CC BY
16
УДК 582.28:57.083
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ ТРИАДЫ ЖЕЛЕЗА НА АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛЕКТИНОВ ЬЕШ1№Б ЕВОВЕБ
О.М. Цивилева, А.Н. Панкратов*, Е.А. Лощинина, В.Е. Никитина
(Лаборатория микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов)
Показано, что активность внеклеточных лектинов базидиомицета ЬеМтпъ вйойв8 зависит от присутствия в синтетической жидкой среде культивирования двухзаряд-ных катионов металлов. Влияние Ее2+, Со2+, №2+ на лектиновую активность изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным лигандом этиленгликолем. На начальных этапах биосинтеза лектинов влияние катионов металлов на лектиновую активность Ь. вйойв8 наиболее выражено.
Базидиомицет L. edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler], или шиитаке, — один из самых популярных культивируемых грибов. Его биомассу широко используют в качестве защитного и профилактического средства, обладающего высокой биологической активностью [1]. В развитии этих грибов важную роль играют лектины [2—4] — белки неимму-ноглобулиновой природы, способные к специфическому узнаванию и обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковален-тной структуры последних [5]. Активность внеклеточных лектинов L. edodes зависит от различных физико-химических факторов, в том числе от состава среды культивирования [6—8].
В настоящей работе исследованы эффекты двухза-рядных катионов биологически значимых металлов в составе жидкой синтетической среды культивирования, проявляющиеся в изменении активности внеклеточных лектинов L. edodes, и сделана попытка объяснить влияние катионов металлов на лектино-вую активность с позиций квантовой химии.
Экспериментальная часть
В работе использован штамм L. edodes F-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета. При глубинном культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): -глюкозу, L-арабинозу, сахарозу; источником азота служил L-аспарагин (10 ммоль/л). В качестве компонентов (добавок к среде выращивания) использовали соли металлов (0—10 ммоль/л): MgSO4.7H2O,
CaCl2 2H2O, MnCl2 4H2O, FeSO4 7H2O, CuSO4 5H2O, ZnSO4 7H2O, CoCl2 6H2O, NiSO4 6H2O, SnCl2 2H2O.
Синтетическая среда для изучения процессов хе-латообразования состояла из глюкозы (50 мМ) и аспарагина (10 мМ) с включением добавок Fe(II), Co(II), Ni(II) (4 мМ) и этиленгликоля (2 мМ или 4 мМ). Температура выращивания, как оптимальная температура роста мицелия для данного вида [9], составляла 2 6°С. Инокуляцию жидких сред осуществляли стандартными блоками, вырезанными из зоны роста колонии штамма на агаризованном пивном сусле. Лектиновую активность определяли известным методом [10], используя трипсинизированные эритроциты кролика.
Расчеты ab initio проводили по программе из пакета HyperChem [HyperChem (TM), Hypercube, Inc., 1115 NW 4th Street, Gainesville, Florida 32601, U. S. A.] с полной оптимизацией геометрии при использовании алгоритма Полака—Рибера [11]. Предварительную оптимизацию геометрии осуществляли методом PM3 [12, 13] с помощью программы из того же пакета. Квантовохимические расчеты проводили при таком условии, чтобы норма градиента не превышала 0,02 ккал/(моль'А).
Результаты определения лектиновой активности культуральной жидкости L. edodes F-249 при использовании солей девяти металлов в степени окисления +2 (М2+) представляли в виде графиков зависимости титра гемагглютинации от продолжительности выращивания. Среды выращивания с кальцием (источник углерода — глюкоза (рис. 1, а), сахароза (рис. 1, б), арабиноза (рис. 1, в)) различаются как величинами титров гемагглютинации (максимальные значения со-
* Кафедра аналитической химии и химической экологии химического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, г. Саратов
ставляют 1024 для глюкозы и арабинозы, 256 — для сахарозы), так и периодами проявления наибольшей лектиновой активности. Так, титр 1024 наблюдается при содержании Са2+ 1 ммоль/л на 9-е и 16—28-е сут культивирования в случае глюкозы и только на 21—28-е сут в случае арабинозы. Максимальная лек-тиновая активность (титр 256) на среде с сахарозой наблюдается лишь на 3-и и 5-е сут (1 ммоль/л).
