CC BY
99
5. Sgibneva NV, Fedorov VP. Morfofunktsional'noe sos-toyanie sensomotornoy kory posle malykh radiatsionnykh vozdeystviy: monografiya. Voronezh: IPTs "Nauchnaya kniga"; 2013. Russian.
6. Torubarov FS, Zvereva ZF. Nevrologicheskie aspekty ostroy luchevoy bolezni cheloveka (klinicheskie nablyudeniya). Maoscow; 2009. Russian.
7. Ushakov IB, Arlashchenko NI, Soldatov NI. Ekologiya cheloveka posle Chernobyl'skoy katastrofy: radiatsionnyy eko-
logicheskiy stress i zdorov'e cheloveka. Moscow-Voronezh: Izd-vo VGU; 2001. Russian.
8. Ushakov IB, Fedorov VP, Saurina OS. Radiatsionnye morfofunktsional'nye effekty mozga. Voronezh: Nauchnaya kniga; 2010. Russian.
9. Kholodova NB. Metabolicheskie i distsirkulyatornye izmeneniya v golovnom mozge v otdalennye sroki posle oblucheniya malymi dozami ioniziruyushchego izlucheniya. Zhurn. nevrologii i psikhiatrii. 2008;6:70-1. Russian.
УДК 616.832-089.819.843:57.031/.05 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПОЛНАЯ ТРАНССЕКЦИЯ СПИННОГО МОЗГА И ЕГО БИОИНЖЕНЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ И.Н.БОЛЬШАКОВ*, Ю.И.ШЕИНА**, В.А.КУЗНЕЦОВ*, А.В.ИГНАТОВ*, Г.И.КАПТЮК*, А.М.КАРАПЕТЯН*
*ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого, ул. Партизана Железняка, д. 1, г.Красноярск, Россия, 660022 **Красноярский центр репродуктивной медицины, лаборатория клеточных технологий, ул. Коломенская, 26, корп. 1, Красноярск, Россия
Аннотация. Работа представляет оригинальное исследование, посвященное клеточной и тканевой реконструкции повреждения спинного мозга у взрослых крыс с экспериментальной позвоночно-спинальной травмой. После выполнения лами-нэктомии, частичного и полного механического пересечения спинного мозга на уровне IX грудного позвонка в дефект спинного мозга имплантировано изделие медицинского назначения, содержащее бычий коллаген и крабовый хитозан, сульфатирован-ные и несульфатированные гликозаминогликаны, полную питательную среду, кондиционированную питательную среду с ней-ротрофическими факторами роста от клеток головного мозга эмбрионов мышей и эмбриональных стволовых клеток мыши, N2 нейрональную добавку, ретиноевую кислоту. Динамический неврологический статус животных показал существенное сокращение дефицита по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции в течение 20 недель постимплантационного периода. Метод иммунофлуоресценции клеток диспергатов спинного мозга и гистологических срезов подтверждает присутствие активного внедрения клеток спинного мозга крысы в имплантат, высокую жизнеспособность трансплантированных предшественников нейрональных клеток мыши в течение всего периода наблюдения, формирование через 1 неделю после трансплантации клеток нейрональной ткани с экспрессией медиаторов передачи нервного сигнала. Эти изменения в контроле сопровождаются частичным восстановлением двигательной, сенсорной и вегетативной функции спинного мозга, сокращением уровня нейродефицита, равного 5.6 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции. Трансплантация коллаген-хитозановой матрицы, содержащей 100 тыс. клеток - нейрональных предшественников приводит в течение 20 недель наблюдения к сохранению их жизнеспособности, формированию многочисленных нейронов, образующих межсинаптические связи, ранней экспрессии нейротрансмиттеров, существенным восстановлением нарушенных двигательных и чувствительных функций спинного мозга, достигая уровня сокращения нейродефицита, равного 19.5 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции.
Ключевые слова: коллаген-хитозановая подложка, предшественники нейроновБ,травма спинного мозга, нейротрансмиттеры.
EXPERIMENTAL COMPLETE TRANSECTION SPINAL CORD AND ITS BIOENGINEERING RECONSTRUCTION
I.N. BOLSHAKOV*, YU.I.SHEINA**, V.A. KUZNETSOV*, A.V. IGNATOV*, G.I. KAPTYUK*, A.M. KARAPETYAN*
Krasnoyarsk V.F. Voino-Yasenetsky State Medical University, 660022, Russia, Krasnoyarsk, street Partizan Zheleznyaka, 1 **Krasnoyarsk Center of Reproductive Medicine, Laboratory of Cellular Technologies, Russia, Moscow, Kolomna Street, 26, Bldg. 1
Abstract. The work represents the original research devoted to cellular and issue reconstruction of a spinal cord injury in adult rats with an experimental vertebral-spinal trauma. After performing a laminectomy, partial and full mechanical intersection of the spinal cord at the IX thoracic vertebrae in the spinal implanted medical devices containing bovine collagen and crab chitosan, sulfated and non-sulfated glycosaminoglycans, full nutrient medium, conditioned nutrient medium with neurotrophic factors in the growth of brain cells mouse embryos and embryonic mouse stem cells, N2 neuronal additive, retinoic acid. The dynamics neurologic status in animals has shown essential reduction of deficiency on BBB scale during 20 weeks of the postoperative period. The indirect immune-fluorescence method of a spinal cord cells and histological sections confirms presence of active introduction of cells of a parent spinal cord into implant, high viability of the replaced cells of the mouse during all period of supervision, formation in 1 week after operation of progenitor neuronal cells with expression of neurotransmitters. This change is accompanied by a partial recovery of motor, sensory and vegetative functions of the spinal cord, reduction in the level of neuro-deficit of 5, 6 points on a scale of BBB. Transplantation of collagen-chitosan matrix containing 100 thousand cells, neuronal precursors leads for 20 weeks of observation to preserve their viability, formation of numerous neurons, creating intra-synaptic correlation associated to early expression of neurotransmitters, significant restoration of motor and sensory functions of the spinal cord, reaching a level of reduction neuro-deficit equal to 19.5 points on a scale of BBB.
Key words: collagen-chitosan scaffold, neuronal precursors, spinal cord injury, neurotransmitters.
