CC BY
13УДК 613.63-034.3
Н.В.Логинова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, НАПРАВЛЕННОГО НА СНИЖЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ
НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА МЕДИ
ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий»
Роспотребнадзора, г. Екатеринбург
При субхронической интоксикации, полученной повторным внутрибрюшинным введением крысам медно-оксид-ных наночастиц диаметром 20 нм (19 раз в дозе 10 мг/кг массы тела по 3 раза в неделю) показано, что на фоне перо-рального назначения комплекса биопротекторов (пектин, поливитаминно-полиминеральный препарат, глютаминат натрия, глицин, ацетил-цистеин и препарат рыбьего жира с высоким содержанием НЭЖК группы омега-3) снижается накопление меди во внутренних органах (в том числе статистически значимо — в селезенке) и тормозится развитие патологических изменений в печени, головном мозге и почках. При этом снижается также генотоксический эффект наномеди, судя по уменьшению фрагментации геномной ДНК в клетках печени и селезёнки.
Ключевые слова: наночастицы оксида меди, субхроническая интоксикация, генотоксичность, биопротекторы.
NV. Loginova. Experimental evaluation of efficiency of bioprophylactic complex aimed at reduction of toxic effects caused by copper oxide nanoparticles
«Ekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection of Industrial Workers», Rospotrebnadzor, Ekaterinburg
In subchronic intoxication via repeated intraperitoneal injection of copper oxide nanoparticles (diameter 20 nm, 19 times in dose of 10 mg/kg of rats, 3 times per week), findings are that oral intake of bioprotectors complex (pectine, polyvitamin and polymineral preparation, sodium glutaminate, glycine, acetylcysteine and fish oil preparation with high content of unsaturated fatty acids of omega-3 group) decreases copper accumulation in viscera (including statistically significantly in spleen) and slows development of pathologic changes in liver, brain and kidneys. With that, genotoxic effect of nanocopper also decreases — according to lower fragmentation of genome DNA in liver and spleen cells.
Key words: copper oxide nanoparticles, subchronic intoxication, genotoxicity, bioprotectors.
Токсические свойства наночастиц (НЧ) металлов и их оксидов представляют особый интерес для медицины труда в связи с тем, что кроме «искусственных» НЧ (engineered nanoparticles), специально производимых для использования в различных сферах техники, медицины или науки, существуют «естественные», постоянно присутствующие в воздухе рабочих помещений при использовании технологий, создающих условия для образования аэрозолей конденсации (металлургия, сварка и резка металлов). К таким технологиям относятся, в частности, плавка и разливка меди. Существенный вклад сферических частиц нанометрового диапазона (имеющих диаметр <100 нм) в загрязнение воздуха рабочей зоны выявляется при сканирующей электронной микроскопии частиц, задержанных на мембранном фильтре (рис. 1 и 2)*.
Особая токсичность НЧ ряда металлов по сравнению с частицами микрометрового диапазона доказана
Проба отобрана В.О. Рузаковым и С.В. Гребёнкиной и исследована в Центре коллективного пользования «Современные нанотехнологии» Уральского Федерального университета.
многими исследованиями, в том числе, проведенными с НЧ оксида железа, серебра и золота [1-3]. Имеется немало источников, свидетельствующих о высокой цито- и генотоксичности медных и особенно медно-оксидных НЧ [4-8], хотя в большинстве случаев речь идёт об экспериментах на клеточных культурах. Высокая опасность нанометаллов для здоровья работающих делает актуальным поиск средств повышения устойчивости организма к их действию в рамках проблемы биологической профилактики, давно разрабатываемой в нашем Центре под руководством проф. Б.А. Кац-нельсона и проф. Л.И. Приваловой [9-11]. Впервые возможность такого благоприятного действия комплекса безвредных биопротекторов была показана с участием автора на примере НЧ серебра [3].
Цель работы: экспериментальное испытание эффективности биопрофилактического комплекса, направленного против токсического и генотоксического действия НЧ оксида меди.
Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены с использованием медьсодержащих
50 40 S 30
о
2?20 10 0
100 200 300 400 d, нм
500
MAG = 25.08 K X EHT=10.00KV Signal A = InLens Photo No. = 1078 Date :2 Dec 2013 Time :17:04:24 WD = 4.5 mm Aperture Size = 30.00 ^m Collector Bias = 300 V System Vacuum = 2.33E-006 mbar
Рисунок 2. Распределение по размерам
Рисунок 1. Частицы, отобранные из воздуха рабочей зоны при разливке частиц в диапазоне 0-500 нм (М_числ0
анодной меди. Сканирующая электронная микроскопия, увеличение частиц данного диаметра, N х25 080 число частиц), %
■ суммарное
сферических частиц диаметром 20±10 (x±s.d.) нм, полученных в Центре коллективного пользования «Современные нанотехнологии» Уральского федерального университета с помощью специально разработанного метода, основанного на лазерной абляции поверхности медной металлической пластинки. Судя по результатам рентгеновского энергодисперсионного анализа, проведенного с помощью сканирующего электронного микроскопа Auriga CrossBeam (Carl Zeiss, Германия), оснащенного рентгеновским детектором X-Max (Oxford, Великобритания), в составе этих НЧ атомное соотношение Cu:O близко к 1:1. Однако это не означает, что они состоят из оксида меди CuO, поскольку для наночастиц, образовавшихся в процессе конденсации паров, как и в общем для конденсированных фаз, типичны существенные отклонения от стехиометрического состава. Таким образом, эти НЧ состоят из смеси различных оксидов меди, идентифицировать которые как определённое химическое соединение не представляется возможным.
Были сформированы 4 группы по 12 лабораторных крыс в каждой. Токсические эффекты НЧ после повторных внутрибрюшинных введений (19 раз в дозе 10 мг/кг массы тела по 3 раза в неделю) оценивались на основе большого набора функциональных показателей и патогистологического исследования внутренних органов с морфометрией. Было также определено на-
копление металлов в печени, селезенке, почках, головном мозге. Оценка генотоксичности наночастиц меди у тех же крыс проводилась (на кафедре медицинской биологии и генетики Уральского государственного медицинского университета) с помощью ПДАФ-теста по коэффициенту фрагментации геномной ДНК в клетках печени, селезенки, почек, головного и костного мозга.
Параллельно с группами крыс, подвергавшимися повторным внутрибрюшинным инъекциям суспензии НЧ или воды (контроль) без какого-либо дополнительного воздействия, в эксперименте участвовали две аналогичные группы, которые подвергались тем же инъекциям на фоне ежедневного перорального приема биопрофилактического комплекса (БПК) следующего состава: пектин, поливитаминно-полиминеральный комплекс, глютаминат натрия, глицин, ацетил-цисте-ин и препарат рыбьего жира с высоким содержанием НЭЖК группы омега-3. Этот состав был подобран с учетом общих представлений о механизмах вредного действия нанометаллов и имеющихся сведений о ток-сикодинамике меди.
Статистическая обработка результатов проводилась в программе Statistica 6.0, по критериям Стью-дента, Манна—Уитни.
Результаты и их обсуждение. У крыс, подвергавшихся затравке наночастицами, отмечено увеличение содержания меди по сравнению с контрольной груп-
Массовая доля меди, мкг на грамм массы сухого органа (х±8х)
Таблица 1
Группа крыс, получившая: Почки Печень Селезенка Головной мозг
воду 42,4±2,9 12,2±2,4 22,5±2,1 18,9±0,7
медьсодержащие НЧ 62,5±7,1* 28,8±6,3* 24,2±1,5 21,5±1,7
медьсодержащие НЧ и БПК 59,4±10,0 22,1±3,5* 18,0±2,5° 18,8±1,4
БПК 50,4±5,6 10,6±0,3 25,3±2,2 20,8±1,5
Примечания: * — статистически значимые (Р <0,05 по t Стьюдента) отличия от контрольной группы, 0 — от группы НЧ.
пой во всех исследованных органах, которое было статистически значимым в печени и почках (табл. 1).
Гистоморфологическое изучение с морфометрией печени, почек и селезёнки подтверждает наличие патологических изменений в этих органах. В частности, в проксимальных почечных канальцах НЧ вызвали статистически значимое увеличение длины участков потери щёточной каёмки и, в особенности, участков полной десквамации эпителия. В связи с этим представляют интерес данные Liao and Liu (2012), которые обнаружили, что 5-дневная пероральная затравка медными наночастицами в дозах 50, 100 или 200 мг/ кг, но не микрочастицами в дозе 200 мг/кг вызывала обширный некроз клеток проксимальных почечных канальцев. Xu et al (2012) показали в экспериментах in vitro, что наночастицы CuO вызывают оксидативный стресс, приводящий к апоптозу этих клеток.
В печени НЧ вызвали существенное угнетение репарационного деления гепатоцитов (отражаемого числом двуядерных клеток) и повышение числа клеток Купфера (тканевых макрофагов), а в почках — выраженную потерю щёточной каёмки эпителия извитых канальцев. При интоксикации на фоне действия БПК отмечено статистически значимое нормализующее влияние на число клеток Купфера (табл. 2). При гистологическом исследовании и морфометрии почек (табл. 3) ослабление токсического действия медно-ок-сидных НЧ явно проявилось статистически значимым снижением показателя десквамации щёточной каёмки эпителия проксимальных канальцев. Показатель десквамации эпителия был снижен, хотя и статистически недостаточно значимо, но при этом исчезло статистически значимое отличие от контрольной величины.
