEX», 111123, Russian Federation
A toxicological study was conducted of the biological action of a domestic preparation (GYALREPAIR -10) based on a modified hyaluronic acid in albino rats. It was found out that the drug has no adverse effect on the animal organism : haematological, biochemical and other indices characterizing the state of systems and organs of animals exposed to the test compounds had no statistically significant differences from similar control indicators. Based on the current stage of research we can talk about the possibility of using non-toxic compounds in reconstructive surgery to replace the soft tissue in trauma and to replace the joint fluid. This topical drug can be actually used in such areas of medicine as stomatology and cosmetology. Key words: hyaluronic acid, ascorbic acid, Gyalrepair, synovial fluid, arthritis, trauma.
Материал поступил в редакцию 21.04.2014 г
