CC BY
4
НАУЧНЫЙ ОТДЕЛ
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ. ЛАЗЕРНАЯ ФИЗИКА
Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. 2022. Т. 22, вып. 4. С. 338-349
Izvestiya of Saratov University. Physics, 2022, vol. 22, iss. 4, pp. 338-349
https://fizika.sgu.ru https://doi.Org/0.18500/1817-3020-2022-22-4-338-349, EDN: OUMCVH
Научная статья УДК 577.3
Экспериментальное и теоретическое исследование влияния температуры на колебательные спектры коллагена в водном растворе
Г. Н. Тен1 н, А. Ю. Герасименко2, М. С. Савельев2, Н. Е. Щербакова3, М. М. Слепченков1, О.Е.Глухова1
1 Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, Россия, 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83
2Национальный исследовательский университет «Московский институт электронной техники», Россия, 124498, г. Москва, г. Зеленоград, площадь Шокина, д. 1
3Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», 410005, Россия, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46
Тен Галина Николаевна, доктор физико-математических наук, профессор кафедры радиотехники и электродинамики, TenGN@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5037-4105 Герасименко Александр Юрьевич, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Института биомедицинских систем, gerasimenko@bms.zone, https://orcid.org/0000-0001-6514-2411
Савельев Михаил Сергеевич, кандидат физико-математических наук, доцент Института биомедицинских систем, savelyev@bms.zone, https://orcid.org/0000-0003-1255-0686 Щербакова Наталья Евгеньевна, научный сотрудник лаборатории молекулярной и оперативной диагностики, hainl@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-3261-6128 Слепченков Михаил Михайлович, кандидат физико-математических наук, доцент кафедры радиотехники и электродинамики, slepchenkovm@mail.ru, https://orcid.org/org/0000-0002-4282-5629
Глухова Ольга Евгеньевна, доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой радиотехники и электродинамики, glukhovaoe@info.sgu.ru, https://orcid.org/0000-0002-5670-2058
Аннотация. Объект и предмет исследования. Проведено экспериментальное и теоретическое исследование влияния температуры на колебательные спектры водного раствора коллагена в интервале 60-90°С. Результаты исследования. Согласно выполненному эксперименту сначала при температуре 60°С наблюдается увеличение интенсивности полос поглощения ИК спектров коллагена по сравнению с комнатной температурой, а затем при дальнейшем нагревании водного раствора коллагена происходит уменьшение интенсивности полос поглощения. Для объяснения этого эффекта был использован метод молекулярного моделирования, когда в качестве основного структурного фрагмента был выбран олиго-пептид Gly-Pro-Hyp-Gly, наиболее часто повторяющийся в структуре коллагена любого типа. Выполненная интерпретация колебательных спектров выбранного молекулярного фрагмента коллагена показала качественное и количественное согласие с экспериментальными спектрами, что позволило использовать его для объяснения температурной зависимости. Выводы. Увеличение интенсивностей полос поглощения экспериментального ИК спектра коллагена при 60°С связано с изменением конформации цвиттер-ионной формы олигопептида Gly-Pro-Hyp-Gly, возникающей за счет поворота биполярных групп N+Н3 и СОО" относительно друг друга. Дальнейшее повышение температуры приводит к понижению рН среды и, как
© Тен Г. Н., Герасименко А. Ю., Савельев М. СЩербакова Н. Е, Слепченков М. М., Гпухова О. Е, 2022
следствие, к образованию в водном растворе протонированных ионных форм Gly, расположенных на концах молекулярного фрагмента Gly-Pro-Hyp-Gly, что подтверждается расчётом теоретических спектров и их сравнением с экспериментом.
Ключевые слова: коллаген, моделирование ИК и КР спектров, водный раствор, конформеры, зависимость колебательных спектров от температуры
Благодарности: Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках государственного задания (проект № FSRR-2020-0004).
Для цитирования: Тен Г. Н., Герасименко А. Ю., Савельев М. С., Щербакова Н. Е., Слепченков М. М., Глухова О. Е. Экспериментальное и теоретическое исследование влияния температуры на колебательные спектры коллагена в водном растворе // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. 2022. Т. 22, вып. 4. С. 338-349. https://doi.Org/0.18500/1817-3020-2022-22-4-338-349, EDN: OUMCVH
Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY4.0)
Experimental and theoretical study of the effect of temperature on collagen in aqueous solution
G. N. Ten1 H, A. Yu. Gerasimenko2 M. S. Savelyev2, N. E. Shcherbakova3, M. M. Slepchenkov1, O. E. Glukhova1
Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia
2National Research University "Moscow Institute of Electronic Technology", 1 Shokin Square, Zelenograd, Moscow 124498, Russia 3Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", 46 Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia
Galina N. Ten1, TenGN@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5037-4105
Aleksandr Yu. Gerasimenko2, gerasimenko@bms.zone, https://orcid.org/org/0000-0001-5037-4105
Mikhail S. Savelyev2, savelyev@bms.zone, https://orcid.org/org/0000-0003-1255-0686
Natalia E. Shcherbakova3, hainl@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-3261-6128
Mikhail M. Slepchenkov1, slepchenkovm@mail.ru, https://orcid.org/org/0000-0002-4282-5629
Olga E. Glukhova1, glukhovaoe@info.sgu.ru, https://orcid.org/0000-0002-5670-2058
Abstract. Background and Objectives: An experimental and theoretical study of the effect of temperature on the vibrational spectra of an aqueous collagen solution in the range of 60-90°C was carried out. Results: According to the performed experiment, at first at a temperature of 60°C, an increase in the intensity of the absorption bands of the IR spectra of collagen is observed compared to room temperature, and then, with further heating of the aqueous collagen solution, the intensity of the absorption bands decreases. To explain this effect, a molecular modeling method was used, when the oligopeptide Gly-Pro-Hyp-Gly, the most frequently repeated in the structure of collagen of any type, was selected as the main structural fragment. The interpretation of the vibrational spectra of the selected molecular fragment of collagen showed qualitative and quantitative agreement with the experimental spectra, which made it possible to use it to explain the temperature dependence. Conclusion: An increase in the intensity of the absorption bands of the experimental IR spectrum of collagen at 60°C is associated with a change in the conformation of the zwitter-ion form of the oligopeptide Gly-Pro-Hyp-Gly, which occurs due to the rotation of the bipolar groups N+H3 and CO~ relative to each other. A further increase in temperature leads to a decrease in the pH of the medium, and, as a consequence, to the formation of protonated Gly ionic forms located at the ends of the Gly-Pro-Hyp-Gly molecular fragment in an aqueous solution, which is confirmed by the calculation of theoretical spectra and their comparison with experiment.
