CC BY
138. Katsnelson B.A., Privalova L.I., Degtyareva T.D., Sutunkova M.P. et al. // Central Eur. J. Occup. and Envir. Medic. — 2010. — V.16. — № 1-2. — P. 47-63.
9. Katsnelson B.A., Degtyareva T.D., Privalova L.I. et al. // Intern. J. Toxicol. — 2010. — V.30. — №1. — P. 60-67
10. Katsnelson B.A.; Privalova L.I., Gurvich V.B. et al. // Intern. J. Molec. Sci. — 2013. — V.14. — P. 2449-2483.
11. Limbach L.K., Studer A.M., Van Duc L. et al. // Toxicol. Lett. — 2010. — V.1. — P.169-74.
12. Magaye R., Zhao J., Bowman L., Ding M. // Exp. Ther. Med. — 2012. — V.4. — P. 551-561.
Поступила 15.04.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ
Логинова Надежда Владимировна,
мл. науч. сотр. отдела токсикологии и биопрофилактики. E-mail: loginova.nadezhda@mail.ru.
УДК 613.63-055.2-034.73
В.А. Макутина1, С.Л. Балезин1, Т.В. Слышкина2, И.А. Пашнина3, Е.И. Лихачева2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ СТРЕССА И МЕТАЛЛОВ (КАДМИЯ И АЛЮМИНИЯ) НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ САМЦОВ КРЫС
1ЗАО «Центр семейной медицины», г. Екатеринбург 2ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий»
Роспотребнадзора, г. Екатеринбург 3Областная детская клиническая больница №1, г. Екатеринбург
Для исследования сочетанного воздействия стресса и металла (алюминия, кадмия) на репродуктивную систему самцам крыс дважды в неделю внутрибрюшинно вводили алюминий (3,8 мг А13+ на кг массы) или кадмий (0,3 мг Сd2+ на кг массы тела) и подвергали их стрессу методом кратковременной иммобилизации в течении сперматогенного цикла (54±3 дня). Обнаружена кумуляция как кадмия, так и алюминия в семенниках и головном мозге, возрастающая при стрессовом воздействии. При изолированном воздействии на организм лабораторных животных все три фактора (алюминий, кадмий, стресс) приводят к повышению уровня кортикостерона в крови, изменению уровня тестостерона, увеличению количества аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия, повышению содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК, снижению процента оплодотворенных самок. При сочетанном со стрессом воздействии выраженность повреждений сперматогенеза возрастает, а доимплантационная гибель в потомстве ин-тактных самок приобретает статистическую значимость.
Ключевые слова: алюминий, кадмий, иммобилизационный стресс, репродуктивная токсикология.
V.A. Makutina1, S.L. Balezin1, TV. Slyshkina2, I.A. Pashnina3, E.I. Lihacheva2. Experimental evaluation of combined effects caused by stress and metals (cadmium and aluminium) in reproductivity of male rats
1Family «Medicine Centre», Ekaterinburg
2Ekaterinburg «Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection of Industrial Workers», Rospotrebnadzor, Ekaterinburg
3Regional Children's Clinical Hospital №1, Ekaterinburg
To investigate combined effects of stress and metal (aluminium, cadmium) on reproductivity, male rats twice per week received intraperitoneal injections of aluminium (3.8 mg Al3+ per kg of body weight) or cadmium (0,3 mg Cd2+ per kg of body weight) and were subjected to stress via short-term immobilization during spermatogenic cycle (54 ± 3 days). Findings are cumulation of both cadmium and aluminium in genitals and brain, increasing under stress. When acting separately to the laboratory animals, the three factors (aluminium/ cadmium/ stress) increase serum corticosterone level, change testosterone level, increase number of aberrant mitoses of spermatogenic epithelium cells, increased sperm count with fragmented DNA, lower percentage of the impregnated females. If the exposure combined with stress, spermatogenesis disorders are more marked, and preimplantation death rate of intact females' offspirngs becomes statistically significant.
Key words: aluminium, cadmium, immobilization stress, reproductive toxicology.