Таблица 2
Некоторые морфометрические характеристики печени крыс, подвергавшихся субхронической затравке медьсодержащими НЧ на фоне БПК или без БПК (X±Sx)
В головном мозге под влиянием НЧ обнаружены патологические изменения нейронов ганглиозного слоя коры и базальных ядер. При гистологическом исследовании области одного из базальных ядер (nucleus caudatus) наиболее чёткие признаки повреждения обнаружены в нейронах — клетках Гольджи 2-го типа. В них наблюдается гиперхромия и зернистость ядра,
ядрышко часто пикнотично, смещено на периферию ядра или отсутствует (предположительно — начальные признаки гибели клетки по типу апоптоза). Для морфометрии использовали наиболее чёткий признак отсутствия ядрышка. В головном мозге контрольных крыс среднее число таких безъядрышковых клеток на 100 подсчитанных клеток Гольджи типа II составило 23,3±2,8, у крыс, получавших НЧ — 62,2±3,1 (р<0,05). При интоксикации на фоне приёма БПК число безъяд-рышковых клеток составило только 29,5±4,1, то есть практически нормализовалось (р<0,05 по сравнению с группой, не получавшей БПК).
Таблица 3
Некоторые морфометрические показатели повреждения почек крыс, подвергавшихся субхронической затравке медьсодержащими наночастицами
Группы, получавшие Длина участка десквамации щеточной каемки, % Длина участка десквамации эпителия, %
Воду 5,39±0,42 0,33±0,13
НЧ 8,36± 0,76* 1,16±0,38*
НЧ+БПК 5,98±0,46- 0,98± 0,35
БПК 6,03±0,57 0,73±0,21
Примечания: * — различия статистически значимы (р <0,05 по 1 Стьюдента) в сравнении с контролем на воду; " — в сравнении с НЧ.
Судя по количественной оценке фрагментации геномной ДНК клеток разных органов (табл. 4) медьсодержащие НЧ обладают генотоксическим действием in vivo даже при той субхронической дозировке, которая вызвала, как будет показано ниже, довольно мало выраженных проявлений системной токсичности. При действии тех же НЧ, но на фоне БПК фрагментация геномной ДНК была статистически значимо ослаблена (почти до полной нормализации) в клетках печени и селезёнки, но не в других исследованных органах. При этом в почках она вообще была выявлена как более высокая, чем в контрольной группе, только при действии НЧ на фоне биопрофилактического комплекса (БПК). Последнее, вероятнее всего, объясняется ослаблением под влиянием БПК цитотоксического эффекта меди, который при действии НЧ без БПК дает выраженную гибель клеток, маскирующую генотоксический эффект.
По ряду токсикодинамических показателей также отмечено благоприятное отличие состояния организма в группе, получавшей НЧ на фоне БПК, от группы, получавшей НЧ без БПК, несмотря на то, что вредные токсикодинамические эффекты НЧ были и без биозащиты в целом умеренными или даже слабыми (а в подобных случаях выявить их ослабление под влиянием каких-либо биопротекторов обычно бывает трудно).
Группы, Число безъядерных Число клеток
получав- гепатоцитов Купфера
шие на 100 клеток на 100 клеток
воду 8,08±0,55 42,79±1,60
НЧ 6,88±0,50 54,06±1,80*
НЧ+БПК 6,63±0,50 46,88±1,20-
БПК 9,86±0,70 45,67±1,20
Примечания: * — различия статистически значимы (р <0,05 по 1 Стьюдента) в сравнении с контролем на воду; ■ — в сравнении с НЧ.
Таблица 4
Влияние БПК и/или медьсодержащих частиц на коэффициент фрагментации геномной ДНК (ПДАФ тест) в клетках различных органов (х±8х).
Группа крыс, получившая: Почки Печень Селезенка Головной мозг
воду 0,383±0,0025 0,396±0,0020 0,369±0,0016 0,354±0,0028
медьсодержащие НЧ 0,382±0,0015 0,426±0,0020* 0,460±0,0020* 0,355±0,0020
медьсодержащие НЧ и БПК 0,406±0,0027*п" 0,404±0,002*п" 0,418±0,0015*п" 0,335±0,0021*п
БПК 0,393±0,0025* 0,394±0,0040 0,377±0,0028* 0,356±0,0025
Примечания: * — различия статистически значимы (р <0,05 по t Стьюдента) в сравнении с контролем на воду; ■ — сравнение с НЧ; п — в сравнении с контролем на БПК.