Keywords: collagen, modeling of IR and Raman spectra, aqueous solution, conformers, dependence of vibrational spectra on temperature Acknowledgements: This work was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation in the framework of the State Task (project No. FSRR-2020-0004).
For citation: Ten G. N., Gerasimenko A. Yu., Savelyev M. S., Shcherbakova N. E., Slepchenkov M. M., Glukhova O. E. Experimental and theoretical study of the effect of temperature on collagen in aqueous solution. Izvestiya of Saratov University. Physics, 2022, vol. 22, iss. 4, рр. 338-349 (in Russian). https://doi.org/0.18500/1817-3020-2022-22-4-338-349, EDN: OUMCVH
This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC0-BY 4.0)
Введение
Коллаген является самым распространённым белком в организме человека и животных, составляя почти одну треть от общего количества белков. Благодаря своей высокой биосовместимости и низкой иммуногенности коллаген используют в различных биомедицинских приложениях. Например, в тканевой инженерии для заживления ран, создания заменителя кожи и регенерации костной ткани [1]; в сердечно-
сосудистой регенеративной медицине и генной терапии [2, 3]; при целевой доставке лекарств [4-6]. Перспективной является разработка колла-геновых скаффолдов [7].
Такое широкое применение коллагена является следствием многообразия его различных физических и биохимических характеристик. Это, в первую очередь, термическая стабильность, механическая прочность и способность вступать в специфические взаимодействия с другими био-
молекулами. Надо отметить, что всестороннее и глубокое исследование этих и других свойств коллагена позволит не только расширить области его использования, но и сделают процесс поиска применения коллагена более целенаправленным и эффективным. Учитывая, что свойства любого молекулярного соединения определяются, главным образом, его составом и строением, целесообразно использовать для этого хорошо зарекомендовавшие себя классические методы исследования структуры, одним из которых является колебательная спектроскопия, позволяющая получать достоверную информацию о структуре молекулы, о её конформационных изменениях и о взаимодействиях между отдельными структурными фрагментами.
Для научных исследований и масштабного применения коллаген извлекают либо из живых организмов, либо создают искусственно. Так, в тканевой инженерии часто используют свиную кожу и бычьи сухожилия. На сегодняшний день обнаружено не менее 29 различных типов коллагена, среди которых наиболее исследованы коллагены I, II, III и IV типов [8]. Несмотря на такое разнообразие, молекулярная структура всех типов коллагена состоит из трёх полипептидных цепей, образующих спираль, состоящую из повторяющихся в характерной последовательности фрагментов Gly-X-Y, где «Gly» - это глицин. На месте «Х» и «Y» могут быть любые аминокислотные остатки (кроме триптофана), но чаще всего здесь располагаются пролин (Pro) и гидроксипролин (Hyp), т. е. Gly, Pro, Hyp являются основными аминокислотами, составляющими молекулу коллагена [9].
Надо отметить, что колебательные спектры различных типов коллагена были изучены, главным образом, экспериментальными методами [10-14]. Была показана роль водородной связи Pro...Gly (C=O...NH) и дана оценка её прочности через изменение термодинамического потенциала Гиббса AG°, величина которого лежит в пределах от —1.4 до —2.0 ккал/моль [15, 16]. Анализ Фурье-ИК спектров коллагена II типа, выделенного из кожи парусной рыбы (PSC), показал, что валентному колебанию связи NH отвечают полосы поглощения в области 3423, 3337 см—1 (Амид А) и 2928, 2924 см—1 (Амид В) соответственно. Полосы поглощения Амид I для PSC лежат в области 1600-1700 см—1, а полосы поглощения Амид II и Амид III - в области 15491560 и 1240 см—1. Аналогичные проявления, характерные для колебаний типа Амид, можно
наблюдать и для других биоматериалов, используемых для выделения коллагена II типа, обширный материал по исследованию ИК спектров которых представлен в работе [14].
При расчёте колебательных спектров коллагена авторы работ [17-20] использовали модельные расчёты фрагментов коллагена, таких как Gly-Hyp-Pro-Ala или (Pro-Hyp-Gly)io с заменой Gly на Ala с целью анализа и интерпретации полос поглощения в области ^1400-1700 см-1.
Цель данной работы - выполнить экспериментальное исследование температурной зависимости ИК и КР спектров коллагена в водном растворе в интервале 60-90°С и определить влияние конформационных изменений цвиттер-ион-ной и протонированных форм олигопептида Gly-Pro-Hyp-Gly на интенсивность колебательных спектров методом молекулярного моделирования.