Стандарт первичной хирургической обработки осложненной позвоночно-спинальной травмы не предусматривает реконструкцию спинного мозга, включает выполнение операции укрепления позвонков и стабилизацию позвоночника относительно спинного мозга. В экспериментальной практике при постановке задачи реконструкции спинного мозга при его повреждении используют аутологичные, аллогенные или ксеногенные стволовые клетки, выделенные и культивированные из костного мозга, жировой ткани, периферической крови и других мест дислокации. При этом имплантация клеток осуществляется либо в свободном виде в качестве инъекции в место дислокации травмы спинного мозга или субарахноидально, либо клетки помещаются в гидрогелевую основу и в таком виде вводятся в место травмы после оперативного доступа через костные элементы позвоночника и обнажения спинного мозга. Результаты таких манипуляций малоудовлетворительны, характеризуются далеко неполной положительной неврологической динамикой, слабым морфологическим контролем реконструкции. Проблема спинальной травмы состоит в отсутствии эффективных сертифицированных методов реконструкции миеломаляционных очагов при спинальной травме с восстановлением анатомической и функциональной целостности проводящих путей. Предлагаемые методы реконструкции предусматривают использование нейронов в питательных средах, в том числе полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч). Использование дифференцированных дериватов недостаточно эффективно по причине их низкой массы, непродолжительной жизнеспособности, большой потери при трансляции с подложек в дислокацию травмы. Известны различные протоколы получения дифференцированных дериватов нейрональных клеток из стволовых клеток. В этих протоколах для переноса клеток с культуральных флаконов используют растворы энзимов (трипсина, коллагеназы, дес-пазы и т.п.). Эти манипуляции приводят к увеличению уровня апоптоза, клеточной гибели, повреждению поверхностных клеточных рецепторов [5]. Создание и испытание биоде-градируемых матриц, создающих благоприятные условия для культивирования и дифференцировки ЭСК, является весьма востребованной задачей. Возможность регенерации проводящих путей спинного мозга (СМ) существенно ограничена в связи с необратимыми морфологическими изменениями в нервной ткани после повреждения, особенно в каудальной ее части. За последнее время накоплены важные экспериментальные данные и ограниченный клинический материал, свидетельствующий о принципиальной возможности регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) и возможном восстановлении ее нарушенных функций в течение достаточно длительного времени, несмотря на применение модели с полным пересечением спинного мозга у экспериментальных животных [15,20,29]. Полученные научные факты позволяют предложить новые стратегии и концепции лечения повреждений СМ. Основным инструментом регенеративной медицины являются различные клеточные технологии от трансплантации клеток (клеточная терапия) до тканевой инженерии. В этом смысле речь идет о введении нейрональных клеток или их предшественников при травматическом повреждении СМ в его микроокружение на основе трехмерных биодеградируемых подложек. Перспективным направлением в регенераторной клеточной терапии можно считать трансплантацию предшественников нейрональных клеток или нейрональных стволовых клеток (НСК), которые получают из нейроэпителия эмбриона. Направленное культивирование СК приводит к их нейрональной дифференци-
ровке. Пересадка региональных НСК в СМ крыс сопровождается выживанием и интеграцией с мозгом реципиента, а также дифференцировкой в нейроны и макроглию [25,27]. Для реконструкции СМ требуются различные типы дифференцированных нейрональных клеток, а также межуточные и клеточные элементы микроглии. Временная иммунологическая изоляция предшественников нейрональных клеток с помощью вязких гелевых полисахаридных имплантатов -одно из главных условий окончательной дифференцировки и запуска аксонального роста, геномной трансформации нейронов донора для встраивания конструкции в мозговую ткань реципиента [8,14]. Достоверным контролем такой диффе-ренцировки может служить образование синапсов и межси-наптических связей с наличием в пресинаптических полостях активных форм специализированных нейромедиаторов: аспарагина, глутамата, глицина, серотонина, ацетилхолина, гамма-аминомасляной кислоты, норадреналина. Нейрональные клетки-предшественники можно получить при определенном микроокружении в условиях in vitro из ЭСК и в дальнейшем использовать в качестве собственно клеточного трансплантата. Подобные манипуляции приводят к положительной неврологической динамике и морфологическому восстановлению СМ. При этом эффект трансляции жизнеспособного пересаженного клеточного материала существенен и сопровождается дифференцировкой на 3 основных типа нейрональных клеток: нейроны, астроциты и олигоден-дроциты. Маркерный анализ подтверждает процесс ремие-линизации нервных проводников. Инъекция взвеси стволовых клеток (СК), выделенных из фетального мозга, приводит к достоверной их трансляции в зоне травмы СМ, дифферен-цировке в нейроны, астроциты и олигодендроциты и восстановлению нарушенных функций у половозрелых крыс. Такая дифференцировка клеточной массы сопровождается активизацией шванновских клеток и взаимодействием с нейрофиб-робластами. Как известно, такая межклеточная связь провоцирует процесс миелинизации аксонов, появление новых аксонов, их рост и спрутинг в дистальную культю СМ [28]. При этом морфологический инжиниринг СМ сопровождается сокращением неврологического дефицита, несмотря на использование модели полного пересечения СМ. Совершенно очевидно, что процесс инжиниринга поддерживается комплексом молекулярного микроокружения, создаваемого клетками СМ, в основе которого лежит взаимодействие ней-ротрофических факторов.
Известно, что повреждение СМ создает стойкий нейродефицит в результате демиелинизации аксонов и отсутствия аксональной регенерации, образования межсинапти-ческих связей материнских моторных и сенсорных проводников между ростральной и каудальной зонами. Однако это не означает, что регенерация нейронов невозможна, скорее препятствие к аксональному росту создается блоком системы макроглии и микроглии, и, прежде всего, астроцитами, обслуживающими регенерацию аксонов. Гиперплазия астроцитов и их взаимодействие с нейрофибробла-стами, синтез специфических белков приводит к формированию плотной глиальной сети на участке повреждения СМ. Глиальный рубец, состоящий из реактивных астроци-тов, является механическим препятствием и биохимическим барьером для аксонального роста [30]. Так называемые блокирующие молекулы вносят существенный вклад в низкую регенерацию аксонов [12]. Однако, сам по себе глиальный рубуц способен стабилизировать нежную только что образованную нейронную сеть в месте повреждения [21]. Формирование глиального рубца за счет астроцитов и эле-
ментов микроглии не только демаркирует границу со здоровой материнской тканью мозга, но и резорбирует факторы воспалителдьной реакции, снижает высокие уровни блокирующих нейромедиаторов (например, глутамата) и ряда ионов (например, К+) [26]. Формирование глиального рубца - это еще и эпицентр васкуляризации новой нервной ткани. Идея ввести извне элементы макроглии (например, за счет клеток обонятельного эпителия и предшественников нейрональных клеток) в расчете на активацию взаимодействия региональных астроцитов с нейронами явилась многообещающей в преодолении роста аксонов через глиальный рубец [13,24]. Предполагается, что имплантированные элементы макроглии способны туннелизировать в глиальном рубце ход аксональных окончаний [6,10,19] для контакта с материнскими астроцитами и снижать действие ингибиторов аксонального роста.