Более высокое содержание магния (2 ммоль/л) способствует проявлению наибольшей для среды с этим катионом активности внеклеточных лектинов Ь. edodes Б-249 с титром гемагглютинации культураль-
Рис. 1. Зависимость титра гемагглютинации культуральной жидкости Ь. edodes¥-249 с добавкой Са2+ при использовании ,0-глюкозы (а), сахарозы (б), Ь-арабинозы (в) в качестве источника углерода от времени культивирования; концентрация Са2+, моль/л: 1 - 0; 2 - 1; 3 - 2; 4 - 4; 5 - 6; 6 - 8; 7 - 10
ной жидкости 1024 в течение самого длительного из вышеупомянутых периодов выращивания (13—28 сут).
В случае марганца, как и в случае кальция, наиболее благоприятна для проявления лектиновой активности концентрация катиона 1 мМ; возраст культуры 21—28 сут, титр не превышает 512 (единственный случай, когда эта величина титра соответствует концентрации 2 ммоль/л М2+ имеет место на 5-е сут).
Интересно, что при использовании в качестве добавки к синтетической среде культивирования Ь. edodes Б-249 двухзарядных катионов меди имела место зависимость "лектиновая активность—концентрация М2+", противоположная наблюдаемой в настоящей работе для других металлов. Наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди; титр гемагглютинации 1024 при возрасте культуры 5-е и 21—28-е сут. И если до 3 сут выращивания оптимальна концентрация 6—8 ммоль/л Си2+ (титр 256 по сравнению с 128 для 10 ммоль/л Си2+), то в течение всего периода культивирования 5—28-е сут титр гемагглютинации жидкой среды наиболее высок при 8 — 10 ммоль/л Си2+. Обсуждаемые выше для других металлов концентрации (1 и 2 ммоль/л) в случае Си2+ способствуют проявлению максимальной для этих концентраций лектиновой активности с титром 256 и 512 соответственно при возрасте культуры 21—28 сут.
Результаты исследования влияния двухзарядных катионов железа, цинка, олова, никеля и кобальта на активность внеклеточных лектинов Ь. edodes Б-249 показаны на рис. 2, 3. Максимальная лектиновая активность в случае железа и цинка характеризуется титром 128 (единственное исключение — 14-сут культура, концентрация Ме2+ 10 ммоль/л). Лектиновая активность выше в том случае, если компонентом среды является Бе2+, а не /и2+. После 3 сут выращивания увеличение концентрации катиона от 4 до 10 ммоль/л не сказывается на величине титра ге-
гу 2+
магглютинации в случае /и и приводит к снижению титра в 2 раза при возрасте культуры 14 сут на среде с железом.
При увеличении концентрации катиона металла лектиновая активность снижается. Небольшое возрастание титра (в 2 раза) можно отметить только в случае Би2+ после 10 сут выращивания. В случае Со2+ при концентрации катиона 10 ммоль/л титр гемагглютинации культуральной жидкости ниже в 4 раза, чем при концентрации 4 ммоль/л. Наибольший отрицательный эффект добавки в среду культивирования двухзарядных катионов имеет место в случае никеля: лектиновая активность проходит через максимум на 10-е сут культивирования (титр 32) при 4 ммоль/л №2+ и не проявляется совсем
Рис. 2. Зависимость титра гемагглютинации культуральной жидкости L. edodesF-249 с добавками катионов металлов М2+ (4 ммоль/л) при использовании D-глюкозы в качестве источника углерода от времени культивирования; концентрация М2+:
1 - Fe2+; 2 -
Ni2+; 3 - Zn2+; 4 - Co2+; 5 - Sn2+
Рис. 3. Зависимость титра гемагглютинации культуральной жидкости L. edodes F-249 с добавками катионов металлов М2+ (10 ммоль/л) при использовании D-глюкозы в качестве источника углерода от времени культивирования; концентрация М2+: 1 - Fe2+; 2 - Zn2+; 3 - Co2+; 4 - Sn2+
при 10 ммоль/л (по этой причине на рис. 3 отсутствует кривая для №2+).
Принимая во внимание величины титров гемаг-глютинации и продолжительность периода их существования, на основе полученных данных можно сделать вывод, что активность внеклеточных лектинов Ь. edodes Е-249 в зависимости от присутствия в синтетической жидкой среде культивирования двух-зарядных катионов металлов изменяется в ряду:
Mg Са Си Ее Мп 2п Бп Со N1.
