CC BY
8ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© Коллектив авторов, 2014
Эффекторные и регуляторные субпопуляции лимфоцитов крови при стабильном течении ишемической болезни сердца
Е.А. ПЫЛАЕВА, А.В. ПОТЕХИНА, С.И. ПРОВАТОРОВ, К.В. РАСКИНА, Н.Ю. РУЛЁВА, В.П. МАСЕНКО, Е.А. НОЕВА, Т.Л. КРАСНИКОВА, Т.И. АРЕФЬЕВА
Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, Москва
Effector and regulatory blood lymphocyte subpopulations in stable coronary artery disease
E.A. PYLAEVA, A.V. POTEKHINA, S.I. PROVATOROV, K.V. RASKINA, N.Yu. RULEVA, V.P. MASENKO, E.A. NOEVA, T.L. KRASNIKOVA, T.I. AREFIEVA
A.L. Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiology Research-and-Production Complex, Ministry of Health of Russia, Moscow
Резюме
Цель исследования. Изучение баланса циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), оказывающих антиатерогенное действие, а также Т-хелперов 1-го типа (Th1) и Т-хелперов 17-го типа (Th17), оказывающих проатерогенное действие, у больных со стабильным течением ишемической болезни сердца (ИБС) и различной выраженностью коронарного атеросклероза.
Материалы и методы. По результатам коронарографии 80 пациентов распределили на 4 группы. В 1-ю группу вошли 18 больных без значимого поражения артерий, 2-ю группу составил 21 пациент без прогрессирования, а 3-ю группу — 16 больных с прогрессированием коронарного атеросклероза (формирование стенозов более 50%) в нативных коронарных артериях. В 4-ю группу вошли 25 пациентов с трехсосудистым поражением. Пациентам 2-й и 3-й групп проводили коронарное стентирование за 23,8±8,4 и 22,4±8,7 мес до включения в исследование соответственно. Лимфоциты типировали методом прямой иммуноцитофлюориметрии: Treg определяли как лимфоциты CD4+CD25highCD127low и как CD4+FoxP3+. Для анализа Th17 CD4+IL-17a+ и Th1 CD4+INF-Y+ мононуклеарные клетки предварительно активировали в культуре. Уровни высокочувствительного С-реактивного белка, IL-10, sCD25 и IL-17a в сыворотке крови определяли методами нефелометрии, хемилюминесценции (Immulite) и иммуноферментного анализа соответственно. Результаты. У пациентов 4-й группы по сравнению с больными 1-й группы выявлено снижение количества Treg и повышение Th17. Отношение Th17/Treg у пациентов 3-й и 4-й групп оказалось выше, чем в 1-й, а отношение (Th1+Th17)/ Treg у пациентов 3-й группы выше, чем во 2-й группе. У женщин содержание Treg было выше, чем у мужчин. Индекс Th17/ Treg оказался повышен при инфаркте миокарда в анамнезе.
Заключение. Нарушение баланса про- и антиатерогенных субпопуляций лимфоцитов играет роль в патогенезе ИБС и ассоциировано с прогрессированием атеросклероза.
Ключевые слова: атеросклероз, воспаление, регуляторные Т-лимфоциты, Т-хелперы 1-го типа, Т-хелперы 17-го типа.
Aim. To investigate a balance between circulating regulatory T lymphocytes (Treg) exerting antiatherogenic activity and T helper type 1 (Th1) and T helper type 17 (Th17) cells having proatherogenic activity in patients with stable coronary artery disease (CAD) and different degrees of coronary atherosclerosis.
Subjects and methods. According to coronary angiography findings, 80 patients were allocated to 4 groups: 1) 18 patients with intact coronary arteries; 2) 21 with no progressive coronary atherosclerosis; 3) 16 with progressive coronary atherosclerosis (more than 50% stenosis) in the native coronary arteries; 4) 25 patients with three-vessel lesions. Groups 2 and 3 patients had undergone coronary stenting 23.8±8.4 and 22.4±8.7 months before their enrollment, respectively. Lymphocytes were typed by direct immunocytofluorometry: Treg was defined as CD4+CD25highCD127low and CD4+FoxP3+ lymphocytes. For CD4+IL-17a+ Th17 and CD4+INFgamma Th1 analysis, mononuclear cells were preactivated by culture. The serum levels of high-sensitivity C-reactive protein, IL-10, sCD25, and IL-17a were determined by nephelometry, chemiluminescence (Immulite) and ELISA, respectively. Results. Group 4 was found to have lower Treg levels and higher Th17 levels than Group 1. The ratio of Th17/Treg proved to be higher in Groups 3 and 4 than in Group 1 and that of (Th1+Th17)/Treg was higher in Group 3 than in Group 2. The female patients had higher Tregs levels than the male ones. The Th17/Treg index turned out to be increased in patients with a history of myocardial infarction.
Conclusion. The imbalance of pro- and anti-atherogenic lymphocyte subpopulations plays a role in the pathogenesis of CAD and is associated with progressive atherosclerosis.