Таким образом, предшествующие исследования, посвященные спинальной травме, ставят задачи получения и использования, с одной стороны, аутологичной трансформированной специализированной нейрональной клеточной массы, а с другой стороны, трехмерной подложки, имеющей полное микроокружение для пролиферации, дифференцировки перенесенных клеток и формирования нейронного межуточного матрикса, готового к прямой трансплантации в спинной мозг. Хорошо известна роль хитозанового полимера как системы переноса в создании условий аксональной регенерации после спинальной травмы [9,16,17,18,30]. Использование в биодеградируемых трехмерных подложках, имплантируемых в дефект спинного мозга крыс, активных химических групп, таких как: карбоксильные (-СООН), метильные (-СН3), гидроксильные (ОН), сульфогруппы (-БО3И), аминогруппы (-ЫИ2), меркапто-группы (-БИ) влияет на ход развития нейрональных стволовых клеток (НСК), контактирующих с такими молекулами. Опыты с модифицированными стеклянными поверхностями с помощью таких химических группировок показал, что контакт НСК с -ЫИ2, -СООИ, -БИ через 5 дней инкубирования в бессывороточной среде приводит к высокой миграции НСК, экспрессии нейромаркеров: нейрофиламента, нестина, бета-тубулина III, фибриллярного глиального кислого протеина, О4, указывающих на дифференцировку НСК в нейроны, олигодендроциты и астроциты [23].
Предварительные исследования авторов настоящей работы привели к получению 4 вариантов нейрональных матриц на основе наноструктурированного хитозана, способных поддерживать длительное время стволовые клетки человека и животных (мыши) в полной питательной среде, переводить их в состояние дифференцировки с получением на 5 сутки клеток, выставляющих на своей мембране маркеры, характерные для нейрональных (нейрофиламент, МБР, вБАР) [11].
Фундаментальные и прикладные исследования в области хитина и хитозана в сфере биологии и медицины показывают четкую тенденцию прочного вхождения этих биополимеров и их химических дериватов в качестве самостоятельных конструкций, в качестве парентеральных имплантатов, выполняя функции систем переноса целевых молекул или клеток через агрессивные среды без потери их изначальной активности.
Предлагаемые в настоящей работе подходы к реконструкции спинного мозга при экспериментальной осложненной позвоночно-спинальной травме (полная механическая транссекция спинного мозга) основаны на использовании современных биодеградируемых полисахаридных мат-
риц, содержащих необходимое микроокружение, включая продукты роста и дифференцировки стволовых и нейрональных клеток, предшественники нейрональных клеток для реконструкции спинного мозга с целью восстановления его моторной и сенсорной функций. Потребительские свойства предлагаемой клеточной матрицы показали конкурирующие преимущества в силу отсутствия матриц, удовлетворяющих поставленным задачам. Они заключаются в следующем: высокая биосовместимость, биодеградация, нетоксичность, система переноса информации, создание строгой ориентации волокон инжиниринговой ткани при имплантации благодаря жесткой линейной структуре хитозана, регуляция синтеза коллагена, стимуляция размножения пассированных предшественников клеток нейрональной ткани, размножение клеток сосудистого эндотелия, новообразование микрососудов, восстановление межклеточного субстрата. Имплантация такой матрицы может быть осуществлена открытым оперативным способом в диастаз спинного мозга.
Цель исследования - получение и испытание в качестве биоинженерной подложки коллаген-хитозановой матрицы, содержащей в своем составе факторы нейрогенной дифференцировки и предшественники нейрональных клеток, при полной транссекции спинного мозга у крыс и имплантации продукта в дислокацию спинальной травмы, доказательства реконструкции мозговой ткани.
Материалы и методы исследования. Получение нейрональной матрицы. Для создания нейрональных матриц был использован базовый полиионный комплекс,
состоящий из нано-микроструктурированного аскорбата хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98%, при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, включающий солевые анионные формы хондроитинсерной (Sigma) (20 мг\г), гиалуроновой (Sigma)(10 мг\г) кислот и гепарина (5 мг\г) (Россия), сывороточного фактора роста крупного рогатого скота «адгелон» (110 мкг\г). Включение в состав коллаген-хитозанового геля гепарина и сывороточного фактора роста крупного рогатого скота "adgelon" (SLL«Endo-Pharm-A», Moscow region, Schcholkovo, Russia) повысило функциональную активность клеток. Было предположено, что культивирование на коллаген-хитозановых матрицах ЭСК мыши или человека в кондиционированной среде от мышиных эмбриональных нейрональных клеток при добавлении в среду нейрональной добавки N2 (Sigma) или B27 (Sigma), а также ретиноевой кислоты (Sigma) может приводить к нейрональной дифференцировке.
Варианты полиионных комплексов. А. К базовому по-лиионному комплексу добавляли кондиционированную питательную среду, полученную после культивирования эмбриональных нейрональных клеток мозговой ткани мышей. Б. К базовому полиионному комплексу добавляли кондиционированную питательную среду, полученную после культивирования эмбриональных аллогенных стволовых клеток мышей (The Krasnoyarsk center of reproductive medicine, Krasnoyarsk, Russia).
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получали из бластоцист мыши путем вымывания матки средой DMEM наркотизированного эфиром животного на 4-5 день после копуляции, получали внутреннюю клеточную массу (ВКМ) и производили дальнейшую экспансию колоний ЭСК. Клетки мыши метились плазмидой гена, контролирующего синтез зеленого флуоресцирующего протеина (GFP) (Vavilov Institute of the general genetics, Moscow).
Получение кондиционированной среды от культивированных нейрональных клеток эмбриона мыши. Культивирование клеток проводили в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS F0926, Sigma), 100 мкг/мл канамицина сульфата (Sigma), 1мМ L-глутамина (G7513, Sigma) во флаконах Corning, покрытых желатином (Sigma). В экспериментах по получению кондиционированной среды от нейрональных клеток эмбриона мыши (клетки из головного мозга 17-20 дневных фетусов беспородных мышей (Institut of biophisic SD RAS, Russia) после его диспергирования и обработки 0,5% раствором коллагеназы (Sigma) в течение 30 минут в среде DMEM (Sigma) при 37°С для наращивания клеточной биомассы использовали среду ДМЕМ под световой микроскопией с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина, в которую дополнительно добавляли еще 4нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF, Sigma), 1 мМ раствора незаменимых аминокислот (Sigma-Aldrich). Наращивание клеточной биомассы при 37°С проводили во флаконах, покрытых 0,1% раствором желатина. Сбор среды проводили ежедневно. Состояние клеток оценивали под световой микроскопией. После пересева с помощью 0,5% раствора коллагеназы на матрицы клетки культивировали в среде с добавлением агента нейрональной дифференцировки
- N2 компонента согласно инструкции производителя. Среду собирали, фильтровали через 0,22 мкм ацетат-целлюлозный фильтр и в дальнейшем использовали в качестве кондиционированной среды.