Патологические состояния репродуктивной системы, приводящие к развитию субфертильности и бесплодию, формируются в результате генетически
обусловленных причин, а также при действии на организм неблагоприятных факторов различной природы (физических, химических и биологических) и их со-
четаний. В последнее время регистрируется значительный рост приобретенного мужского бесплодия, его патогенез и структура являются предметом многочисленных дискуссий и исследований в репродуктивной медицине [6,9,11]. Специальности, непосредственно связанные с производством или с применением некоторых химических веществ, с воздействием высоких температур и вибрации могут приводить к развитию репродуктивной дисфункции, что проявляется не только ухудшением количественных показателей эякулята, но и ростом количества регрессирующих беременностей, выкидышей, снижением рождаемости и т.п. Вместе с тем клинических и экспериментальных работ по изучению комбинированного и/или сочетанного многофакторного воздействия на репродуктивную систему крайне мало [2,8].
Цель работы: изучить влияние стресса на накопление различных по токсичности (кадмия и алюминия) металлов в репродуктивных органах и оценить выраженность морфофункциональных повреждений сперматогенеза самцов крыс при изолированном и сочетанном со стрессом действии данных металлов.
Материалы и методы исследования. Исследования проведены на половозрелых самцах крыс линии Вистар (86 особей) и беспородных самках (86 особей) в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» [3].
Выделены шесть групп животных: 1-я — самцы, подвергавшиеся стрессу методом кратковременной иммобилизации (в течение 30 мин.) 2 раза в неделю; 2-я — животные, получающие кадмий в виде внутри-брюшинных инъекций хлорида кадмия (0,3 мг на кг массы тела) 2 раза в неделю; 3-я — сочетанное действие кадмия и стресса в тех же дозировках; 4-я — животные, получающие алюминий в виде внутрибрю-шинных инъекций нитрата алюминия (3,8 мг А13+ на кг массы) два раза в неделю; 5-я — сочетанное действие алюминия в тех же дозах и стресса; 6-я — контрольная группа. Доза кадмия соответствовала 1/10 LD50 для внутрибрюшинного введения [10], доза алюминия входила в диапазон «минимально действующих» по параметрам общей токсичности [7]. Длительность воздействий во всех группах соответствовала продолжительности одного сперматогенного цикла у лабораторных крыс и составляла в среднем 54±3 дня.
В образцах семенников и цельной крови определяли концентрацию металлов на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА 665 «8Ыша<^и» по стандартной методике (Методика МУК 4.1.1897-04).
Оценку подвижности и морфологии нативных сперматозоидов осуществляли методом компьютерной микровидеографии на автоматическом анализаторе спермы (Мкгорйс, Испания) по программе производителя для лабораторных крыс. Процентное содержание сперматозоидов в исследуемых группах на стадиях раннего, позднего апоптоза и некроза осуществляли на проточном цитофотометре Су1юш1с8
FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием комбинированной окраски: аннексином V, меченым FITC-флуоресцеин изотиоцианатом (Annexin V-FITC apoptosis détection kit, BD Bioscienses, США) и 7-ами-но актиномицином D (Via-Probe, BD Bioscienses, США) по методике, рекомендованной фирмой-производителем. Степень фрагментации эпидидимальных сперматозоидов определяли на наборе для лабораторных животных Sperm Halomax kit (Microptic, Испания). Гистологическое исследование семенников в исследуемых группах проводили после окраски гематоксилином Эрлиха с докраской эозином [5]. При обзорной микроскопии отмечали дегенеративные изменения семенных канальцев, интерстициальной ткани и т.д. В гомогенате семенников цитологическим методом исследовали процентное содержание различных популяций сперматогенных клеток, клеток Лейди-га и Сертоли, рассчитывали отношение суммы клеток сперматогенного эпителия к наиболее резистентным к токсическому воздействию клеткам Сертоли, а также индекс напряженности сперматогенеза и герминативный индекс [1].
Специфический гормональный профиль самцов в экспериментальных группах оценивали по концентрации в сыворотке крови свободного тестостерона и основного глюкокортикоида у грызунов — кортико-стерона методом иммуноферментного анализа (ИФА) на наборах для лабораторных крыс («Corticosterone» Immunodiagnostic Systems, Великобритания; «Free Testosterone» Diagnostic Systems Laboratories, Канада) по методике производителей.