Key words: atherosclerosis, inflammation, regulatory T-lymphocytes, T-helper type 1 cells, T-helper type 17 cells.
АСБ — атеросклеротическая бляшка
вч-СРБ — высокочувствительный С-реактивный белок
ИМ — инфаркт миокарда
КА — коронарные артерии
КГ — коронарография
ОКС — острый коронарный синдром
СС — стабильная стенокардия
ТЫ— Т-хелперы 1-го типа
IFN-y — интерферон-у IL-10— интерлейкин-10 IL-17— интерлейкин-17 iTreg — индуцибельные Treg
nTreg — естественные регуляторные Т-лимфоциты TGF-|3 — трансформирующий p-фактор роста TNF-a — a-фактор некроза опухоли
Атеросклероз — многофакторное хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся формированием атеросклеротических бляшек (АСБ) в интиме артериальной стенки [1]. В настоящее время активно изучается роль адаптивного иммунитета в инициации и прогрес-сировании атеросклероза. Аутоантигены (окисленные липопротеиды низкой плотности и их компоненты, в частности АроВ-100, а также белки теплового шока и др.) фагоцитируются и презентируются дендритными клетками и макрофагами Т-лимфоцитам, вызывая их активацию и пролиферацию [2—7]. Основную популяцию эффектор-ных Т-клеток в АСБ составляют Т-хелперы 1-го типа (ТЫ), характеризующиеся экспрессией внутриклеточного фактора Т-Ъй и секрецией цитокинов интерферона-^ (№N-7) и а-фактора некроза опухоли (ЮТ-а), оказывающих провоспалительные эффекты и способствующих дестабилизации АСБ.
В экспериментальных работах доказано проатероген-ное действие ТЫ и продуцируемых ими цитокинов. Так, введение лимфоцитов CD4+ мышам с иммунодефицитом ускоряло образование атеросклеротических поражений одновременно с увеличением уровня №N-7 в крови. «Выключение» фактора транскрипции Т-Ъй или подавление секреции клетками №N-7 приводило к уменьшению размера и количества АСБ у мышей с гиперхолестеринемией [8—11].
В АСБ содержатся также Т-клеточные субпопуляции, ограничивающие воспаление и замедляющие прогресси-рование атеросклероза. Естественные регуляторные Т-лимфоциты (пТгея) образуются в тимусе и являются ключевыми клетками, поддерживающими иммунологическую толерантность к аутоантигенам. пТгея экспресси-руют общие с Т-хелперными клетками антигены CD4 и CD3, для них характерны высокая экспрессия рецептора интерлейкина-2 (CD25), сниженная экспрессия рецептора интерлейкина-7 (CD127) и экспрессия внутриклеточного фактора транскрипции БохРЗ. Тгея ограничивают активность эффекторных Т-лимфоцитов посредством контактного межклеточного взаимодействия, синтеза гранзимов и перфоринов, цитокинов интерлейкина-10 (1Ь-10) и трансформирующего Р-фактора роста (ТОБ-Р), а также путем подавления активности антигенпрезенти-рующих клеток. Регуляторные Т-лимфоциты БохР3+ могут образовываться на периферии в ходе иммунного отве-
Сведения об авторах:
Потехина Александра Викторовна — к.м.н., м.н.с. отд. ХИБС ИКК им. А.Л. Мясникова
Проваторов Сергей Ильич — к.м.н., н.с. отд. ХИБС ИКК им. А.Л. Мясникова
Раскина Кира Вадимовна — лаборант-исследователь лаб. клеточной иммунологии НИИЭК
Рулёва Наталья Юрьевна — к.б.н., с.н.с. лаб. клеточной иммунологии НИИЭК
Масенко Валерий Павлович — д.м.н., проф., рук. отд. нейрогумо-ральных и иммунологических исследований Ноева Елена Александровна — к.м.н., с.н.с. отд. ХИБС ИКК им. А.Л. Мясникова
Красникова Татьяна Леонидовна — д.б.н., зав. лаб. клеточной иммунологии НИИЭК
Арефьева Татьяна Игоревна — к.б.н., в.н.с. лаб. клеточной иммунологии НИИЭК
та (так называемые индуцибельные Treg — iTreg). iTreg осуществляют регуляторную функцию в первую очередь посредством синтеза IL-10 и TGF-ß [12—15]. У животных с экспериментальным атеросклерозом Treg оказывают противовоспалительный и антиатерогенный эффект. Введение дефицитным по гену АроЕ мышам Treg вызывало значительное замедление прогрессии атеросклероза, что проявлялось формированием меньших по размеру и более стабильных АСБ. Вмешательства, ассоциированные с повышением содержания Treg, также приводили к торможению атерогенеза у экспериментальных животных [6, 16—18].