В дальнейшем осуществляли ковалентное соединение полученной полисахаридной гелевой конструкции (The Developer is SBEU HPT Krasnoyarsk State Medical University, Russia) с бычьим коллагеновым гелем (SLL Belkosin, Russia) в соотношении 1:3, лиофильное высушивание глубоко замороженных образцов в установке FC500 (Germany). Для этого смеси разливали по поддонам из дюраля, толщиной слоя 2 мм, замораживали до -20°С и затем лиофилизирова-ли при давлении 10-5Па в течение 8 часов, продукт упаковывали и стерилизовали электронно-лучевым способом (нейрональные сухие матрицы любезно предоставлены SLL «Medical Company Collachit», Krasnoyarsk Region, Russia). Указанные манипуляции позволили получить нейрональную матрицу размерами 50х50х2 мм, пригодную не только для культивирования и дифференцировки in vitro эмбриональных стволовых клеток в предшественники нейронов и олигодендроцитов животных и человека, но и для прямой трансплантации в разрыв спинного мозга при экспериментальной спинальной травме.
Культивирование и дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши. При использовании губчатых матриц последние предварительно замачивали в стерильном бикарбонатном буфере (Sigma) для понижения их кислотных свойств. После фазы нейтрализации коллаген-хитозановые подложки промывали трижды стерильным фосфатным буфером Dulbecco's modified eagle's medium (Biolot), помещали во флаконы, а сверху осторожно наслаивали на них суспензию клеток в среде со всеми компонентами в зависимости от типа клеток.
Эмбриональные стволовые клетки мыши. Маркерный анализ. В экспериментах по культивированию плюрипо-тентных клеток на коллаген-хитозановых подложках первоначально для наращивания биомассы использовали основную среду coDMEM (Sigma) с добавлением 10% SR (заменитель сыворотки), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина, 4нг/мл основного фактора роста фибробластов
(bFGF), 1 мМ раствор незаменимых аминокислот и ингибитора Rock киназы 5нг/мл (Sigma). Наращивание клеточной биомассы проводили во флаконах, покрытых 0,1% раствором желатина. Смену среды проводили ежедневно. Состояние колоний оценивали визуально с помощью микроскопа AxioVert-200. Для оценки поддержания состояния плюрипотентности проводили иммуноцитохимический анализ экспрессии маркеров - oct4, TRA-1-60, SSEA4, cd30 (Sigma). Для дифференцировки эмбриональных клеток в нейрональном направлении их высевали во флаконы в среду со всеми добавками, кроме bFGF, с добавлением рети-ноевой кислоты и N2 компонента.
Иммуноцитохимический контроль нейрональной диффе-ренцировки стволовых клеток. Каждые трое суток проводилась формальдегидная фиксация с последующей иммуноцитохимией клеток с помощью антител (Abcam, USA) против GFAP - глиального фибрилярного кислого белка, ней-рофиламента и нестина. Выявление маркеров осуществляли методом согласно инструкции производителя антител. Ядра клеток окрашивали DAPI (Sigma) (0,1 мкг/мл) в течение 10 мин. Для получения изображений и анализа использовали флуоресцентный микроскоп «Olympus BX-51» (Japan) и программные продукты «Applied Spectral Imaging» (USA). Для анализа каждого маркера эксперимент повторяли трижды, наращивая по три флакона, в каждом из которых случайным образом выделяли 6 зон для проведения иммуноцитохимии. Микроскопирование проводили по каждой зоне в 30 полях зрения.
Экспериментальная спинальная травма у крыс полный разрыв спинного мозга). Премедикация: за 30 мин до операции
- Sol. Tramadoli 2,5 мг в/м; Sol. Atropini sulfatis 0,1% - 0,1 мл в/м; Sol. Dimedroli 0,1% - 0,1 мл в/м. Анестезия: наркоз (ди-этиловый эфир). 18 белым беспородным крысам-самкам массой 250 г с использованием индивидуальной оптики Carl Zeiss воспроизводилась модель спинальной травмы на уровне IX грудного позвонка с полным пересечением ствола спинного мозга после предварительно выполненной лами-нэктомии. В образовавшийся дефект нервной ткани помещались нейрональная бесклеточная матрица (9 крыс) или клеточно-матричный имплантат размерами 2 мм3 (9 крыс), содержащая около 100 тыс. предшественников нейрональных клеток. Костная рана закрывалась в виде полисахаридной гидрогелевой пленки «bolchit» [22], не содержащей животного коллагена. Рану закрывали послойно.
Варианты пористых матриц-подложек предварительно перед посадкой на них эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) нарезали объемом 1мм3 или 2 мм3 и в стерильных условиях раскладывали по лункам 96-луночного планшета без покрытия 0,1% раствором желатина. Клетки с культуральных флаконов снимали 0,5% раствором коллагеназы, затем трижды отмывали средой DMEM от фермента и переносили в лунки с нарезанной матрицей в среде для ЭСК. Клетки культивировали не менее 3-х суток до появления нейрональных маркеров в гумидных условиях при 37°С и 6% СО2. Количество прикрепленных клеток оценивали путем диспергирования 5-6 кусочков матрицы в растворе фермента с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Каждый будущий нейроимплантат в процессе культивирования содержал до 100 тыс. эмбриональных стволовых клеток. Перед имплантацией кусочки микропинцетом осторожно переносили в микропробирки с питательной средой DMEM/F12 (Nutrient mixture F-12 HAM, Sigma) и транспортировали в операционную.
Послеоперационный уход. В течение 3-5 дней после опе-
рации в качестве анальгетика животные получали Sol. Tra-madoli 2,5 мг 3 раза в день в/м. Швы снимали через 10 суток. В течение первых 24 часов осуществлялся допуск животных к воде. Кормление выполняли через 48 часов после операции исключительно смесью «Polyproten-nephro» (SLL «Proten-pharma», Russia) в течение 1-4 недель. Крысы содержались в раздельных клетках. Лекарственную поддержку осуществляли антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами.
Динамический неврологический контроль. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применялась шкала оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции (BBB scale) [7] в течение 20 недель.
Гистология срезов спинного мозга при прямой имплантации клеточных нейрональных матриц в дислокацию спинальной травмы. Препараты спинного мозга получали путем тщательного и осторожного выделения ткани из позвоночного канала через 1,2,3,4 и 20 недель после операции. Спинной мозг помещали на 24 часа в 10% раствор фосфат-забуференного формалина. Далее осуществляли классическую гистологическую проводку ткани на оборудовании фирмы Leica (Germany), часть гистологических срезов окрашивали гематоксилин-эозином с целью обзорного анализа ткани в месте дислокации имплантата и в его непосредственном окружении. При обзорной микроскопии гистологических срезов (продольных, косых, поперечных) оценивали степень глиальной реакции в зоне травмы, окружающей ткани, состояние нейронов серого вещества спинного мозга. Оценивали состояние белого и серого вещества спинного мозга в 5-ти полях зрения каждого среза. Подсчитывали количество клеток макроглии (астроциты, олигодендроциты), микроглии (макрофаги) и количество клеток нейронального ряда.
Иммунофлуоресценция срезов спинного мозга при прямой имплантации клеточных нейрональных матриц в дислокацию спинальной травмы. Часть гистологических срезов подвергали иммунофлуоресцентной обработке на предмет выявления состояния имплантированной клеточной массы (поиск трансплантированных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок GFP), наличие нейротрансмиттеров в прилежащих к трансплантату верхних и нижних зонах спинного мозга, а также в собственно коллаген-хитозановом трансплантате: acetylcholine, serotonin and GABA (Abcam, USA).
