Экспериментальное и теоретическое исследование взаимосвязи «Структура-активность» производных коричной кислоты Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2 (2010 3) 183-192

УДК 544.15:547.58

Экспериментальное и теоретическое исследование взаимосвязи «структура-активность» производных коричной кислоты

А.А. Машенцева*, Т.С. Сейтембетов

Евразийский национальный университет им.Л.Н.Гумилева, Казахстан 01008, Астана, ул. КМунайтпасова, 5 1

Received 4.06.2010, received in revised form 11.06.2010, accepted 18.06.2010

Для изучения взаимосвязи «структура-активность» исследован ряд производных коричной кислоты. С использованием современных методов проведен скрининг антирадикальной активности, для всех соединений рассчитаны эффективные коэффициенты ингибирования. Показано, что введение гидроксильного заместителя в молекулу коричной кислоты значительно повышает восстановительные свойства последней. Наличие заместителя в м-положении несколько снижает значение эффективного коэффициента ингибирования IC50. Наиболее эффективными антиоксидантами являются орто-дигидроксизамещенная кофейная и феруловая кислоты; так, по способности ингибировать DPPH-радикал кофейная кислота превосходит коричную в 3,2раза, бутилированный гидроксианизол (BHA) - в 1,6раза. Методами квантовой химии произведен расчет некоторых физико-химических параметров, определяющих восстановительные свойства молекул - потенциал ионизации (IP), энергию сродства к электрону и энтальпию диссоциации ОН-связи. Коричная кислота, не имеющая в структуре молекулы гидроксильных групп, имеет самый высокий IP, м-положение ОН-группы в гидроксикоричной кислоте, немного понижает восстановительную способность по сравнению с о-замещением. Минимальное значение IP хлорогеновой и аскорбиновой кислот подтверждает их высокий антиоксидантный статус.

Проведен корреляционный анализ экспериментальных и теоретических данных (коэффициентом достоверности R2=0,5265).

Ключевые слова: оксикоричные кислоты, антирадикальная активность, энтальпия диссоциации ОН-связи, потенциал ионизации.

Введение

Фенилпропаноиды широко распространены в лекарственных растениях. Они обладают разнообразными биологическими свойствами, что даёт основание для создания на их основе эффективных тонизирующих, иммуностимулирующих, гепатопротекторных, антибластомных, антимикробных, противо-

воспалительных препаратов. Это послужило основанием для выделения их в самостоятельную группу биологически активных соединений и нашло отражение в химической классификации лекарственных растений [1].

Для изучения механизма исследования взаимосвязи «молекулярная структура - активность» в ряду полифенольных соединений

* Corresponding author E-mail address: [email protected]

1 © Siberian Federal University. All rights reserved

различных классов нами были рассмотрены в качестве модельных систем оксипроизводные коричной кислоты.

В ряду коммерчески доступных оксико-ричных кислот нами были проведены in vitro исследования антирадикальной активности, а также выполнены квантово-химические расчеты некоторых физико-химических величин, наиболее достоверно характеризующих восстановительную активность изучаемых объектов.

HC=CH-COOH

(1) ri=r2=r3=r4=h

(2) R1=OH, R2=R3=R,,=H

(3) r1=r3=r4=h, r2=oh

(4) R2=R3=OH, R4=R1=H

(5) R1=R2=H, R3=OH, R4=OMe

HO

(7)

ВНА - бутилоксианизол (8), антиокси-дант, используемый в пищевой отрасли промышленности для замедления окисления животных топлёных жиров, солёного шпика, жевательной резинки.

Материалы и методы

коричная кислота (> 99 %), феруловая кислота (> 99 %), м-кумаровая кислота (> 98 %), кофейная (> 99 %), (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил), ABTS•+ (2,2'-азинобис-(3-

(6)

он

(8)

Нами были рассмотрены следующие производные коричной кислоты (1): о-кумаровая (2), м-кумаровая (3), кофейная (4), феруловая (5), а также наиболее распространенная в природе хлорогеновая кислота (6) (кофеил-3-хинная кислота). Причиной включения в данный ряд хлорогеновой кислоты стало исследование синергетического эффекта комбинирования в одной молекуле двух различных кислот - кофейной и хинной. Можно предположить, что данная особенность строения хлорогеновой кислоты обеспечит наиболее высокую АОА (антиоксидантная активность).