Представляет интерес объяснение влияния катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии. Вероятный механизм положительного влияния катионов металлов на лектиновую активность состоит в том, что они образуют смешанно-
лигандные комплексы с гидроксильными группами лектинов и гликоконъюгатов, способствуя обратимому связыванию гликоконъюгатов лектинами. Почему же двухзарядные ионы железа, кобальта и никеля, составляющие ряд близких по важнейшим характеристикам катионов металлов со сходной электронной конфигурацией, так сильно различаются по своему влиянию на лектиновую активность? Скорее всего, различия в гораздо большей степени определяются термодинамикой реакций комплексообразования и прочностью связи металл—кислород, чем электростатическими предпосылками комплексообразования M2+ с кислородсодержащими лигандами.
Для проверки этого предположения мы провели квантовохимическое ab initio исследование термодинамики реакций гексааквокомплексов железа (II), кобальта (II) и никеля (II) с модельной системой — этиленгликолем как типичным хелатообра-зующим реагентом и простым аналогом углеводов. Квантовохимические расчеты проводили неограниченным методом Хартри — Фока (UHF) в базисе 3-21G(d,p) (UHF/3-21G(d,p)) [14, 15]. Корреляционные поправки к хартри—фоковским энергиям рассчитывали для оптимизированной геометрии (Single Point) в рамках теории возмущений Меллера—Плессе второго порядка (MP2) [14, 15] в том же базисе (подход MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p)). Трактовка катионов Fe2+, Co2+ и Ni2+ и комплексов с этилен-гликолем как аддуктов, содержащих молекулы воды во внутренней координационной сфере, позволяет достаточно адекватно учесть гидратацию. При расчетах принимали во внимание то, что молекулы воды и органического реагента как лиганды создают достаточно слабое поле [16], и спиновая мультиплетность смешаннолигандных комплексов такая же, как у ак-воионов [17] 5, 4 и 3 для соединений Fe(II), Co(II) и Ni(II) соответственно. В качестве примеров приведены графические образы оптимизированных методом UHF/3-21G(d,p) гексааквокомплекса никеля (II) (рис. 4) и смешаннолигандного комплекса никеля (II) с водой и этиленгликолем (рис. 5).
Возможны варианты комплексообразования с участием как ионов гидроксония, так и гидроксид-ионов. Чтобы отразить тенденцию изменения (AE) значений полной энергии молекулярных систем в ряду металлов независимо от того,покакому брут-то-уравнению протекает реакция, целесообразно представить энергетические эффекты в виде относительных величин (табл. 1). Величина АЕявляется аналогом свободной энергии (AG) реакции без учета энтропии. Использование величины AEвместо AG корректно (см., например, [18—26]). Учет электронной корреляции сглаживает, делает более реалистичными различия в AEдля разных катионов ме-
таллов. Ряд уменьшения склонности катионов к комплексообразованию с этиленгликолем Бе
2+
Со
2+
N 12+, полученный из квантовохимических
расчетов, согласуется с рядом уменьшения влияния
2+
этих катионов на лектиновую активность: Бе Со2+ N12+.
Наряду с описанным выше квантовохимическим аЬ тШо исследованием термодинамики реакций гек-сааквокомплексов Ре(П), Со(11) и N1(11) с этилен-гликолем проведено экспериментальное исследование поведения моделируемой системы. Для этого определяли в динамике лектиновую активность культураль-ной жидкости Ь. edodes в разных вариантах опыта. Во-первых, соли перечисленных металлов и этилен-гликоль вводили в состав стерильных питательных сред перед их засевом мицелием. Во-вторых, изучаемые химические добавки, стерилизованные в тонком слое, вводили в состав бесклеточной культуральной жидкости, асептически отобранной из среды выращивания Ь. edodes при возрасте культуры, характеризующемся высоким титром гемагглютинации. По-нашему мнению, активность внеклеточных лектинов ши-итаке в описанных экспериментальных условиях позволила бы судить о степени участия катионов железа, кобальта и никеля в процессах биосинтеза лектинов, предположительно опосредованных хелато-образованием с соединениями — носителями гидро-ксильных групп.
Удобно представить полученные данные в виде отношения ТГА^щ/ТГА, где ТГАайй — титр гемагглютинации в присутствии Бе2+, Со2+, N1+ или этилен-гликоля как компонентов питательной среды, ТГА — титр гемагглютинации в отсутствие этих добавок. Результаты показаны в табл. 2. Прежде всего отметим, что величины ТГАасй/ТГА равны единице для
Рис. 5. Графический образ оптимизированной методом ЦНР/3-2Ш((!,р) молекулы смешаннолигандного комплекса никеля (II) с водой и этиленгликолем [№(^0 ^(ОСНС НО) ]
всех возрастов культуры и вариантов опыта, когда к среде добавлен только этиленгликоль, что говорит об отсутствии заметного влияния последнего на лекти-новую активность и правомерности использования этого соединения в качестве модельного хелатообра-зующего реагента.