Иммунофлуоресценция диспергатов спинного мозга. Детекция экспрессии маркеров (оценка способности дифференци-ровки у трансплантированных клеток). Часть препаратов спинного мозга ресуспендировали в PBS буфере, использовали для выделения клеточной массы. Клетки отмывали от фиксатора и к суспензии клеток добавляли 0,1% раствор Тритона Х100 для премеабилизации мембран. Затем отмывали 0,1% раствором Твина 20 с последующей инкубацией в этом же растворе с добавлением 2% нормальной сыворотки козы при комнатной температуре (для блокирования неспецифического связывания антител). Далее повторно отмывали последовательно растворами PBS и Twin20, после чего добавляли первичные антитела к нейрофиламенту мыши (Abcam, USA) в разведении 1:100, смесь инкубировали 1 час, затем повторно отмывали, далее добавляли раствор вторичных антител кролика с красной флуоресцентной меткой. Не связавшиеся молекулы метки отмывали трижды PBS и оценивали флуоресценцию на проточном цитометре Guava EasyCyte Mini (USA). Детекция по двум спектрам - зеленый (оценка наличия клеток с GFP), красный - наличие экспрессии нейрофиламента.
Часть выделенной клеточной массы спинного мозга подвергали формальдегидной фиксации с последующей иммуноцитохимией клеток с помощью антител (Abcam, USA) против GFAP - глиального фибрилярного кислого белка (маркер астроцитов), олигодендроцитов и енолазы нейронов, против мышиных белков для исключения появления перекрестного сигнала. Выявление маркеров осуществляли методом согласно инструкции производителя антител. Ядра клеток окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) в течение 10 мин. Для получения изображений и анализа использовали флуоресцентный микроскоп «Olympus BX-51» и программные продукты «Applied Spectral Imaging» (USA). Для анализа каждого маркера выделяли 6 зон для проведения анализа и фотодокументации. Микроскопирование проводили по каждой зоне в 30 полях зрения. Параллельно проводили поиск на этих же препаратах GFP-меченных клеток. Таким образом, производили трехцветный флуоресцентный анализ - детекция зеленого свечения - GFP, красного свечения - маркера и синего свечения - ядер клеток.
Наличие прижившихся после трансплантации клеток оценивали с помощью проточной флуориметрии в препаратах через 20 недель после имплантации. Образцы спинного мозга диспергировали в 0,5% растворе коллагеназы с PBS в течение 15-30 минут при 37°С, фильтровали через нейлоновый фильтр, далее фиксировали 1% раствором формалина с PBS и после отмывки окрашивали DAPI, производили оценку количества клеток, несущих синюю (ядра клеток) и зеленую (GFP) метку.
Результаты и их обсуждение. Поддержание плюрипо-тентности эмбриональных стволовых клеток мыши (ЭСКм). Ранее было показано, что иммуноцитохимическое исследование маркеров плюрипотентности в ЭСК, культивируемых на матрице, подтверждает, что клетки экспрессируют ядерные белки oct-4, TRA1-60, cd30 и антиген SSEA4 [4]. Предложенные режимы культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши после соответствующей подготовки биодеградируемых матриц позволяют повысить качество и стабильность культивирования, исключить на конечном этапе получения клеточной матрицы обработку клеток ферментами в процессе пассирования при смене питательной среды, повысить прикрепление клеток к поверхности матрицы, а, следовательно, предупредить их потерю при пересеве на питательные среды благодаря присутствию в ней хитозанового биополимера, обеспечить получение клеточной матрицы, пригодной для прямой трансплантации. Добавление в базовый полиионный коллаген-хитозановый комплекс кондиционированной среды от эмбриональных нейрональных клеток мышей или кондиционированной среды от культивируемых предшественников нейрональных клеток мыши, или компонента N2 и рети-ноевой кислоты приводит к нейрональной дифференци-ровке как ЭСК мыши, так и ЭСК человека. Анализ экспрессии одного из нейрональных маркеров - нейрофиламента показал, что на первые сутки отсутствуют сигналы флуоресценции по указанному маркеру. На 5 сутки при культивировании ЭСК в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками среде обнаруживается экспрессия нейрофиламента, а на 7 сутки - и в клетках, культивируемых в среде с добавлением N2 компонента. Аналогичная картина наблюдалась и в случае определения маркеров GFAP и нестина.
При иммунофлуоресцентном анализе фиксированных клеток-предшественников в гистологических срезах спинного мозга выявлено, что добавление в матрицу имплантата
предшественников нейрональных клеток приводит к приживлению и миграции их в раневой зоне с последующей дифференцировкой в нейрональном направлении независимо от состава матриц в течение 1-4 недель. У крыс как в ранние сроки, так и в поздний период наблюдалось наличие трансплантированных клеток, дифференцирующихся в тканеспецифические типы. При дифференцировке клеток в нейрональном направлении в продольном срезе спинного мозга имеется наличие нейрофиламента в клеточных тяжах, енолазы, образование синапсов и GFP к глиальному белку.
При выполнении анализа наличия енолазы в препаратах спинного мозга после обработки клеток антителами против енолазы и последующего мечения вторичными антителами с детекцией флуоресценции обнаруживается специфический белок нейрона. При обработке антителами против глиального кислого белка он также обнаруживается в клеточной массе трансплантированных клеток. При использовании в имплантатах спинного мозга предшественников нейрональных клеток, обработанных антителами против олигодендроцитов, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции последние обнаруживаются в зоне прямой трансплантации. Анализ морфологии спинного мозга крыс указывает, что технология имплантации матриц в спинной мозг и их состав обеспечивают стабильность губчатой конструкции в течение 4-х недель, жизнеспособность пересаженных предшественников нейрональных и олигодендритных клеток, отсутствие выраженной воспалительной реакции в месте имплантации, формирование межсинаптических соединений при межклеточном контакте. Такая картина подтверждает субстратную реконструкцию спинного мозга в месте разрыва в виде вновь образованной нервной ткани.
Исследование диспергатов спинного мозга показало, что в образцах присутствуют GFP-меченные клетки. Результаты показывают стабильную экспрессию GFP через 3 и 4 недели после трансплантации в зоне повреждения СМ, что указывает на способность к хоумингу трансплантированных клеток в зоне повреждения. Наличие зеленого свечения указывает, что трансплантированные клетки функционируют и дифференцируются в нейрональном и глиальном направлениях.