1. Методы и подходы
Измерение температурной зависимости спектров коллагена. Для регистрации колебательных спектров коллагена II типа готовилась его водная 2%-ная дисперсия, которая затем с помощью дозатора наносилась на предметное стекло и высушивалась при комнатной температуре. При исследовании влияния температуры на колебательные спектры коллагена было проведено облучение водной дисперсии лазерным излучением с использованием установки для лазерной сварки биотканей. Длина волны основного лазерного излучения составляла 808 нм. Нагрев контролировался, эксперимент проводился при температурах 60, 70, 80 и 90°С. Исследование проводилось с помощью Фурье-ИК спектрометра марки Nicolet iS50 (Thermo Scientific, США), оборудованного приставкой из алмазного кристалла, работающей по принципу нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Спектры КР регистрировались с помощью спектрометра марки LabRAM HR Evolution (HORIBA Scientific, Франция), оснащенного конфокальным микроскопом MPlan BX-43 с объективами разрешением 10x/0,25, 50 х/0,75 и 100 х/0,90 (Olympus, Япония). В качестве источника, генерирующего лазерное излучение, в установке имеются гелий-неоновый (Ие-№) лазер с длиной волны 633 нм (оптическая мощность - 10 мВт) и аргоновый (Аг) с перестраиваемой длиной волны на 514 и 488 нм (оптическая мощность -5 мВт).
Метод расчёта. Расчёт колебательных спектров был выполнен методом DFT на уровне B3LYP/6-31g(d,p) по программе Gaussian 09 [21]. Влияние водного раствора на ИК и КР спектры коллагена учитывалось методом самосогласованного реакционного поля SCRF. Вычисленные значения интенсивностей спектров ИК и КР приведены соответственно в «км/моль» и «А4/а. е.м».
2. Результаты и их обсуждение
Интерпретация ИК и КР спектров коллагена при комнатной температуре. Экспериментальные колебательные спектры коллагена II типа при комнатной температуре приведены на рис. 1.
В качестве структурного фрагмента, позволяющего выполнить интерпретацию колебательных ИК и КР спектров коллагена, был выбран олигопептид Gly-Pro-Hyp-Gly (модель М1), наиболее часто повторяющийся в структуре коллагена любого типа. Данный фрагмент представлен на рис. 2 с учётом того, что в нейтральном водном растворе молекулы аминокислот, в данном случае Gly, имеют цвиттер-ионую форму (N+H3-(R)-COO-).
Ранее было показано, что стабилизация цвит-тер-ионных форм аминокислот в водных растворах возможна двумя способами: либо методом SCRF, либо за счёт образования водородных связей аминокислот с молекулами воды [22].
Вычисленные методом реактивного поля (SCRF) колебательные ИК и КР спектры цвиттер-
ионной формы молекулярного фрагмента коллагена М1 приведены на рис. 3. Для адекватного сравнения вычисленных и экспериментальных спектров в теоретических ИК спектрах полуширина линий составляла 70 см"1, а в спектрах КР -20 см"1. Надо отметить, что расчёты спектров были выполнены без учета ангармонизма колебаний и влияния водородных связей, поэтому отнесение теоретических полос поглощения и линий КР было выполнено на основе анализа форм колебаний. Кроме того, это позволит в дальнейшем при моделировании спектров коллагена в температурном интервале 60-90°С учитывать его денатурацию.
Рис. 2. Цвиттер-ионная форма структурного фрагмента
коллагена Gly-Pro-Hyp-Gly (М1) (цвет online) Fig. 2. Zwitter-ionic form of the structural fragment of collagen Gly-Pro-Hyp-Gly (M1) (color online)
В высокочастотной области ^3000-4000 см-1 проявляются три полосы поглощения, формы которых отвечают валентным колебаниям
а/а
Рис. 1. Экспериментальные ИК (а) и КР (б) спектры коллагена второго типа Fig. 1. Experimental IR (a) and Raman (b) spectra of collagen of the second type
-1-1-1-1---1-1-1-I—
0 1000 2000 3000 4000 0 1000 2000 3000 4000
cm-1 cm-1
а/а б/b
Рис. 3. Вычисленные ИК (а) и КР (б) спектры фрагмента коллагена М1 (цвет online) Fig. 3. Calculated IR (a) and Raman (b) spectra of the Ml collagen fragment (color online)
связей NH, OH и CH (рис. 3, а). Поскольку цепи коллагена связаны между собой водородными связями типа NH...O, то в экспериментальных спектрах полосы, отвечающие валентным колебаниям q(NH), имеют, в отличие от теоретических спектров, существенно большую интенсивность и смещаются в низкочастотную область на ^200-300 см—1. В спектральной области ниже ^2000 см—1 проявляются колебания Амид I, Амид II и Амид III, отвечающие валентным колебаниям связей С=О, деформационным и валентным колебаниям 8(NH) и q(CN) соответственно. В области ^1000 см—1 формы колебаний характеризуются, главным образом, деформационными 8(СН) и валентными Q(CC) колебаниями Pro и Hyp колец. Аналогичное отнесение наблюдается и для линий КР (рис. 3, б).
Сравнение экспериментальных спектров коллагена и вычисленных колебательных спектров модельного фрагмента коллагена М1 показало их качественное согласие, позволяющее использовать структурный фрагмент М1 для дальнейшего рассмотрения свойств коллагена, в данном случае выяснения причины изменения интенсивности его ИК и КР спектров в зависимости от температуры.