В качестве веществ сравнения были использованы:

Аскорбиновая кислота (7) - главный растворимый в воде антиоксидант.

этилтиазолин-6-сульфонат) катион-радикал (>99 %) - Fluka (Belgium), о-кумаровая кислота (> 97 %), хлорогеновая кислота (> 95 %) были получены из Sigma Aldrich (Belgium). Все остальные реактивы были аналитического качества и использовались без предварительной очистки.

Спектрофотометрические исследования проводили с применением цифрового спектрофотометра РД -303 APEL, Япония.

Взаимодействие с ABTS^+

катион радикалом

Для генерирования радикала 5 мл 14 мМ раствора ABTS (0,0385 г ABTS в 5 мл деиони-зированной воды) смешивали с 5 мл персульфата калия (0,0066 г в 5 мл деионизированной

Концентрация, мг/мл

-•-1 -в-2-а-3^-4-*-5— 6 -<-7 -8

Рис. 1. Динамика изменения антирадикальной активности исследуемых соединений по отношению к DPPH радикалу

воды). Полученную смесь оставляли на 16 ч в темном месте. Для определения антирадикальной активности 10 мкл образца, в диапазоне концентраций 0,01-1 мг/мл, добавляли к 990 мкл рабочего раствора радикала (предварительно разбавленного этанолом до значения оптической плотности 0,700±0,020 при 734 нм). Была исследована динамика ингибирования ABTS^+ катион-радикала во времени. Анализ проводился для концентрации 0,5 мг/ мл в интервале 0-15 мин.

Значения антирадикальной активности (АРА) определяли по формуле A - A

APA(%) = -0-'- ■ 100, (1)

A0

где A,, - оптическая плотность при t=0 мин и At - оптическая плотность, измеренная после

1 мин. 0

Ингибирование DPPH

(1,1-дифенил-2-пикрилгидразил)

радикала

Аликвоту исследуемого образца в диапазоне концентраций 0,01-1 мг/мл (0,1 мл) добавляли к 3 мл 6*10-5 М этанольного рас-

твора радикала. После интенсивного перемешивания растворы оставляли в темноте на 30 мин. Изменение оптической плотности регистрировали при 520 нм. АРА определяли по формуле

АРА(%) = А° ~ А ■ 100, (2)

А0

где А° - оптическая плотность исследуемого образца; А4 - оптическая плотность контрольной пробы (в отсутствие антиокс иданта).

Результаты и обсуждение

Антирадикальная активность исследуемых кислот была излчена по отношению к DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) радикалу и ABTS•+ (2,2'-азиноб и с-(3 -этилтиазолин-6-сульфонат) катион радикалу.

На рис. 1 приведены графические зависимости изменения антирадикальной активности в диапазоне концентраций (0,011,0 мг/мл).

Как видно из представленных данных, изменение АРА носит концентрационный характер для всех изучаемых соединений и равномерно увеличивается при увеличении

концентрации вводимого восстановителя. Однако для вещества стандарта - аскорбиновой кислоты - максимальное значение АРА наблюдается при концентрации 0,25 мг/мл, дальнейшее увеличение количества аскорбиновой кислоты приводит к понижению показателя АРА. Это вполне хорошо согласуется с данными о возможном проявлении проокси-дантных свойств витамина С при избыточном количестве [2].

На основании полученных данных нами был произведен расчет эффективного коэффициента ингибирования 1С50, указывающего минимальное количество антиоксиданта, необходимого для ингибирования 50 % радикала в реакционной среде. Данные 1С50 представлены на рис. 2.

Наименьшее значение данного параметра указывает на более высокую антиокси-дантную активность.

Аналогичные исследования концентрационной зависимости были проведены с ABTS'+ катион-радикалом. Полученные данные отражены на рис. 3.

Наименьшее значение АРА для коричной кислоты, несомненно, обусловлено отсутствием гидроксильных групп в структуре молекулы. При сравнении АРА о - и м-кумаровой кислот с аналогичным показателем коричной можно предположить, что введение гидрок-

сильного заместителя в состав кислоты по -вышает восстановительные свойства, так как подвижный протон О-Н группы является первичным центром ингибирования радикала.

Наиболее наглядно о влиянии молекулярной структуры можно судить по анализу данных эффективного коэффициента ингиби-рования.