Анализ неврологического дефицита у крыс после полной транссекции спинного мозга показывает, что трансплантация бесклеточной коллаген-хитозановой матрицы в диастаз спинного мозга на уровне IX грудного позвонка приводит к заметному сокращению объема нарушений, восстанавливая функции тазовых органов в полном объеме, а также обеспечивает 5-6 уровни восстановления моторных и сенсорных функций спинного мозга в течение 20 недель наблюдения (табл.1,2). Имплантация в диастаз спинного мозга коллаген-хитозановой подложки с 100 тыс. предшественниками нейрональных клеток мыши приводит к практическому полному устранению нейродефицита, достигая в течение 20 недель 20 уровня восстановления (табл. 1, 2).
Таблица 1
Критерии неврологического анализа при полной транссекции спинного мозга BBB Locomotor Rating Scale
Уровень Описание
0 Движения в нижних конечностях не наблюдаются
1 Легкое движение в 1 или 2 суставах, обычно бедренном и/или коленном
2 Широкие движения в 1 суставе Или Широкие движения в 1 суставе и легкие движения в 1 другом суставе
3 Широкие движения в 2 суставах
4 Легкие движения во всех 3 суставах нижней конечности
5 Легкие движения в 2 суставах и широкие движения в третьем суставе нижней конечности
6 Широкие движения в 2 суставах и легкие движения третьем суставе нижней конечности
7 Широкие движения во всех 3 суставах нижней конечности
8 «Подметательное» движение без опоры на конечность или Фиксация ступни на поверхности без опоры на нее
9 Фиксация ступни на поверхности с опорой на нее только при стоянии (без движения) или Случайное, частое или постоянное ступание на дорсальную поверхность лапы с опорой на нее, при отсутствии ступания на подошвенную поверхность лапы (ступни).
10 Случайные ступания с опорой на подошвенную поверхность лапы, нет координации при движении передних и задних конечностей
11 От частого до постоянного ступания с опорой на подошвенную поверхность лапы, нет координации при движении передних и задних конечностей
12 От частого до постоянного ступания с опорой на подошвенную поверхность лапы, случайная координация передних и задних конечностей при движении
13 От частого до постоянного ступания с опорой на подошвенную поверхность лапы, частая координация передних и задних конечностей при движении
14 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; при выполнении движения лапа преимущественно ротирована (кнутри или кнаружи) - в начале контакта лапы с поверхностью пола, а также перед ее поднятием с поверхности Или Частое ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении, случайное ступание с опорой на дорсальную поверхность лапы
15 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное не убирает или случайно убирает пальцы ступни при движении конечности вперед (при плавании); при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола.
16 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное часто убирает пальцы ступни при движении конечности вперед (но не всегда) (при плавании); при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола и ротированное при отнятии стопы от пола.
17 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное часто убирает пальцы ступни при движении конечности вперед (но не всегда) (при плавании); при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола и при отнятии стопы от нее.
18 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное всегда убирает пальцы ступни при движении конечности вперед (при плавании); при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола и при отнятии стопы от нее.
19 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное всегда убирает пальцы ступни при движении конечности вперед (при плавании); при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола и при отнятии стопы от нее; хвост постоянно опущен вниз.
20 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении; животное всегда убирает пальцы ступни при движении конечности вперед; при выполнении движения лапа занимает параллельное телу положение при контакте ступни с поверхностью пола и при отнятии стопы от нее; хвост постоянно поднят вверх, наблюдается нестабильность туловища.
21 Постоянное ступание с опорой на подошвенную поверхность лапы, постоянная координация передних и задних конечностей при движении (при плавании); животное всегда убирает пальцы ступни при движении конечности вперед; лапа всегда занимает параллельное телу положение; хвост постоянно поднят вверх, наблюдается нестабильность туловища, туловище стабильно.
Таблица 2
Результаты неврологического анализа при полной транссекции спинного мозга и трансплантации коллаген-хитозановой матрицы с предшественниками нейрональных клеток мыши
Последние исследования показывают, что включение в состав имплантируемой конструкции аминированных полисахаридных полимеров в состоянии компактизации до наноразмеров предупреждает прямые контакты иммуно-компетентных клеток с аллогенными или ксеногенными клетками нервной ткани, включенными в состав имплантата, что существенно снижает иммунологический конфликт в этой привилегированой зоне [1,2,3]. Важно заметить, что трансплантация эмбриональных клеток спинного мозга человека в зону повреждения СМ крысы выявляет высокую жизнеспособность донорских клеток в зоне трансплантации в течение нескольких месяцев. Это подтверждается имму-ногистохимическими реакциями на молекулярные маркеры. При этом пересадка клеточной массы в острый период после травмы приводит к снижению на 10% их жизнеспособности, достигая 83%. Очень важным результатом стал факт выбора матрицы для трансляции клеточной массы.
Иммунофлуоресцентный анализ нейротрансмиттеров контрольных серийных срезов головного отдела спинного мозга крысы через 20 недель после его полной транссекции (надтрансплантационная и трансплантационная зоны) показывает, что межуточная ткань заполнена ядерной клеточной массой материнского спинного мозга, активно экспрессирующей GABA, acetylcholine and serotonin. Число таких клеток имеет равномерный характер распределения от центра через зону трансплантата (рис.1 (здесь и далее см. обл. 2)). Кроме того зона трансплантата содержит большое количество вновь образованных микрокапилляров, содержащих тела эритроцитов с эффектом аутофлуоресценции. Количество ядросодержащих клеток материнского спинного мозга в трансплантате уменьшается по направлению к хвостовому отделу (рис. 2). В хвостовой зоне спинного мозга (ниже трансплантата) число ядросодержащих клеток существенно меньше, чем в головной зоне и в контрольном трансплантате. Тем не менее, жизнеспособные клетки экспрессируют нейротрансмиттеры GABA, acetylcholine and serotonin (рис. 3). Исследование опытных образцов спинного мозга, содержащих кроме нейронального микроокружения факторов роста 100 тыс. предшественников нейрональных клеток мыши, показало, что со стороны трансплантата регистрируется спрутинг клеток, продуцирующих GFP, в зону центрального конца материнского спинного мозга.
Трансляция ядросодержащих клеток сопровождается экспрессией нейромедиаторов GABA, acetylcholine and serotonin (рис. 4). Детальный серийный анализ срезов собственно клеточного трансплантата в спинном мозге указывает на богатое содержание жизнеспособных нейронов, продуцирующих GFP и одновременно экспрессирующих нейромедиаторы. Трансплантированная клеточная масса помимо
пришедших материнских нейрональных клеток занимает весь объем коллаген-
хитозановой подложки (рис. 5). В хвостовой части спинного мозга опытной группы животных регистрируется сниженное число ядросодержащих клеток с экспрессией и без экспрессии нейромедиаторов. Изучение серийных срезов ниже коллаген-хитозанового клеточного трансплантата (хвостовой отдел спинного мозга) выявляет слабый феномен спрутинга GFP-клеток (рис. 6).
Выводы:
1. Коллаген-хитозановая матрица, содержащая в своем составе факторы нейрогенной дифференцировки и предшественники нейрональных клеток, пригодна для имплантации с целью восстановления функций поврежденного спинного мозга.