Отметим, что характеристичность колебаний амидного фрагмента по частоте и интенсивности приводят к подобию ИК спектра коллагена со спектром альбумина [23].
Экспериментальные колебательные спектры коллагена в температурном интервале 60-90°С. Экспериментальные ИК спектры коллагена в зависимости от температуры приведены на рис. 4. Для объяснения температурной зависимости спектров коллагена нужно принимать во внимание следующий хорошо известный экспериментальный факт. Повышение температуры приводит к ослаблению (и в дальнейшем к разрыву) водородной связи типа СО...Н^ Данный процесс сопровождается постепенным уменьшением интенсивности полосы поглощения, отвечающей валентному колебанию связи NH, и смещению ее максимума в высокочастотную область. Но, как показывает экспериментальное исследование, в спектрах коллагена наблюдается нарушение такой монотонной зависимости: сначала при 60°С происходит рост интенсивностей всех полос поглощения ИК спектра коллагена, а затем - уменьшение (см. рис. 4).
Другой, не менее важной причиной, влияющей на изменение интенсивности полос поглощения коллагена при увеличении температуры, может быть изменение конфигурации аминокислотных остатков. Поскольку повышение температуры приводит к увеличению кислотности, т. е. понижению рН водной среды, а изоэлек-трическая точка Gly, расположенного на концах молекулярного фрагмента коллагена М1, наблюдается при р/=6, то, вероятнее всего, при повышении температуры сначала происходит из-
0.4-
с
3 0.3-
о
0.2-
с
о
с
с 01-
о
X)
о
Л 0.0-
<
' Initial collagen ■ collagen 60 °C
0 25 0,20 0.15
5
-O
<
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Wawe number (cnr1) а/а
О.ЭОп
--- collagen 80 °C —■ initial collagen
0 500 1000 ISCO 2000 2500 ЭОСО 3500 »COO 4JC0
Wawe number (cnr1) в/с
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Wawe number (cnr1) г/d
Рис. 4. Экспериментальные ИК спектры коллагена, измеренные при комнатной температуре, и их изменение при увеличении температуры от 60 до 90°С
Fig. 4. Experimental IR spectra of collagen measured at room temperature and their change with an increase in temperature
from 60 to 90°C
менение конфигурации цвиттер-ионной формы аминокислотных остатков Gly [24].
Влияние изменения конфигурации цвит-тер-ионной формы Gly на интенсивность ИК спектров. Рассмотрим, как изменение конфигурации цвиттер-ионных форм Gly влияет на интенсивность ИК полос поглощения. Ранее
было показано, что в водном растворе цвиттер-ионная форма Gly может занимать разные конфигурации, отличающиеся расположением биполярных групп N+ H3 и СОО- относительно друг друга, из которых наиболее сильно отличаются две: это заторможенная (шахматная, Gly 1, рис. 5, а) и заслонённая (эклиптическая,
>4 т
а/а б/b
Рис. 5. Пространственное расположение группы N+H3 относительно связи СОО- для разных конформеров цвиттер-
ионных форм Gly: а - Gly 1; б - Gly 2 (цвет online)
Fig. 5. Spatial arrangement of the N+H3 group relative to the COO- bond for different conformers of zwitter-ion forms of Gly:
Gly 1 (a) and Gly 2 (b) (color online)
Gly 2, рис. 5, б). О том, что в водном растворе в результате взаимодействия с молекулами воды наблюдается изменение конфигурации Gly, отмечается также в работе [22].
На рис. 6, а приведены ИК спектры двух конформеров цвиттер-ионной формы Gly, отличающихся друг от друга поворотом группы N+H3 вокруг связи CN на 15 град. Такое изменение конфигурации Gly приводит к увеличению интенсивности всех полос поглощения (полуширина линий составляет 10 см-1). Аналогичный результат был получен для другой алифатической аминокислоты Ala (рис. 6, б).
— Gly 1 Glyî
I
II 1, i ц г
о wo woo îwo гост гнч зооо знм «то im" 1
а/а
-
i
tm i AU?
J Ï\ 1
50ft 1000 ISM Ш i ЯМ НЛО ЗИЛ «МО я'1
б/b
Рис. 6. ИК спектры двух конформеров цвиттер-ионных форм Gly (а) и Ala (б) (цвет online)
Fig. 6. IR spectra of two conformers of zwitter-ion forms Gly (a) and Ala (b) (color online)
Колебательные спектры цвиттер-ионных и протонированных форм молекулярного фрагмента Gly-Pro-Hyp-Gly. Учитывая, что второй устойчивой конфигурацией фрагмента Gly-Pro-Hyp-Gly в водном растворе является конфигурация М2 (рис. 7), отличающейся от М1 энергией в 11.5 кДж/моль и поворотом группы N+H3 вдоль связи CN на 17°, был выполнен расчёт ИК спектра молекулярного фрагмента М2 (рис. 8).
Рис. 7. Молекулярный фрагмент М2 (цвет online) Fig. 7. Molecular fragment M2 (color online)
Сравнение ИК спектров М1 и М2 подтверждает, что увеличение интенсивности полос поглощения коллагена при повышении температуры до 60°C можно объяснить, главным образом, изменением конформации цвиттер-ионной формы Gly (см. рис. 8).
Рис. 8. Вычисленные ИК спектры двух конформеров цвиттер-ионных форм молекулярных фрагментов коллагена М1 и М2
Fig. 8. Calculated IR spectra of two conformers of zwitter-ion forms of molecular fragments of collagen Ml and M2
Кроме того, в ИК спектре М2 наблюдается смещение частоты колебания q(NH) в низкочастотную область с одновременным увеличением интенсивности соответствующей полосы поглощения, а также уменьшение интенсивности полосы поглощения, отвечающей колебанию Q(CO) (см. рис. 8). Эти изменения связаны с образованием ион-дипольного взаимодействия групп N+H3 и С=О (см. рис. 7).