Эмбриотропные эффекты после спаривания оставшихся самцов с интактными девственными самками оценивали в соответствие с «Методами экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования» [4].
Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета прикладных программ « Statistica 6.0» фирмы Install Shield Software Corporation (США) параметрическими и непараметрическими методами. Количественные показатели представлены в виде M±m (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). В связи с тем, что совокупность данных по каждому оцениваемому параметру внутри группы не превышала 14, для оценки достоверности различий сравниваемых средних между малыми выборками использовали параметрический критерий t Стьюдента (доверительный коэффициент t) и непараметрический критерий Манна—Уитни. Нулевую гипотезу отвергали при р< 0,05.
Результаты и их обсуждение. Кумуляция алюминия и кадмия в головном мозге, семенниках и крови при изолированном поступлении и в сочетании со стрессом.
Результаты исследований по оценке содержания металлов в семенниках, головном мозге и в цельной крови представлены в табл. 1.
Таблица 1
Уровни накопления кадмия и алюминия в семенниках, головном мозге и в крови самцов крыс
Орган Показатель Группа
Контроль Стресс Кадмий Кадмий + стресс Алюминий Алюминий + стресс
Семенник концентрация Cd, мкг/г, н.о. н.о. 0,184± 0,016 0,220± 0,030* 2,997± 0,476 4,622± 0,428*
% от введенной дозы Сd на грамм массы органа н.о. н.о. 3,147± 0,168 3,756± 0,113* 3,755± 0,597 5,792± 0,573*
Головной мозг концентрация Cd, мкг/г, н.о. н.о. 2,047± 0,136 2,802± 0,248* 58,222± 4,074 81,493± 7,059*
% от введенной дозы Сd на грамм массы органа н.о. н.о. 34,995±2,328 47,902±5,955* 72,960± 5,107 102,121±9,970*
Цельная кровь концентрация Cd, мкг/г, н.о. н.о. 0,036± 0,013 0,059± 0,002* 0,955± 0,104 1,238± 0,475*
% от введенной дозы Сd на грамм массы органа н.о. н.о. 0,608± 0,137 1,010± 0,051* 1,196± 0,131 1,744± 0,151*
Примечания: н.о. — ниже порога определения вещества на приборе, * — статистически значимые различия по критерию Вилкоксона—Манна—Уитни (р < 0,001) между группами животных при изолированном и сочетанном со стрессом воздействии металла (кадмия или алюминия).
Таблица 2
Морфофункциональные показатели репродуктивной функции самцов крыс при изолированном и сочетанном воздействии металла (кадмия, алюминия) и стресса
Показатель Группа
Контроль Стресс Кадмий Кадмий + стресс .Алюминий Алюминий + стресс
Патологические формы гамет, % Сперматозоиды неподвижные, % 4,2 ± 3,0 68,8 ± 13,3 5,0 ± 3,0 58,4 ± 20,6 10,5 ± 2,1*/+ 84,3 ± 11,1*/+ 11,8 ± 5,1*/+ 88,8 ± 12,9*/+ 10,2±2,4*/+ 94,9±8,2*/+ 12,0±3,1*/+ 96,0±2,9*/+
Кортикостерон, нг/мл Свободный тестостерон, нг/мл 225 ± 69 2,2 ± 1,3 943 ±105* 5,7 ± 3,9 659 ± 214*/+ 0,4 ± 0,3 */+ 1280±276*/+Л 10,5 ± 5,Ь 620±206*/+ 0,5±0,3 + 1315±210*/+Л 3,5±1,9^
Клетки Лейдига, % Сперматогонии, % Сперматиды, % Доля аберрантных делений, % 1,1 ± 0,5 3,8 ± 1,0 59,7 ± 16,1 8,8 ± 2,8 1,0 ± 0,5 3,5 ± 1,7 55,6 ± 19,6 16,4 ± 6,3* 0,9 ± 0,5 2,3 ± 1,4*/+ 38,6 ± 16,8*/+ 23,8 ± 3,0*/+ 0,6 ± 0,3* 1,8 ± 0,5*/+ 42,4 ±15,2*/+ 29,8 ± 9,3*/+ 0,8±0,5 3,1±1,0 49,0±15,8* 20,4 ± 7,0* 0,8±0,4 3,4±1,9 22,4±10,2*Л 25,8 ± 8,1*/+
Ранний апоптоз, % Поздний апотоз, % Некроз гамет, % 3,7 ± 1,4 0,4 ± 0,3 0,8 ± 0,4 1,9 ± 1,7 0,4 ± 0,5 1,8 ± 1,2* 1.1 ± 0,5* 0,7 ± 0,2 1.2 ± 0,6 1,4 ± 0,3* 0,5 ± 0,3 1,3 ± 1,2 1.1 ± 0,7* 0,2 ± 0,1 1.2 ± 0,8 1,2 ± 0,8* 0,1 ± 0,1 1,1 ± 0,4
Сперматозоиды, содержащие фрагменти-рованную ДНК, % 5,8 ± 1,1 7,5 ± 1,5* 11,1± 2,3*/+ 21,1 ± 5,5*/+Л 9,4±2,1*/+ 16,7± 1,8*/+/.