В частности, на фоне БПК можно отметить уменьшение или даже снятие таких сдвигов, вызываемых действием НЧ, как сниженное содержание гемоглобина при повышенном проценте ретикулоцитов, пониженная белково-образовательная функция печени (судя по содержанию общего белка и альбуминов в сыворотке крови), пониженный уровень окислительно-восстановительного метаболизма (судя по активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови) и перекисного окисления (судя по содержанию малонового диальдегида — МДА — в сыворотке крови).
Сам по себе БПК вызвал статистически значимые сдвиги по сравнению с интактным контролем только по двум токсикодинамическим показателям из 39: увеличение массового коэффициента почек при статистически не значимом, но заметном увеличении диуреза и повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Увеличение массы почек, скорее всего, является признаком повышенной функциональной активности органа (включая повышенное кровенаполнение), результатом которой и служит повышение диуреза (отмеченное также в группе НЧ+БПК). Все это легко объяснимо давно отмеченным потреблением крысами в питье раствора глютамината натрия в значительно большем объеме, чем обычной воды, получаемой контрольной группой. При отсутствии в группе, получавшей только БПК, каких-либо других биохимических признаков повреждения печени, связать с ним повышение релиза щелочной фосфатазы в крови затруднительно, и допустимо рассматривать повышение активности этого важного фермента (контролирующего процессы дефосфорилирования) как позитивный сдвиг.
Для интерпретации этих фактов следует учесть, что дозировки ряда компонентов БПК подбираются как заведомо превышающие нормальную физиологическую потребность с учетом повышенной потребности организма в них в условиях хронического токсического (в том числе, оксидативного) стресса, которому группа, получавшая только БПК, не подвергалась. Поэтому для животных этой группы дозы некоторых компонентов БПК могли быть чрезмерно высокими и дать какие-то неблагоприятные эффекты, однако в условиях токсической нагрузки защитный эффект преобладает, а побочный — отсутствует.
Выводы. 1. Изученные медно-оксидные наночастицы обладают системно-органной токсичностью, включая
поражение базальных ядер головного мозга, которое может быть отнесено к специфическим эффектам избыточного накопления меди. 2. На фоне назначения комплекса биопротекторов перорально снижается накопление меди во внутренних органах при субхроническом воздействии медьсодержащих наночастиц (в том числе, в селезенке статистически значимо) и тормозится развитие патологических изменений в печени, головном мозге и почках; при этом снижается также генотоксический эффект наномеди, судя по коэффициенту фрагментации геномной ДНК в клетках печени и селезёнки при небольшом, но статистически значимом повышении этого показателя в клетках почки. Последнее может быть объяснено тем, что на фоне действия БПК ослаблено выраженное цитотоксическое действие меди на почечный эпителий, которое препятствовало проявлению её генотоксичности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (См REFERENCES пп. 5-12)
1. Кацнельсон Б.А., Дегтярёва Т.Д., Привалова Л.И. // Росс. хим. журнал. — 2004. — Т.18, №2. — С. 65-71.
2. Кацнельсон Б.А., Дегтярёва Т.Д., Привалова Л.И., Кузьмин С.В. и др. // Вестн. Уральской медиц. акад. наук. — 2005. — №2. — С. 70-76.
3. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Дегтярёва Т.Д. и др. // Уральский мед. журн. — 2011. — №9. — C. 35-38.
4. Кацнельсон Б. А., Привалова Л. И., Дегтярёва Т. Д. и др. // Токс. вест. — 2012. — №4. — С. 26-29.
REFERENCES
1 .Katsnel'son B.A., Degtyareva T.D., Privalova L.I. // Ross. khim. zhurnal. 2004. — Vol. — 18. — 2. — 65-71 (in Russian).
2. Katsnel'son B.A., Degtyareva T.D., Privalova L.I., Kuz'min S.V. et al. // Vestn. Ural'skoy medits. akad. nauk. — 2005. — 2. — P. 70-76 (in Russian).