Дальнейшее повышение температуры приводит к понижению рН среды, и, как следствие, к образованию в водном растворе протонирован-ных ионных форм М3, М4 и М5 (рис. 9).
Энергии структурных форм М3, М4 и М5 отличаются друг от друга на 3-4 кДж/моль, что в 23 раза меньше энергии водородных связей между молекулярными группами, участвующими в образовании пептидных связей. Эти данные также соответствуют значениям энергий аналогичных протонированных конформеров Gly и Ala [22].
Были вычислены ИК спектры всех трех конформеров М3, М4 и М5. Поскольку эти спектры незначительно отличаются друг от друга, то ниже приведен ИК спектр только для М3 (рис. 10, а). Сравнение ИК спектров М1 и М3 показывает, что интенсивности полос поглощения исходного молекулярного фрагмента М1 практически во всех областях спектра незначительно, но превышают
соответствующие интенсивности фрагмента М3, кроме областей проявления валентных q(OH) и деформационных 8(ОН) колебаний. В то же время изменение конформации цвиттер-ионной формы коллагена (модель М2) приводит к существенному увеличению интенсивности полос поглощения ИК коллагена по сравнению с ИК спектрами конформеров М3, М4 и М5 и значительно лучшему согласию с экспериментом, что позволяет утверждать, что в водном растворе доминирует цвиттер-ионная форма М2 (рис. 10, б).
Для подтверждения результатов анализа ИК спектров были рассчитаны и проведено сравнение спектров КР цвиттер-ионной формы М2 и одной из моделей протонированных форм М4 (рис. 11).
Экспериментальные спектры КР показывают, что в области проявления валентных колебаний Q(C=O) повышение температуры приводит
а/а
б/b
в/c
Рис. 9. Молекулярные структуры протонированных ионных форм: а - М3, б - М4, в - М5 (цвет online) Fig. 9. Molecular structures of protonated forms M3 (a), M4 (b) and M5 (c) (color online)
12
lt> ■
&
с <н
о
2 -
0
- M2 - M5
II
i i*
JW^ \ j. i k
1000
а/а
2000
cm-
б/b
3000
4000
Рис. 10. ИК спектры молекулярных моделей М1 с М3 (а) и М2 с М5 (б) (цвет online) Fig. 10. IR spectra of molecular models M1 with M3 (a) and M2 with M5 (b) (color online)
О 1000 2000 3000 4000
cm-1
а/а б/b
Рис. 11. Экспериментальные (а) и вычисленные (б) спектры КР (цвет online) Fig. 11. Experimental (a) and calculated (b) Raman spectra (color online)
к уменьшению интенсивности линий КР и они становятся менее структурированными, а в спектральной области ~1400 см-1 температура мало влияет на интенсивность наиболее сильной линии. Интенсивность двух других сильных по интенсивности линий КР цвиттер-ионной формы для деформационных колебаний 5^Н) и 5(СН) понижается, и они сливаются в одну линию (см. рис. 11, а). Аналогичные изменения наблюдаются и для вычисленных спектров М2 и М4 (см. рис. 11, б).
Заключение
Выполнено моделирование колебательных спектров коллагена и проведено исследование их температурной зависимости в интервале 60-90°С. Для этого первоначально была выполнена экспериментальная регистрация ИК и КР спектров коллагена II типа при комнатной температуре и при температурах 60, 70, 80 и 90°С в водном растворе.
В качестве молекулярной модели был выбран фрагмент Gly-Pгo-Hyp-Gly (модель М1) как один из наиболее часто встречающихся олиго-пептидов в структуре коллагена любого типа.
Для интерпретации экспериментальных колебательных ИК и КР спектров коллагена был выполнен расчёт цвиттер-ионной формы М1 методом SCRF в гармоническом приближении. На основе интерпретации полос поглощения молекулярного фрагмента, позволяющей однозначно выполнить отнесение полос поглощения,
отвечающих колебаниям Амид I, Амид II и Амид III, было показано качественное и количественное согласие экспериментальных и теоретических спектров коллагена и фрагмента М1.
Для объяснения увеличения интенсивностей полос поглощения экспериментального ИК спектра коллагена при 60°С были вычислены колебательные спектры структурных фрагментов коллагена цвиттер-ионных форм М1 и М2 с учетом результатов влияния воды на конформаци-онные изменения цвиттер-ионной формы алифатических аминокислот Gly и Ala, приводящих к повороту биполярных групп N+H3 и СОО~ относительно друг друга.
Далее были выполнены расчёты трех прото-нированных конформеров молекулярного фрагмента Gly-Pro-Hyp-Gly, образование которых отвечает увеличению кислотности водного раствора коллагена с увеличением температуры. Вычисленные ИК спектры показывают уменьшение интенсивности полос поглощения ИК спектра в полном соответствии с экспериментом. Этот результат также подтверждается сравнением спектров КР коллагена, зарегистрированных экспериментально при комнатной температуре и при температуре выше 60°С, с вычисленными спектрами М1 и М2, причём с учётом тонкой структуры спектра.
Таким образом, выполненное моделирование колебательных спектров коллагена показало, что существенный вклад в изменение интен-сивностей ИК и КР спектров коллагена при
повышении температуры вносит конформацион-ное изменение концевых фрагментов коллагена.