Доимплантационная гибель эмбриона Общая эмбриональная гибель 0,4 ± 0,5 0,7 ± 1,0 1,6 ± 1,1 2,0 ± 1,6 1,8 ± 1,7 1,8 ± 1,7 1,9 ± 0,8* 2,3 ± 0,9* 1,8 ± 1,7 2,3 ± 1,9 2,0 ± 1,0* 2,3 ± 1,1*
Примечания: * — статистически значимые различия показателей по критерию Манна—Уитни (р< 0,05) по сравнению с
контрольной группой; +--статистически значимые различия показателей по критерию Манна—Уитни (р< 0,05) по сравнению
с группой стресс; • — статистически значимые различия показателей по критерию Манна—Уитни (р< 0,05) при изолированном и сочетанном со стрессом воздействии металла (кадмия или алюминия).
При изолированном поступлении алюминия и кадмия регистрируется следующее увеличение концентрации металлов в исследуемых органах и тканях: головной мозг > семенники > кровь в соотношениях 1:0,1:0,02 и 1:0,05:0,02, соответственно.
Анализ стандартизованных величин накопления металлов показал практически одинаковые величины кумуляции в семенниках самцов при воздействии обоих металлов, при значительном возрастании накопления алюминия в головном мозге по сравнению с кадмием.
При сочетании со стрессом зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания металла (алюминия/кадмия) в исследуемых органах и тканях. Дополнительное накопление алюминия у стресси-рованных животных в семенниках, головном мозге и крови достигало 40%, 54%, 30%, соответственно; кадмия — 37%, 22% и 66%. В связи с тем, что гемато-тестикулярный барьер (ГТБ) и гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) являются специализированными гисто-гематическими барьерами организма, изменение их проницаемости для химических соединений под влиянием стресса может оказывать воздействие на ней-рогуморальную регуляцию, морфо-функциональное состояние и выраженность клеточных повреждений в семенниках, а также иметь отдаленные последствия для потомства.
Влияние стресса, алюминия и кадмия на морфо-функциональные показатели репродуктивной функции самцов лабораторных крыс.
Результаты исследований по оценке морфофунк-ционального состояния семенников крыс самцов при сочетанном и изолированном воздействии металла (кадмия, алюминия) и стресса представлены в табл. 2.
Установлено, что по сравнению с интактной группой при изолированном воздействии стресса уровень кортикостерона в сыворотке крови возрастает в 4 раза, увеличивается число сперматозоидов на стадии некроза, повышается доля сперматозоидов с фрагментацией ДНК. Обзорная микроскопия гистологических срезов семенников выявила наличие дегенеративных изменений в виде частичной атрофии извитых семенных канальцев, в отдельных канальцах — слущива-ние сперматогенного эпителия. Нарушения процесса сперматогенеза проявляются снижением частоты наступления беременности интактных самок на 15%.