2. Пересадка бесклеточной коллаген-хитозановой подложки при полной экспериментальной транссекции спинного мозга сопровождается активным спрутингом материнской клеточной массы нейронального происхождения, активно экспрессирующей маркеры нейрональной диффе-ренцировки и нейротрансмиттеры.
3. Такая пересадка сопровождается частичным восстановлением моторных, сенсорных и вегетативных функций спинного мозга, достигая уровня сокращения нейродефицита, равного 5,6 баллов по системе BBB scale.
4. Трансплантация коллаген-хитозановой матрицы, содержащей 100 тысяч предшественников нейрональных клеток, сопровождается в течение 20 недель сохранением их жизнеспособности, образованием многочисленных нейронов, формирующих межсинаптические связи, экспрессирующих помимо нейрональных маркеров медиаторы передачи нервного сигнала. Пересаженная клеточная масса обнаруживает трансляцию своих аксонов в сторону рострального отрезка материнского спинного мозга, выходя за пределы трансплантата. Хвостовая часть спинного мозга после полного его пересечения демонстрирует сниженное количество жизнеспособных нейронов и элементов макроглии со слабыми признаками спрутинга пересаженных клеток из зоны трансплантата в каудальную часть спинного мозга.
5. Трансплантация матрицы, содержащей предшественники нейронов, приводит к существенному восстановлению утраченных моторных и сенсорных функций спинного мозга, достигая уровня сокращения нейродефицита, равного 19,5 баллов по шкале BBB scale. Присутствие биополимера хитозана в трехмерной структуре имплантационной под-
Задняя конечность \ Неделя 1 2 З 4 5 б 7 8 9 10 11 12 1З 14 15 1б 17 18 19 20
Уровень нейродефицита Опытная группа (с PNCm) Левая лапа 0 1 2,5 5 7 7 7,5 9 10 11,5 12,5 1З 14,5 1б 19 19,5 19,5 19,5 - -
Правая лапа 0 1 1 4 4,5 5,5 7 8,5 10,5 11,5 12,5 1З 14,5 1б 19 19,5 19,5 19,5 - -
Уровень нейродефицита Контрольная группа (без PNCm) Левая лапа 0 0 0,5 1,2 1,8 З,4 4,8 5 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4
Правая лапа 0 0,4 0,8 0,8 2,2 4,4 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8
ложки, содержащей анионные наноструктурирующие агенты, такие как гепарин, хондроитинсульфат, гиалуронат, подтверждает исследования [9,11,17,18,23,30] о их активной роли не только в поддержании длительной жизнеспособности предшественников нейрональных клеток, их дифференци-ровки, но и активной трансляции аксональных окончаний через глиальный блок в месте повреждения спинного мозга, контактов между аксонами и элементами макроглии.
Литература
1. Применение полисахаридной нейрональной матрицы при лечении экспериментальной спинальной травмы / И.Н. Большаков [и др.]// Вопросы реконструктивной и пластической хирургии.- 2012.- Т. 15.- №1.- С. 34-42.
2. Коллаген-хитозановая матрица для культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в клетки нейрональной природы. Маркерный анализ / И.Н. Большаков [и др.]// Фундаментальные исследования.- 2012.-№1.- С. 18-23.
3. Трансплантация клеточной полисахаридной подложки при частичном спинальном разрыве у крыс. Динамический неврологический контроль / И.Н. Большаков [и др.] // Фундаментальные исследования.- 2012.- №2.- С. 31-34.
4. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице / А.В. Еремеев [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-
2009.- № 4.- С. 55-62.
5. Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / А.В. Еремеев [и др.] // Сиб. мед.обозрение.- 2008.- №6.- С. 24-27.
6. Andrews, M.R. Evaluation of olfactory ensheathing and Schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord / D.J. Andrews, D.J. Stelzenr // J. Neurotrauma.-2007.- V.24.- P. 1773-1792.
7. Basso, D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // J. Neurotrauma.- 1995.- V.12.- P. 1-21.
8. Baumann, M.D. Intrathecal delivery of a polymeric nanocomposite hydrogel after spinal cord injury / M.D. Baumann, C.E. Kang, C.H. Tator, M.S. Shoichet // Biomaterials.- 2010.-V.31.- P. 7631-7639.
9. Cheng, H. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury /
H. Cheng, Y.C. Huang, P.T. Chang, Y.Y. Huang// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2007.- V. 357.- P.938-944.
10. Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord / C. Deng [et al.] // J. Neurosci. Res.- 2006.- V.83.- P.1201-1212.
11. Eremeev, A.V. Patent RU. 2010. Method for producing a neural matrix / A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, I.N. Bol'shakov, Ju.I. Sheina, A.M. Polstyanoy. РСТ/ RU2011/000213 № W0/2011/142691.
12. Fitch, M.T. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure / M.T. Fitch, J. Silver // Exp Neurol.- 2008.- V.209.- P.294-301.
13. Franssen, E.H.P. 0lfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord / E.H.P. Franssen, F.M. de Bree, J. Verhaagen // Brain Res. Rev.- 2007.- V.56.- P.236-258.
14. Gros, T. Regeneration of long-tract axons through sites of spinal cord injury using templated agarose scaffolds /
T. Gros, J.S. Sakamoto, A. Blesch, L.A. Havton, M.H. Tuszynski // Biomaterials.- 2010.- V.31.- P. 6719-6729.
15. Poly(D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bifunctional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord / A. A. Hurtado [et al.] // Biomaterials.- 2006.- V.27.- P.430^42.
16. Li, X. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / X. Li, Z. Yang, A. Zhang // Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.4978-4985.
17. Li, X.G. Studies on repairing of hemisected thoracic spinal cord of adult rats by using a chitosan tube filled with alginate fibers / X.G. Li, Z.Y. Yang, Y. Yang // Prog. Nat. Sci.-2006.- V.16.- P.1051-1055.
18. Li, X.G. Repair of thoracic spinal cord injury by chito-san tube implantation in adult rats / X.G. Li, Z.Y. Yang, A.F. Zhang, T.L. Wang, W.C. Chen// Biomaterials.- 2009.-V.30.- P.1121-1132.
19. Olfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury / P. Lu [et al.] // J. Neurosci.- 2006.- V.26.- P.11120-11130.
20. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration / M.J. Moore [et al.] // Biomaterials.- 2006.-V.27.- P.419-429.
21. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury / S. Okada [et al.] // Nat. Med.- 2006.- V.12.- P.829-834.
22. In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups / Y.-J. Ren [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.1036-1044.
23. Thuret, S. Therapeutic interventions after spinal cord injury / S. Thuret, L.D.F. Moon, F.H. Gage // Nat. Rev. Neuros-ci.- 2006.- V.7.- P.628-643.
24. Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering / A. Wang [et al.]// Biomaterials.- 2011.- V.32.- P. 50235032.