Список литературы
1. Chamberlain L., Yannas I., Hsu H., Strichartz G., Spector M. Collagen-GAG substrate enhances the quality of nerve regeneration through collagen tubes up to level of autograft // Exp. Neurol. 1998. Vol. 154. P. 315-329. https://doi.org/10.1006/exnr.1998.6955
2. Ott H. C., Matthiesen T. S., Goh S.-K., Black L. D., Kren S. M., Netoff T. I., Taylor D. A. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart // Nat. Med. 2008. Vol. 14. P. 213-221. https://doi.org/10.1038/nm1684
3. Teebken O., Puschmann C., Breitenbach I., Rohde B., Burgwitz K., Haverich A. Preclinical development of tissue-engineered vein valves and venous substitutes using re-endothelialised human vein matrix // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2009. Vol. 37. P. 92-102. https:// doi.org/10.1016/j.ejvs.2008.10.012
4. Takeshita F., Hokaiwado N., Honma K., Banas A., Ochiya T. Local and systemic delivery of siRNAs for oligonucleotides therapy // Methods. Mol. Biol. 2009. Vol. 487. P. 83-92. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-547-7_4
5. Takeshita F., Ochiya T. Therapeutic potential of RNA interference against cancer // Cancer Sci. 2006. Vol. 97. P. 689-696. https://doi.org/10.1111/]'. 1349-7006.2006. 00234.x
6. Sano A., Maeda M., Nagahara S., Ochiya T., Honma K., Itoh H. Atelocollagen for protein and gene delivery // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2003. Vol. 55, № 12. P. 16511677. https://doi.org/10.1016/jj.addr.2003.08.005
7. Yang C, Hillas P. J., Baez J. A., Nokelainen M, Balan J., Tang J., Spiro R., Polarek J. W. The application of recombinant human collagen in tissue engineering // BioDrugs. 2004. Vol. 18. P. 103-119. https://doi.org/10. 2165/00063030-200418020-00004
8. Riaz T., Zeeshan R., ZarifF. A., Ilyas K., Muhammad N., Safi S. Z., Rahim A., Rizvi S. A., Rehman I. U. FTIR analysis of natural and synthetic collagen // Appl. Spectrosc. Rev. 2018. Vol. 53. P. 703-746. https://doi. org/10.1080/05704928.2018.1426595
9. Shoulders M. D., Raines R. T. Collagen structure and stability // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78. P. 929958. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.77.032207. 120833
10. Qin L., Bi J.-R., Li D.-M, Dong M., Zhao Z.-Y,, Dong X.-P., Zhou D.-Y, Zhu B.-W. Unfolding/refolding study on collagen from sea cucumber вased on 2d fourier transform infrared spectroscopy // Molecules. 2016. Vol. 21. P. 1546-1560. https://doi.org/10.3390/ molecules21111546
11. Tamilmozhi S., Veeruraj A., Arumugam M. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagen from the skin of sail?sh (Istiophorus platypterus) // Food Res. Int. 2013. P. 1499-1505. https://doi.org/10.1016/j. foodres.2013.10.002
12. Veeruraj A., Arumugam M., Ajithkumar T., Balasubramanian T. Isolation and characterization of
collagen from the outer skin of squid (Doryteuthis singhalensis) // Food Hydro-colloids. 2015. Vol. 43. P. 708-716. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2014.07. 025
13. Chen J., Li L., Y R., Xu N., Gao R., Hong B. Extraction and characterization of acid-soluble collagen from scales and skin of tilapia (Oreochromis niloticus) // LWT-Food Sci. Technol. 2016. Vol. 66. P. 453-459. https://doi.org/ 10.1016/j .lwt.2015.10.070
14. Lee J. K., Kang S. I., Kim Y. J., Kim M. J., Heu M. S., Choi B. D., Kim J. S. Comparison of collagen characteristics of sea-and freshwater-rainbow trout skin // Food Sci. Biotechnol. 2016. Vol. 25. P. 131136. https://doi.org/10.1007/s10068-016-0020-z
15. Jenkins C. L., Vasbinder M. M., Miller S. J., Raines R. T. Peptide bond isosteres: Ester or (E)-alkene in the backbone of the collagen triple helix // Org. Lett. 2005. Vol. 7. P. 2619-2622. https://doi.org/https://doi.org/10. 1021/ol050780m
16. Boryskina O. P., Bolbukh T. V., Semenov M. A., GasanA. I., Maleev V. Y. Energies of peptide-peptide and peptide-water hydrogen bonds in collagen: Evidences from infrared spectroscopy, quartz piezogravimetry, and differential scanning calorimetry // J. Mol. Struct. 2007. Vol. 827. P. 1-10. https://doi.org/10.1016/J. M0LSTRUC.2006.05.002
17. Eifler J. Q. Application of ab initio calculations to collagen and brome mosaic virus. Kansas City, Missouri, 2014. 92 p.