При изолированном действии кадмия выявлено двукратное снижение количества сперматогоний и сперматид в сперматогенном эпителии, снижение герминативного индекса и индекса напряженности сперматогенеза, повышение патологических по морфологии форм сперматозоидов и сперматозоидов, содержащих фрагментированную ДНК, достоверное увеличение неподвижных сперматозоидов и трехкратное возрастание доли аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия. При проведении обзорной микроскопии гистологических срезов семенников в группе «кадмий» установлено наличие выраженных дегенеративных изменений в виде частичной атрофии извитых семенных канальцев и слущивания сперматогенного эпителия. Подавление тестостеронсинтезирующей функции гонад проявилось в снижении уровня свободного тестостерона в сыворотке крови по сравнению с ин-тактным контролем. При спаривании с интактными самками обнаружено снижение частоты наступления беременности в 2 раза, отмечается тенденция к росту доимплантационной гибели эмбрионов и общей эмбриональной смертности.
Алюминий при изолированном воздействии показал сходные с предыдущим металлом изменения содержания гормонов в сыворотке крови: увеличение концентрации кортикостерона и снижение свободного тестостерона по сравнению с интактным контролем. Обзорная микроскопия гистологических срезов семенников выявила развитие дегенеративных изменений по периферии органа: слущивание сперматогенного эпителия, а также появление атрофических извитых семенных канальцев. В гомогенате ткани гонад самцов при изолированном воздействии алюминия по сравнению с контролем отмечены нарушения процессов сперматогенеза: снижение процентного содержания сперматид, увеличение количества аберрантных делений половых клеток и рост количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК. Отмечено снижение частоты наступления беременности у интактных самок и тенденция к увеличению доимплантационной гибели эмбрионов и общей эмбриональной смертности.
Сочетанное действие стресса и металлов в группах при зарегистрированной дополнительной кумуляции обоих металлов в головном мозге и семенниках проявилось более выраженным негативным воздействием на гонады по сравнению с группами изолированного действия: полной атрофией извитых семенных канальцев левого семенника у 25% животных (как в группе «кадмий+стресс», так и в группе «алюминий+стресс»), увеличением уровня кортикостерона в крови, повышением содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК и ростом аберрантных делений половых клеток. При сочетанном действии алюминия и стресса обнаружен слабый антагонистический эффект по тестостеронсинтезирующей функции семенников. В противоположность этому, при сочетанном действии кадмия и стресса наблюдается резкое увеличение концентрации свободного тестостерона в сыворотке крови почти в 20 раз по сравнению с изолированным воздействием кадмия. По количеству живых плодов, мест имплантаций, приходящихся на одну самку, и количеству резорбций отличий между группами не обнаружено. Тенденция к увеличению доимплантационной гибели эмбрионов в группах сочетанного действия приобретает статистическую значимость, что свидетельствует о проявлении гаметопатий и таких повреждении ДНК в половых клетках самцов, которые приводят в дальнейшем к фатальной патологии зигот и доимпланта-ционных эмбрионов [9].
Таким образом, при сочетанном действии металлов (кадмий и алюминий) и стресса выявлены разнообразные по характеру, направленности, выраженности эффекты по большинству изученных показателей. Избыточное накопление металлов в гонадах самцов на фоне стресса проявилось в выраженном изменении ряда показателей гонадотропности по сравнению с изолированным действием: по количеству и соотношению различных генераций половых клеток сперматогенного эпителия, повышению содержания спер-
матозоидов с фрагментацией ДНК и достоверному увеличению доимплантационной гибели эмбрионов, что свидетельствует об усилении повреждающего действия металлов в сочетании со стрессом.