25. Wang, D.D. The astrocyte odyssey / D.D. Wang, A. Bordey // Progress in Neurobiol.- 2008.- V.86.- P.342-367.
26. Cograft of neural stem cells and schwann cells overexpressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transaction / J.-M. Wang [et al.] // Biomaterials.- 2011.-V.32.- P.7454-7468.
27. Clinical observation of fetal olfactory ensheathing glia transplantation (OEGT) in patients with complete chronic spinal cord injury / J. Wu [et al.] // Cell Transplantation.- 2012.-V.21.- P.33-37.
28. Synaptic transmission of neural stem cells seeded in 3-dimensional PLGA scaffolds / Yi. Xiong [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.3711-3722.
29. Yang, Z. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / Z. Yang, H. Duan, H. Mo, H. Qiao, X. Li // Biomaterials.-2010.- V.31.- P. 4846^854.
30. Yiu, G. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nature reviews / G. Yiu, Z.G. He // Neuroscience.- 2006.- V.7.- P. 617-627.
References
1. Bol'shakov IN, Eremeev AV, Svetlakov AV, Sheina Yul, Rendashkin IV, Polstyanoy AM, et al. Primenenie polisakharid-noy neyronal'noy matritsy pri lechenii eksperimental'noy spin-
al'noy travmy. Voprosy rekonstruktivnoy i plasticheskoy khirur-gii. 2012;15(1):34-42. Russian.
2. Bol'shakov IN, Eremeev AV, Sheina YuI, Polstyanoy
AM, Karapetyan AM, Ignatov AV, et al. Kollagen-khitozanovaya matritsa dlya kul'tivirovaniya i differentsirovki embrional'nykh stvolovykh kletok v kletki neyronal'noy priro-dy. Markernyy analiz. Fundamental'nye issledovaniya.
2012;1:18-23. Russian.
3. Bol'shakov IN, Krivopalov VA, Kaptyuk GI, Karapetyan AM, Ignatov AV. Transplantatsiya kletochnoy polisakharidnoy podlozhki pri chastichnom spinal'nom razryve u krys. Dinami-cheskiy nevrologicheskiy kontrol'. Fundamental'nye issledova-niya. 2012;2:31-4. Russian.
4. Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol'shakov IN, Vlasov AA, Arapova VA. Funktsii kul'tiviruemykh embrional'-nykh kletok na kollagen-khitozanovoy matritse. Kletochnaya transplantolo-giya i tkanevaya inzheneriya. 2009;4:55-62. Russian.
5. Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol'shakov IN, Vla-sov AA, Arapova VA. Zhiznesposobnost' i funktsii plyuripotent-nykh kletok i fibroblastov dermal'no-epidermal'nogo sloya zhivotnykh v usloviyakh ikh kul'tivirovaniya na kollagen-khitozanovykh pokrytiyakh. Sib. med.obozrenie. 2008;6:24-7. Russian.
6. Andrews MR, Stelzenr DJ. Evaluation of olfactory en-sheathing and Schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J. Neurotrauma. 2007;24:1773-92.
7. Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma. 1995;12:1-21.
8. Baumann MD, Kang CE, Tator CH, Shoichet MS. Intrathecal delivery of a polymeric nanocomposite hydrogel after spinal cord injury. Biomaterials. 2010;31:7631-9.
9. Cheng H, Huang YC, Chang PT, Huang YY. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007;357:938-44.
10. Deng C, Gorrie C, Hayward I, Elston B, Venn M, Mackay-Sim A, Waite P. Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord. J. Neurosci. Res. 2006;83:1201-12.
11. Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol'shakov IN, Shei-na JuI, Polstyanoy AM, inventors. Method for producing a neural matrix Russian Federation patent RU. W0/2011/142691.
2010. Russian.
12. Fitch MT, Silver J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008;209:294-301.
13. Franssen EHP, de Bree FM, Verhaagen J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 2007;56:236-58.
14. Gros T, Sakamoto JS, Blesch A, Havton LA, Tuszynski MH. Regeneration of long-tract axons through sites of spinal cord injury using templated agarose scaffolds. Biomaterials. 2010;31:6719-29.
15. Hurtado A, Moon LD, Maquet V, Blits B, Jer ro'me R, Oudega M. Poly (D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bifunctional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord. Biomaterials. 2006;27:430-42.
16. Li X, Yang Z, Zhang A. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2009;30:4978-85.
17. Li XG, Yang ZY, Yang Y. Studies on repairing of he-misected thoracic spinal cord of adult rats by using a chitosan tube filled with alginate fibers. Prog. Nat. Sci. 2006;16:1051-5.
18. Li XG, Yang ZY, Zhang AF, Wang TL, Chen WC. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats. Biomaterials. 2009;30:1121-32.
19. Lu P, Yang H, Culbertson M, Graham L, Roskams AJ, Tuszynski MH. 0lfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury. J. Neurosci. 2006;26:11120-30.
20. Moore MJ, Friedman JA, Lewellyn EB, Mantila SM, Krych AJ, Ameenuddin S, et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 2006;27:419-29.
21. 0kada S, Nakamura M, Katoh H, Miyao T, Shimazaki T, Ishii K, Yamane J, Yoshimura A, Iwamoto Y, Toyama Y, 0kano H. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nat. Med. 2006;12:829-34.
22. Ren Y-J, Zhang H, Huang H, Wang X-M, Zhou Z-Y, Cui F-Z, An Y-H. In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups. Biomaterials. 2009;30:1036-44.
23. Thuret S, Moon LDF, Gage FH. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2006;7:628-43.
24. Wang A, Tang Z, Park I-H, Zhu Y, Patel S, Daley GQ, Li S. Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering. Biomaterials. 2011;32:5023-32.
25. Wang DD, Bordey A. The astrocyte odyssey. Progress in Neurobiol. 2008;86:342-67.
26. Wang J-M, Zeng Y-S, Wu J-L, Li Y, Teng YD. Cograft of neural stem cells and schwann cells overexpressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transection. Biomaterials. 2011;32:7454-68.
27. Wu J, Sun T, Ye C, Yao J, Zhu B, He H. Clinical observation of fetal olfactory ensheathing glia transplantation (OEGT) in patients with complete chronic spinal cord injury. Cell Transplantation. 2012;21:33-7.
28. Xiong Yi, Zeng Y-S, Zeng C-G, Du B-ling, He L-M, Quan D-P, Zhang W, Wang J-M, Wu J-L, Li Y, Li J. Synaptic transmission of neural stem cells seeded in 3-dimensional PLGA scaffolds. Biomaterials. 2009;30:3711-22.
29. Yang Z, Duan H, Mo L, Qiao H, Li X. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2010;31:4846-54.
30. Yiu G, He ZG. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 2006;7:617-27.
Исследования выполнены при поддержке гранта ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого МЗ РФ (2009), грантов государственного фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (гос.контракты: №6746р/9167 от 10.04.2009г., № 8775 р/13993 от 11.01.2011 г., № 10494 р/16892 от 08.06.2012).