3. Katsnel'son B.A., Privalova L.I., Degtyareva T.D. et al. // Ural'skiy med. zh. — 2011. — 9. — P. 35-38 (in Russian).
4. Katsnel'son B. A., Privalova L. I., Degtyareva T. D. et al. // Toks. vest. — 2012. — 4. — P. 26-29 (in Russian).
5. Akhtar M.J., Kumar S., Alhadlaq H.A. et al. // Toxicol. ind. health. — 2013. — [Epub ahead of print]/
6. Alarifi S., Ali D., Verma A., Alakhtani S., Ali B.A. // Intern. J. Toxicol. — 2013. — V.32. — Is.4. — P. 296-307.
7. Bagdonas I.E., Vosyliene M.Z. // Biologija. — 2006. — № 1. — P. 8-13.
8. Katsnelson B.A., Privalova L.I., Degtyareva T.D., Sutunkova M.P. et al. // Central Eur. J. Occup. and Envir. Medic. — 2010. — V.16. — № 1-2. — P. 47-63.
9. Katsnelson B.A., Degtyareva T.D., Privalova L.I. et al. // Intern. J. Toxicol. — 2010. — V.30. — №1. — P. 60-67
10. Katsnelson B.A.; Privalova L.I., Gurvich V.B. et al. // Intern. J. Molec. Sci. — 2013. — V.14. — P. 2449-2483.
11. Limbach L.K., Studer A.M., Van Duc L. et al. // Toxicol. Lett. — 2010. — V.1. — P.169-74.
12. Magaye R., Zhao J., Bowman L., Ding M. // Exp. Ther. Med. — 2012. — V.4. — P. 551-561.
Поступила 15.04.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ
Логинова Надежда Владимировна,
мл. науч. сотр. отдела токсикологии и биопрофилактики. E-mail: loginova.nadezhda@mail.ru.
УДК 613.63-055.2-034.73
В.А. Макутина1, С.Л. Балезин1, Т.В. Слышкина2, И.А. Пашнина3, Е.И. Лихачева2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ СТРЕССА И МЕТАЛЛОВ (КАДМИЯ И АЛЮМИНИЯ) НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ САМЦОВ КРЫС
1ЗАО «Центр семейной медицины», г. Екатеринбург 2ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий»
Роспотребнадзора, г. Екатеринбург 3Областная детская клиническая больница №1, г. Екатеринбург
Для исследования сочетанного воздействия стресса и металла (алюминия, кадмия) на репродуктивную систему самцам крыс дважды в неделю внутрибрюшинно вводили алюминий (3,8 мг А13+ на кг массы) или кадмий (0,3 мг Сd2+ на кг массы тела) и подвергали их стрессу методом кратковременной иммобилизации в течении сперматогенного цикла (54±3 дня). Обнаружена кумуляция как кадмия, так и алюминия в семенниках и головном мозге, возрастающая при стрессовом воздействии. При изолированном воздействии на организм лабораторных животных все три фактора (алюминий, кадмий, стресс) приводят к повышению уровня кортикостерона в крови, изменению уровня тестостерона, увеличению количества аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия, повышению содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК, снижению процента оплодотворенных самок. При сочетанном со стрессом воздействии выраженность повреждений сперматогенеза возрастает, а доимплантационная гибель в потомстве ин-тактных самок приобретает статистическую значимость.
Ключевые слова: алюминий, кадмий, иммобилизационный стресс, репродуктивная токсикология.
V.A. Makutina1, S.L. Balezin1, TV. Slyshkina2, I.A. Pashnina3, E.I. Lihacheva2. Experimental evaluation of combined effects caused by stress and metals (cadmium and aluminium) in reproductivity of male rats
1Family «Medicine Centre», Ekaterinburg
2Ekaterinburg «Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection of Industrial Workers», Rospotrebnadzor, Ekaterinburg
3Regional Children's Clinical Hospital №1, Ekaterinburg
To investigate combined effects of stress and metal (aluminium, cadmium) on reproductivity, male rats twice per week received intraperitoneal injections of aluminium (3.8 mg Al3+ per kg of body weight) or cadmium (0,3 mg Cd2+ per kg of body weight) and were subjected to stress via short-term immobilization during spermatogenic cycle (54 ± 3 days). Findings are cumulation of both cadmium and aluminium in genitals and brain, increasing under stress. When acting separately to the laboratory animals, the three factors (aluminium/ cadmium/ stress) increase serum corticosterone level, change testosterone level, increase number of aberrant mitoses of spermatogenic epithelium cells, increased sperm count with fragmented DNA, lower percentage of the impregnated females. If the exposure combined with stress, spermatogenesis disorders are more marked, and preimplantation death rate of intact females' offspirngs becomes statistically significant.
Key words: aluminium, cadmium, immobilization stress, reproductive toxicology.
Патологические состояния репродуктивной системы, приводящие к развитию субфертильности и бесплодию, формируются в результате генетически
обусловленных причин, а также при действии на организм неблагоприятных факторов различной природы (физических, химических и биологических) и их со-