Данные, представленные в табл. 2 для разной продолжительности инкубирования бесклеточной жидкости с добавками М2+, показывают, что предполагаемое нами взаимодействие катионов металлов с лектинами, присутствующими в среде, само по себе оказывает достаточно малое влияние на активность этих белков. Отношение ТГАайй/ТГА бесклеточной жидкости равно единице во всех случаях до 3 сут инкубации. Однако к 7-м сут эта величина для Со(11) и №(11) значительно снижается (до
Рис. 4. Графический образ оптимизированной методом иНР/3-2Ш((!,р) молекулы и аквоиона [№(Н0 ^2+
Т а б л и ц а 1 Значения БЕ реакции по отношению к М = Ее
[м(н20)6]2+ + но сн2
2 6 но-сн2
0 СН2
^ I
(нрьч i + 2н30+ о-СН„
М А Е, ккал/моль
ЦНЕ/3-2Ю(а,р) МР2/3-21в(й,р)// ЦНЕ/3-210(а,р)
0 0
Со 6 33
N1 261 185
Примечания. а в квадратных скобках приведены данные для бесклеточной культуральной жидкости (см. пояснения в тексте); состав сред более подробно указан в тексте; с среда с этиленгликолем (2 ммоль/л); d среда с этиленгликолем (4 ммоль/л)
Т а б л и ц а 2
Влияние добавок к среде культивирования на лектиновую активность культуральной жидкости L. edodes F-249 (TTAad/ITA)
Добавка к среде ь Возраст культуры [продолжительность инкубирования с добавкой] сут
3 7 10 14 17 21 25
Fe(II) 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1/2 1/4 1/4
Fe(II)+EG с 1 [1] 2 [1] 1 [1] 1 [1] 1/2 1/4 1/4
Fe(II)+2EG d 2 [1] 4 [1] 1 [1] 1 [1] 1 1/2 1/2
Co(II) 1/8 [1] 1/8 [1/8] 1/16 [1/2] 1/16 [1] 1/16 1/32 1/32
Co(II)+EG 1/2 [1] 1/4 [1] 1/16 [1] 1/16 [1] 1/16 1/32 1/32
Co(II)+2EG 1 [1] 1 [1] 1/4 [1] 1/16 [1] 1/16 1/16 1/16
Ni(II) 1/32 [1] 1/64 [1/64] 1/128 [1/16] 1/128 [1/8] 0 0 0
Ni(II)+EG 1/32 [1] 1/64 [1/32] 1/128 [1/8] 1/128 [1/4] 0 0 0
Ni(II)+2EG 1/8 [1] 1/64 [1/32] 1/128 [1/8] 1/128 [1/2] 0 0 0
EG 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1 1 1
2EG 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1 [1] 1 1 1
1/8 и 1/64 ТГА соответственно) и становится одинаковой в случаях растущей культуры и бесклеточной культуральной жидкости. Несколько "исправляет" ситуацию присутствие этиленгликоля, повышая ТГАайй/ТГА в 8 раз для Со(11) и в 2 раза для
№(П), по-видимому, благодаря обратимому, протекающему в различной степени (см. выше теоретическое рассмотрение) комплексообразованию М2+. Интересно, что для большинства добавок на 14-е сут величина ТГАайй/ТГА возвращается к единице (да-
лее наблюдения не проводились, так как имело место уменьшение величины ТГА из-за естественного снижения активности лектинов во времени). При длительном инкубировании М2+ с лектинами даже Ni2+ не оказывает такого резко отрицательного влияния на ТГАайй, как при добавлении его перед инокуляцией питательной среды мицелием. По-видимому, катионы металлов участвуют в процессах биосинтеза лектинов на начальных этапах, что вполне подтверждается данными табл. 2. Наиболее благоприятны добавки Fe2+: в присутствии этих катионов этиленгликоль оказал значительное положитель-
ное влияние на лектиновую активность культуры (отношение ТГАайй/ТГА составило 4 на 7-е сут
культивирования). Наибольшая склонность к комп-лексообразованиюс содержащими гидроксогруппы соединениями именно для этого М2+ подтверждена квантовохимическими расчетами.