Рассчитанные значения 1С50 представле -ны на рис. 4. Расчет проводили построением корреляционной прямой типа у=кх±Ь, при этом значение коэффициента достоверности проведенной корреляции R2 находилось в интервале 0,8-0,95, что свидетельствует о высо -кой достоверности проведенной аппроксимации.

Так, наличие двух гидроксильных групп в м- и ^-положениях кофейной кислоты (4) значительно понижает 1С50 по сравнению с кумаровыми кислотами, имеющими всего одну гидроксогруппу. Хотелось бы отметить, что наличие метоксильной группировки в фе-руловой кислоте (5) оказывает благоприятное влияние на АРА. Наименьшее значение 1С50 (даже по сравнению с данными стандартных веществ) наблюдается для хлорогеновой кислоты (6), имеющей в своем составе четыре подвижных водорода гидроксильных групп.

Представлялось также интересным изучение динамики ингибирования ABTS'+

100 п

0.3

1

2

3

0.6

4 5

0.9 1.2

концентрация, мг/мл 6 7 8

Рис. 3. Динамика изменения антирадикальной активности оксикоричных кислот по отношению к АВТ8^+ радикалу.

4.24

-12

0.73 0.84 0.68 0.57 0.55 0.67 0.76

0

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Эффективный коэффициент ингибирования АВТ8*+ катион-радикала

0

5

4

3

2

1

катион-радикала во времени. Анализ проводился для концентрации 0,5 мг/мл в интервале 0-15 мин (рис. 5).

Согласно используемой методике [3] исходный раствор радикала имеет поглощение 0,70±0,02, что отчетливо регистрируется на рис. 5. Введение в реакционную среду 10 мкл антиоксиданта снижает количество радикала и понижает оптическую плотность раствора. Сильные антиоксиданты уже в начальный момент времени значительно ингибируют свободные радикалы, как это видно в случае

аскорбиновой кислоты (7). По истечении 3-4 мин все исследуемые соединения понижают оптическую плотность реакционной смеси почти в два раза, и окончательное обесцвечивание раствора происходит в интервале 12-15 мин. Дальнейшие исследования показывают стабильность значений поглощения растворов, что свидетельствует о полном ингибиро-вании имеющегося радикала.

Все изучаемые оксикоричные кислоты демонстрируют высокую антирадикальную активность, при этом значения эффективного

время, мин

— 1 -»-2^3^>-4-ж-5—-6-1-7^-8 Рис. 5. Динамика ингибирования ABTS^+ катион-радикала вовремени

коэффициента ингибирования для феруловой и хлорогеновой кислот значительно больше данного показателя стандартных веществ -ВНТ и аскорбиновой кислоты.

Представлялся интересным также анализ корреляции между данными экспериментальных исследований и теоретических расчетов.

Нами были проведены ab-initio расчеты рассмотренных выше оксикоричных кислот с использованием программного пакета Gaussian 2003 [4].

Предполагается [5], что существуют три возможных механизма реализации антиокси-дантной активности флавоноидов (ArOH) и их производных. Первый механизм обусловлен прямым переносом атома водорода от молекулы антиоксиданта на молекулу радикала (ROO') (1). Второй механизм включает непосредственный перенос электрона от антиок-сиданта к радикалу, приводящий к дальнейшему отделению протона (2) и образованию более стабильного флавоксильного радикала (ФР). Третий механизм, именуемый последовательным протонно-электронным переносом (3), может быть реализован лишь при образовании аниона (ArO"). Все вышепере-

численные механизмы могут протекать одновременно, но с различными скоростями.

RO2+ ArOH ROOH + ArO'. (3)

RO2 + ArOH ^ RO: + ArO" ^

2 (4)

ROOH + ArO'.

АЮН ArOH +;

At-O ~ + RO2 ROI + ArO ■. (5)

RO^ + H + ROOH.

Механизм (3) характеризуется энтальпией диссоциации О-Н-связи флавоноидов, в то время как (4) непосредственно связан со значением потенциала ионизации молекулы и реакционной активностью формирующегося катион-радикала (ArO^+). В последнем механизме антиоксидантная активность обуслав-лена энтальпией гетеролитического разрыва О-Н-связи и потенциалом ионизации аниона (ArO") как определяющего параметра.