18. Tellez S. C. A., Pereira L., Santos L., Rajasekaran R., Favero P., Martin A. A. DFT:B3LYP/3-21G theoretical insights on the confocal Raman experimental observations in skin dermis of healthy young, healthy elderly, and diabetic elderly women // Journal of Biomedical Optics. 2016. Vol. 21 (12). P. 125002. https://doi.org/10.1117/1JB0.21.12.125002
19. Bryan M. A., Brauner J. W, Anderle G., Flach C. R., Brodsky B., Mendelsohn R. FTIR Studies of Collagen Model Peptides: Complementary Experimental and Simulation Approaches to Conformation and Unfolding // J. Am. Chem. Soc. 2007. Vol. 129. P. 78777884. https://doi.org/10.1021/ja071154i
20. Eifler J., Rulis P., Tai R., Ching W.-Y. Computational Study of a Heterostructural Model of Type I Collagen and Implementation of an Amino Acid Potential Method Applicable to Large Proteins // Polymers. 2014. Vol. 6. P. 491-514. https://doi.org/10.3390/polym6020491
21. Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B., Scuseria G. E., Robb M. A., Cheeseman J. R., Scalmani G., Barone V., Mennucci B., Petersson G. A., Nakatsuji H., Caricato M., Li X., Hratchian H. P., Izmaylov A. F., Bloino J., Zheng G., Sonnenberg J. L., Hada M., Ehara M., Toyota K., Fukuda R., Hasegawa J., Ishida M., Nakajima T., Honda Y., Kitao O., Nakai H., Vreven T., Montgomery J. A., Jr., Peralta J. E., Ogliaro F., Bearpark M., Heyd J. J., Brothers E, Kudin K. N., Staroverov V. N., Kobayashi R., Normand J., Raghavachari K., Rendell A., Burant J. C., Iyengar S. S., Tomasi J., Cossi M., Rega N., Millam J. M., Klene M., Knox J. E., Cross J. B., Bakken V., Adamo C., Jaramillo J., Gomperts R., Stratmann R. E., Yazyev O.,
Austin A. J., Cammi R., Pomelli C., Ochterski J. W., Martin R. L., Morokuma K., Zakrzewski V G., Voth G. A., Salvador P., Dannenberg J. J., Dapprich S., Daniels A. D., Farkas O., Foresman J. B., Ortiz J. V., Cioslowski J., Fox D. J. Gaussian 09. Gaussian Inc., Wallingford CT, 2009. 394 р.
22. Тен Г. Н., Щербакова Н. Е., Баранов В. И. Колебательные спектры основных аминокислот в разных фазовых состояниях. Саратов : Изд-во Саратовского университета, 2017. 188 с.
23. Тен Г. Н., Герасименко А. Ю., Щербакова Н. Е., Баранов В. И. Интерпретация ИК и КР спектров альбумина // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия : Физика. 2019. Т. 19, вып. 1. С. 43-57. https://doi.org/10.18500/1817-3020-2019-19-1-43-57
24. Хохлов В. Ю., Селеменев В. Ф., Хохлова О. Н., Загородний А. А. Ионные равновесия в растворах аминокислот при различных температурах // Вестник ВГУ. Сер. химия, биология, фармация. 2003. № 1. С. 18-22.
References
1. Chamberlain L., Yannas I., Hsu H., Strichartz G., Spector M. Collagen-GAG substrate enhances the quality of nerve regeneration through collagen tubes up to level of autograft. Exp. Neurol., 1998, vol. 154, pp. 315-329. https://doi.org/10.1006/exnr. 1998.6955
2. Ott H. C., Matthiesen T. S., Goh S. K., Black L. D., Kren S. M., Netoff T. I., Taylor D. A. Perfusion-decel-lularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med., 2008, vol. 14, pp. 213-221. https://doi.org/10.1038/nm1684
3. Teebken O., Puschmann C., Breitenbach I., Rohde B., Burgwitz K., Haverich A. Preclinical development of tissue-engineered vein valves and venous substitutes using re-endothelialised human vein matrix. Eur. J. Vasc. En-dovasc. Surg., 2009, vol. 37, pp. 92-102. https://doi.org/ 10.1016/j.ejvs.2008.10.012
4. Takeshita F., Hokaiwado N., Honma K., Banas A., Ochiya T. Local and systemic delivery of siRNAs for oligonucleotides therapy. Methods. Mol. Biol., 2009, vol. 487, pp. 83-92. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-547-7_4
5. Takeshita F., Ochiya T. Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci., 2006, vol. 97, pp. 689-696. https://doi.org/10.1111/jj.1349-7006.2006. 00234.x
6. Sano A., Maeda M., Nagahara S., Ochiya T., Honma K., Itoh H. Atelocollagen for protein and gene delivery. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2003, vol. 55, iss. 12, pp. 1651-1677. https://doi.org/10.1016/jj.addr.2003.08.005
7. Yang C., Hillas P. J., Baez J. A., Nokelainen M., Balan J., Tang, J., Spiro R., Polarek J. W. The application of recombinant human collagen in tissue engineering. BioDrugs, 2004, vol. 18, pp. 103-119. https://doi.org/10.2165/ 00063030-200418020-00004
8. Riaz T., Zeeshan R., Zarif F. A., Ilyas K., Muhammad N., Safi S. Z., Rahim A., Rizvi S. A., Rehman I. U. FTIR
analysis of natural and synthetic collagen. Appl. Spec-trosc. Rev., 2018, vol. 53, pp. 703-746. https://doi.org/ 10.1080/05704928.2018.1426595 9. Shoulders M. D., Raines R. T. Collagen structure and stability. Annu. Rev. Biochem., 2009, vol. 78, pp. 929-958. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem. 77.032207.120833