Таким образом, одним из факторов, влияющих на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, является присутствие в среде культивирования солей металлов в степени окисления +2. Гипотеза об обратимом связывании катионов металлов в непрочные смешаннолигандные комплексы с лектинами и гликоконъюгатами, разумно объясняющая различное влияние катионов металлов на лектино-вую активность, получила квантовохимическое обоснование на примере трех металлов (Fe, Co, Ni).
Работа поддержана грантом РФФИ № 03-04-48129.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. MolitorisH.P. // Folia Microbiol. 1994. 39. P. 91.
2. Kocourek J., Horejsi V. Lectins-Biology, Biochemistry, Clinical
Biochemistry. 3. Berlin; N.Y., 1983. P. 3.
3. JeuneK.H., Moon I.J., Kim M.K., ChungS.R. //Planta Med. 1990.
56. P. 592.
4. Цивилева О.М., Никитина В.Е., ГарибоваЛ.В. и др. //Микроби-
ология. 2000. 69. С. 38.
5. Tsivileva O.M., Nikitina V.E., GaribovaL. V., Ignatov V. V. //Intern.
Microbiol. 2001. 4. P. 41.
6. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Гарибова Л.В.
// Микробиология. 2004. 73. С. 486.
7. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. // Прикл. биохи-
мия и микробиология. 2005. 41. С. 200.
8. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н. и др. // Биотех-
нология. 2005. 2. С. 56.
9. Przybylowicz P., Donoghue J. Shiitake Growers Handbook: The Art
and Science of Mushroom Cultivation. Dubuque, 1991.
10. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. Львов, 1981.
11. Дэннис Дж., Шнабель Р. Численные методы безусловной опти-
мизации и решения нелинейных уравнений. М., 1988.
12. Stewart J.J.P. // J. Comput. Chem. 1989. 10. P. 209.
13. Stewart J.J.P. // J. Comput. Chem. 1989. 10. P. 221.
14. Hehre W.J., Radom L., Schleyer P.v.R., Pople J.A. Ab Initio Molecular Orbital Theory. N.Y., 1986.
15. Кларк Т. Компьютерная химия. Практическое руководство по
расчетам структуры и энергии молекулы. М., 1990.
16. Хьюи Дж. Неорганическая химия. Строение вещества и реакци-
онная способность. М., 1987.
17. ЛидинР.А., АндрееваЛ.Л., Молочко В.А. Справочник по неорга-
нической химии. Константы неорганических веществ. М., 1987.
18. Днепровский А. С., Темникова Т.И. Теоретические основы орга-
нической химии. Строение, реакционная способность и механизмы реакций органических соединений. Л., 1991.
19. Дьюар М. Теория молекулярных орбиталей в органической хи-
мии. М, 1972.
20. Pankratov A.N., Shchavlev A.E. // Canad. J. Chem. 1999. 77. P. 2053.
21. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. // J. Biochem. and Mol. Biol. 2000. 33. P. 37.
22. Pankratov A.N., Uchaeva I.M. // J. Mol. Struct. Theochem. 2000. 498. P. 247.
23. Pankratov A.N. // J. Mol. Struct. Theochem. 2000. 507. P. 239.
24. Pankratov A.N. // Helvetica Chim. Acta. 2004. 87. P. 1561.
25. Pankratov A.N. // Heteroatom Chemistry. 2002. 13. P. 229.
26. Shchavlev A.E., Pankratov A.N., Shalabay A. V. // J. Phys. Chem. A.
2005. 109. P. 4137.
Поступила в редакцию 13.12.05
EXPERIMENTAL AND THEORETICAL STUDIES OF THE EFFECT OF FERRUM TRIAD METAL CATIONS ON THE ACTIVITY OF EXTRACELLULAR LECTINS OF LENTINUS EDODES
O.M. Tsiviliova, A.N. Pankratov, Ye.A. Loshchinina, V. Ye. Nikitina
(Laboratory of Microbiology and Mycology, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms of RAS, Saratov)
The activity of extracellular lectins of the basidiomycete Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] has been shown to be related to the presence of definite
double-charged metal cations in the synthetic liquid medium of cultivation. The effect of
2+ 2+ 2 +
Fe , Co , Ni' on the lectin activity has been demonstrated to change with a symbate character in respect to the energies of chelating reactions of metals hexaaqua complexes with the model ligand ethylene glycol. At the initial steps of the lectins biosynthesis, the above metals cations exert the greatest influence upon the lectin activity of L. edodes.