Нами были проведены расчеты таких показателей, как потенциал ионизации (IP), энергия сродства к электрону (EA) и энтальпия диссоциации О-Н-связи (BDE).

Таблица 1. Физико-химические параметры исследуемых реакционных систем

№ Положение О-Н-связи IP, В EA, эВ BDE, кКал/моль

1 СОО-Н 0.361 0.223 87.835

2 о-положение 0.332 0.216 61.362

СОО-Н 159.827

3 м-положение 0.335 0.216 61.638

СОО-Н 91.832

4 С3 О-Н 60.848

С4 О-Н 0.312 0.209 65.019

СОО-Н 90.664

5 С5 О-Н 0.311 0.208 61.305

СОО-Н 136.814

6 С29 О-Н 187.471

С33 О-Н 182.598

С1 О-Н 0.246 0.209 84.253

С6 О-Н 118.288

С4 О-Н 126.658

СОО-Н 138.752

7 С6 О-Н 73.076

С7 О-Н 0.289 0.213 73.(591

С11 О-Н 79.583

С13О-Н 82.152

8 О-Н 0.306 0.179 61.538

Потенциал ионизации (1Р) и сродство к электрону (ЕА) по теореме Купманса могут быть найдены из энергий граничащих молекулярных орбиталей ВЗМО и НСМО соответственно.

Расчет энергий ВЗМО и НСМО проводили неэмпирическим методом в RHF-приближении (ограниченном Хартри-Фока) и в полноэлектронном валентно-расщепленном базисном наборе 6-31Ю@), так как известно, что B3LYP-приближение, независимо от базисного набора, занижает значения потенциалов ионизации приблизительно на 2 эВ для различных структур, в то время как HF-приближение, как считают авторы [6], дает хорошее согласие с экспериментальными данными.

В соответствии с определением энтальпию диссоциации связи (BDE) рассчиты-

вали с использованием UHF 6-31G(d,p) по формул«;

BDE = Hr + Hh - Hp, (6)

где Hr - энтальпия радикала, образованного вследствие отрыва атома водорода, Hh - энтальпия атома водорода (-0,498 a.u.), Hp - энтальпия нейтральной исходной молекулы.

В табл. 1 представлены рассчитанные физико-химические параметры исследуемых оксикоричных кислот и веществ- стандартов- аскорбиновой кислоты и ВНА.

Приведенные в таблице значения хорошо согласуются с полученными данными IC50 для ABTS^+ катион-радикала.

Потенциал ионизации определяет восстановительную активность соединения - его способность легко отдавать электрон. Корич-

4.00

0.00

y = 22.717x - 5.9121 ♦1

R2 = 0.3879 i i i i i i i

6 7 i ___^ 3

5 2

0.24

0.29

0.34

y = 2.4323x - 0.0554 R2 = 0.5265 i i в. I *3 ♦2

7 ♦ 4 6 • * 5

Р1,эВ

0.3 1Р,эВ

Рис. 6. График корреляции теоретических и экспериментальных данных изучения оксикоричных кислот: а - для соединений 1-7; б- для соединений 2-8

HO ""О HO ^O HO "O h^ ^O HO ^O H^ ^O*

Рис. 7. Схема стабилизации радикала п-оксикоричной кислоты

ная кислота, не имеющая в структуре молекулы гидроксильных групп, обладает самым высоким IP, .«-положением ОН-группы в ги-дроксикоричной кислоте, немного понижает восстановительную способность по сравнению с о-замещением. Минимальное значение IP хлорогеновой и аскорбиновой кислот подтверждает их высокий антиоксидантный статус.

Для выявления взаимосвязи «структура-активность» с использованием возможностей Excel 2003 проведен сравнительный анализ экспериментальных данных IC50 для ABTS^+ катион-радикала и значениями потенциала ионизации, результаты которого представлены на рис. 6а.