Выводы. 1. Установлено, что не только кадмий (металл с известной репродуктивной токсичностью), но и алюминий (репродуктивная токсичность не является доказанной по данным литературы) накапливается в органах, ограниченных клеточными барьерами: в головном мозге и в семенниках. При изолированном воздействии на организм лабораторных животных все три фактора (алюминий, кадмий, стресс) приводят к схожим гонадо-тропным эффектам в семенниках, действуя на разных этапах сперматогенеза и спермиогенеза: повышается уровень кортикостерона в крови, изменяется уровень тестостерона, увеличивается количество аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия, повышается содержание сперматозоидов с фрагментацией ДНК, снижается процент оплодотворенных самок. 2. При сочетанном воздействии факторов различной природы: стресса и металла (кадмия и алюминия) обнаружена дополнительная кумуляция металлов в семенниках и головном мозге экспериментальных животных, что свидетельствует о возможном влиянии стресса на проницаемость клеточных барьеров. 3. Изменение гормонального баланса и усиление проницаемости ГТБ под действием стресса приводит к большей выраженности повреждений процессов спермато- и спермиогенеза по сравнению с изолированным действием: полной атрофии извитых семенных канальцев левого семенника у части животных животных, достоверному увеличению количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК и повышению количества аберантных делений, а также к росту доимплантационной гибели в потомстве интактных самок по сравнению с контрольной группой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (См. REFERENCES пп.6-11)
1. Иванов Ю.И. Ускоренные методы изучения гонадоток-сического действия веществ // Гиг. и сан. — 1990. — № 1. -- С. 72-74.
2. Ингель Ф.И, Бодягин Д.А., Геворкян Н.М. и др. // Токсикологический вестник. — 1995. — № 3. — С. 5-9.
3. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных. Основные принципы // Ланималогия. — 1993.
— №1. — 22 с.
4. Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования: МР № 174477. — М., 1977. — С. 21.
5. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф // Архив анат., гист. и эмбр.
— 1983. — Т.84.— №3.— С. 66-72.
REFERENCES
1. Ivanov Yu.I. Faster methods to study chemical gonadotoxic effects // Gig. i san.— 1990.— 1.— Р.72-74 (in Russian).
2. Ingel' F.I, Body agin D.A., Gevorkyan N.M et al. // Toksikologicheskiy vestnik.— 1995.— 3.— Р. 5-9 (in Russian).
3. International recommendations to involving animals medico-biological research rendering. Main principles // Lanimalogy.— 1993.— 1.— 22 p. (in Russian).
4. Aimed to hygienic regulation, methods of experimental studies on establishing thresholds of industrial poisons influence on generative function: MR 1744-77. Moscow, 1977.— 21 p. (in Russian).
5. Ukhov Yu.I., Astrakhantsev A.F. Arkhiv anat., gist. i embr.— 1983.— Vol.— 84.— 3.— Р. 66-72 (in Russian).
6. Bigelow P.L. Association of semen quality and occupational factors: comparison of case-control analysis and analysis of continuous variables / P.L. Bigelow, J. Jarrell, M.R. Young, T.J. Keefe // Fertil. Steril. — 19986. 69(1).— Р. 11-8.
7. Draft toxicological profile for aluminum. U.S. department of health and human services. Division of toxicology and environmental medicine. — 2006. — 303 р.
8. Linares V. Combined action of uranium and stress in the rat. II. Effects on male reproduction/ V. Linares, M.L. Albina, M. Belles et al // Toxicol Lett. — 2005. — 15.— 158(3) .— Р.186-95.
9. Nieschlag E. Male reproductive health and dysfunction / Nieschlag E., Behre H.M., Nieschlage S. // Andrology. — Berlin: Springer, 2010. — 610 р.
10. NIOSH criteria for a recommended standard occupational exposure to cadmium. // U.S. department of health, education, and welfare. National institute for occupational safety and health. — 1976. — 86 р.
11. Principles for evaluating health risks to reproduction associated with exposure to chemicals: Environm. Health Criteria 225.// Geneva: WHO. — 2001. — 144 р.
Поступила 15.04.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Макутина Валерия Андреевна,
эмбриолог ЗАО «Центр Семейной Медицины». E-mail:makutina_v@rambler.ru. Балезин Сергей Леонидович,
зам. директора ЗАО «Центр Семейной Медицины», E-mail:s.balezin@mail.ru. Слышкина Татьяна Вадимовна,
вед. науч. сотр. отдела физико-химических методов исследования ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора. E-mail:slishkina@ymrc.ru. Пашнина Ирина Александровна,
зав. лабораторией иммунологии Областной детской клинической больницы №1. E-mail:irina_pashnina@list.ru. Лихачева Елизавета Ильинична,
гл. науч. сотр. НПО «Клиника терапии и диагностики профессиональных заболеваний» ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора. Тел. раб. 8(343)371-54-14