10. Qin L., Bi J. R., Li D. M., Dong M., Zhao Z. Y., Dong X. P., Zhou D. Y., Zhu B. W. Unfolding/refolding study on collagen from sea cucumber Based on 2d fourier transform infrared spectroscopy. Molecules, 2016, vol. 21, pp. 1546-1560. https://doi.org/10.3390/ molecules21111546
11. Tamilmozhi S., Veeruraj A., Arumugam M. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagen from the skin of sail?sh (Istiophorus platypterus). Food Res. Int., 2013, pp. 1499-1505. https://doi.org/10.1016/'. foodres.2013.10.002
12. Veeruraj A., Arumugam M., Ajithkumar T., Balasubra-manian T. Isolation and characterization of collagen from the outer skin of squid (Doryteuthis singhalensis). Food Hydro-colloids, 2015, vol. 43, pp. 708-716. https://doi. org/10.1016/j.foodhyd.2014.07.025
13. Chen J., Li L., Yi R., Xu N., Gao R., Hong B. Extraction and characterization of acid-soluble collagen from scales and skin of tilapia (Oreochromis niloticus). LWT-Food Sci.Technol., 2016, vol. 66, pp. 453-459. https://doi.org/ 10.1016/j.lwt.2015.10.070
14. Lee J. K., Kang S. I., Kim Y. J., Kim M. J., Heu M. S., Choi B. D., Kim J. S. Comparison of collagen characteristics of sea-and freshwater-rainbow trout skin. Food Sci. Biotechnol., 2016, vol. 25, pp. 131-136. https://doi.org/ 10.1007/s10068- 016- 0020-z
15. Jenkins C. L., Vasbinder M. M., Miller S. J., Raines R. T. Peptide bond isosteres: Ester or (E)-alkene in the backbone of the collagen triple helix. Org. Lett., 2005, vol. 7, pp. 2619-2622. https://doi.org/10.1021/ ol050780m
16. Boryskina O. P., Bolbukh T. V., Semenov M. A., Gasan A. I., Maleev V. Y. Energies of peptide-peptide and peptide-water hydrogen bonds in collagen: Evidences from infrared spectroscopy, quartz piezogravimetry, and differential scanning calorimetry. J. Mol. Struct., 2007, vol. 827, pp. 1-10. https://doi.org/10.1016AJ. MOLSTRUC.2006.05.002
17. Eifler J. Q. Application of ab initio calculations to collagen and brome mosaic virus. Kansas City, Missouri, 2014. 92 p.
18. Tellez S. C. A., Pereira L., Santos L., Rajasekaran R., Favero P., Martin A. A. DFT:B3LYP/3-21G theoretical insights on the confocal Raman experimental observations in skin dermis of healthy young, healthy elderly, and diabetic elderly women. J. Biomed. Opt., 2016, vol. 21 (12), pp. 125002. https://doi.org/10.1117/1JB0. 21.12.125002
19. Bryan M. A., Brauner J. W., Anderle G., Flach C. R., Brodsky B., Mendelsohn R. FTIR Studies of Collagen Model Peptides: Complementary Experimental and Simulation Approaches to Conformation and Unfolding. J. Am. Chem. Soc., 2007, vol. 129, pp. 7877-7884. https:// doi.org/10.1021/ja071154i
20. Eifler J., Rulis P., Tai R., Ching W. Y. Computational Study of a Heterostructural Model of Type I Collagen and Implementation of an Amino Acid Potential Method Applicable to Large Proteins. Polymers, 2014, vol. 6, pp. 491-514. https://doi.org/10.3390/polym6020491
21. Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B., Scuseria G. E., Robb M. A., Cheeseman J. R., Scalmani G., Barone V., Mennucci B., Petersson G. A., Nakatsuji H., Caricato M., Li X., Hratchian H. P., Izmaylov A. F., Bloino J., Zheng G., Sonnenberg J. L., Hada M., Ehara M., Toyota K., Fukuda R., Hasegawa J., Ishida M., Nakajima T., Honda Y., Kitao O., Nakai H., Vreven T., Montgomery J. A., Jr., Peralta J. E., Ogliaro F., Bearpark M., Heyd J. J., Brothers E., Kudin K. N., Staroverov V. N., Kobayashi R., Normand J., Raghavachari K., Rendell A., Burant J. C., Iyengar S. S., Tomasi J., Cossi M., Rega N., Millam J. M., Klene M., Knox J. E., Cross J. B., Bakken V., Adamo C., Jaramillo J., Gomperts R., Strat-mann R. E., Yazyev O., Austin A. J., Cammi R.,
Pomelli C., Ochterski J. W., Martin R. L., Morokuma K., Zakrzewski V. G., Voth G. A., Salvador P., Dannenberg J. J., Dapprich S., Daniels A. D., Farkas O., Foresman J. B., Ortiz J. V., Cioslowski J., Fox D. J. Gaussian 09. Gaussian Inc., Wallingford CT, 2009. 394 p.
22. Ten G. N., Shcherbakova N. E., Baranov V. I. Koleba-tel'nye spektry osnovnykh aminokislot v raznykh fazovykh sostoyaniyakh [Vibrational spectra of basic amino acids in different phase states]. Saratov, Izdatel'stvo Sara-tovskogo universiteta, 2017. 188 p. (in Russian).
23. Ten G. N., Gerasimenko A. Yu., Shcherbakova N. E., Baranov V. I. Interpretation of IR and Raman spectra of albumin. Izvestiya of Saratov University. Physics, 2019, vol. 19, iss. 1, pp. 43-57 (in Russian). https://doi.org/10. 18500/1817- 3020- 2019-19-1-43- 57
24. Khokhlov V. Yu., Selemenev V. F., Khokhlova O. N., Zagorodny A. A. Ionic equilibria in amino acid solutions at different temperatures. Bulletin ofVSU, Ser. chemistry, biology, pharmacy, 2003, no. 1, pp. 18-22 (in Russian).
Поступила в редакцию 09.04.2022; одобрена после рецензирования 23.04.2022; принята к публикации 23.05.2022 The article was submitted 09.04.2022; approved after reviewing 23.04.2022; accepted for publication 23.05.2022