Построение подобного графика позволяет определить, для какого из изучаемых соединений в большей степени соблюдается

соотношение «структура-активность». Как видно, наиболее удалена точка, соответствующая коричной кислоте, идеальное соответствие корреляции подобранных параметров наблюдается для вещества-стандарта - аскорбиновой кислоты. Также достаточно близко к прямой расположены точки (4) и (5) кофейной и феруловой кислот соответственно. Коричная кислота (1), обладающая самой низкой антирадикальной активностью, находится на самом большом расстоянии от прямой аппроксимации; в связи с этим нами дополнительно был построен аналогичный график, но без учета данных коричной кислоты (рис. 6б). Исключение коричной кислоты позволяет провести прямую с коэффициентом корреляции R2=0,5265. Все точки исследуемых кислот и веществ стандартов лежат в непосредственной близости от построенной прямой, что

0.90

8 2.00

0.50

0.24

0.28

0.32

O

указывает на правильность выбора используемых нами параметров для определения корреляции «структура-активность».

Производные оксикоричной кислоты, в которых карбоксильная группа отделена от ароматического кольца виниленовым мостиком, характеризуются более высокой антиок-сидантной активностью, чем соответствующие производные бензойной кислоты [7].

Данный факт хорошо согласуется с дополнительной стабилизацией феноксилов, образованных оксикоричными кислотами, за счет делокализации неспаренного электрона на виниленовый фрагмент (рис. 7).

Заключение

Результаты проведенных in vitro исследований антирадикальной активности, а также квантово-химических расчетов некоторых

физико-химических параметров производных коричной кислоты указывают, что введение гидроксильного заместителя в молекулу коричной кислоты значительно повышает восстановительные свойства последней. Наличие заместителя в .«-положении несколько снижает значение эффективного коэффициента ингибирования IC50. Однако наиболее эффективным антиоксидантом является орто-дигидроксизамещенная кофейная кислота; так, по способности ингибировать DPPH-радикал кофейная кислота превосходит коричную в 3,2 раза, BHA - в 1,6 раза. Высокая противоокислительная активность производных коричной кислоты обусловлена наличием в структуре молекулы виниленового компонента, который является реакционным центром и испытывает влияние заместителей бензольного кольца.

Список литературы

1. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. -М.: Мир, 1977. - С. 15-25.

2. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия // Эксперим. клин. фармакол.- 2003.- Т.66, № 4.- С.66-70.

3. Re R.; Pellegrini N.; Proteggente A.; Pannala A.; Yang M.; Rice-Evans C Free Radical Biology and Medicine. 1999. - Vol. 26 (9). - P. 1231.

4. Frisch, M. J.; TrucksG. W.; Schlegel et al. Gaussian 03, Rev B.01, Gaussian, Inc., Pittsburgh, 2003.

5. Reis M.,.Lobato B, Lameira J., Santos AS., Alves CN. A theoretical study of phenolic compounds with antioxidant properties // European Journal of Medicinal Chemistry. 2007. V.42. P.440-446.

6. Функ А.А., Коренек В.В. Индексы электрофильности монолигнолов - модельных соединений лигнина//Химия растительного сырья. 2008. №3. С. 39-44.

7. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М., 2006. - 418 с.

The Study of the "Structure-Activity" Relationship For a Cinnamic Acid Derivatives

Anastassiya A. Mashentseva and Talgat S. Seitembetov

The L.N.Gumilev Eurasian National University 5 Munaitpasov, Astana, 010008 Republic Kazakhstan;

The "structure-radical scavenging activity" relationship for some cinnamic acid derivatives was investigated. The radical scavenging activity (RSA) using modern assays were studied and the effective coefficients for all compounds were calculated. It was founded that hydroxyl group presence is increasing the reduction properties of the cinnamic acid, and the m- substitute presence is decreasing the IC50 value. The most effective antioxidants are o-dihydroxy substituted caffeic andferulic acids; it could exceed the DPPH RSA of the cinnamic acid in 3.2times, BHA - in 1.6 times. Using quantum-chemistry program some physic-chemical properties like as ionization potential (IP), electron affinity energy and O-H bond dissociation enthalpy, which can be used as an antioxidant activity descriptors were calculated. The not having any O-H group in structure cinnamic acid has the highest value of IP, m-substitution of O-H group in hydroxyl cinnamic acid is decreasing the reduction ability as compared to o-substitution. The highest antioxidant potential of the chlorogenic and ascorbic acids is confirmed by the least IP values.

The correlation analysis foe the experimental and theoretical data was searched with the confidence factor value R2=0.5265

Keywords: hydroxy cinnamic acids; radical scavenging activity; bond dissociation enthalpy;ionization potential