Продуцирующие интерлейкин-17 (IL-17) Т-хелперы (Th17) — недавно открытая популяция лимфоцитов, играющая ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний. IL-17 обладает выраженной провоспалитель-ной активностью, стимулируя синтез цитокинов и хемо-кинов клетками различных типов [19—23]. Роль Th17 в атерогенезе однозначно не определена. В то время как подавление эффектов IL-17 в эксперименте обеспечивало защиту от атеросклероза в различных экспериментальных моделях, введение рекомбинантного IL-17 ограничивало развитие АСБ на ранних стадиях у мышей, дефицитных по гену рецептора липопротеидов низкой плотности [24—26].
Участие описанных субпопуляций Т-лимфоцитов в атерогенезе в достаточной мере изучено на моделях атеросклероза у мышей. Клинические данные в настоящее время «отстают» от эксперимента. Большинство из них получено для пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС): показано снижение количества циркулирующих Treg у пациентов с ОКС по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией (СС) и донорами без клинически значимого поражения коронарного русла [27—30]. В некоторых исследованиях также отмечено увеличение содержания «провоспалительных» клеток, в частности Th1 и Th17, и продуцируемых ими цитокинов у пациентов с ОКС по сравнению со СС и контрольной группой [31— 33] и уменьшение количества Treg и концентрации TGF-ß [34]. В то же время Т. Simon и соавт. [35] в 2013 г. обнародовали данные проспективного исследования, согласно которым низкая концентрация IL-17 в периферической крови у пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) напрямую связана с более высоким риском развития острых коронарных осложнений в течение последующих 2 лет, что привело к заключению о важной иммуномодулирующей роли IL-17 в сосудистом воспалении.
Результаты исследований, посвященных изучению иммунного баланса — соотношения содержания про- и противовоспалительных субпопуляций лимфоцитов у пациентов со стабильными проявлениями коронарного атеросклероза, противоречивы. В исследовании Q. Li и соавт. [36] участвовали пациенты с ОКС (ИМ и нестабильной стенокардией), СС и коронарным атеросклерозом, подтвержденным ангиографически, а также пациенты контрольной группы без клинически значимого поражения коронарного русла. Количество Treg и их супрессорная
Контактная информация:
Пылаева Екатерина Алексеевна — аспирант отд. хронической ИБС, Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова, тел.: +7(495)414-6802; e-mail: iamfrommsu@yandex.ru
активность, а также содержание IL-10 в крови оказались ниже у пациентов с ОКС по сравнению с данными в остальных группах; у пациентов со СС этот показатель был ниже, чем у пациентов с неизмененными коронарными артериями (КА). Содержание Th17 и IL-17 в крови у пациентов с ОКС превышало аналогичные данные в других обследуемых группах [36]. Напротив, в исследовании Е. Ammirati и соавт. [37] статистически значимых изменений в уровне циркулирующих Treg и экспрессии мРНК лимфоцитами FoxP3 у пациентов с различными клиническими проявлениями коронарного атеросклероза (отсутствие стенокардии, СС, ОКС) по сравнению с контрольной группой не выявлено. Следует отметить, что в данной работе в контрольной группе с множественными факторами риска развития ИБС, отсутствие коронарного атеросклероза не подтверждено ангиографически [37].
В настоящем исследовании мы оценили количество регуляторных Т-лимфоцитов, Th1 и Th17 и ассоциируемых с ними маркеров в крови у больных со стабильным течением ИБС. Для подтверждения участия данных субпопуляций лимфоцитов в развитии атеросклеротических поражений у человека мы сопоставили полученные результаты с данными о степени распространенности атеросклероза и скорости прогрессирования заболевания, полученными при проведении коронарографии (КГ). Нами также изучена зависимость иммунологических показателей от пола пациентов и наличия ИМ в анамнезе.
Материалы и методы
Пациенты. В исследование включили 80 пациентов, которых по результатам КГ распределили на 4 группы: 1-я группа — 18 больных без клинически значимого поражения КА, 2-я группа — 21 пациент без прогрессирования атеросклероза, 3-я группа — 16 пациентов с прогрессированием коронарного атеросклероза, 4-я группа — 25 больных с трехсосудистым поражением коронарного русла. Во 2-ю и 3-ю группы включали больных, ранее перенесших коронарное стентирование. Под прогрессированием коронарного атеросклероза понимали появление новых стенотиче-ских поражений КА, суживающих на 50% и более просвет сосуда, либо увеличение выраженности ранее отмеченного стеноза на 30% и более, в артериях, ранее не подвергавшихся вмешательству. В исследование не включали пациентов с ОКС, перенесенными в течение последних 6 мес ИМ, мозговым инсультом, операцией коронарного шунтирования или транслюминальной баллонной ангиопластики КА, острыми или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, хронической почечной или печеночной недостаточностью, сахарным диабетом.
Получение и активация мононуклеарных клеток крови. Моно-нуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности по методике Boyum [38]. Клетки в концентрации 5 млн/мл ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки человека. Для активации клеток в культуру вносили 25 нг/мл форболмиристатацетата, 1 мкг/мл ио-номицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы «Sigma»). Клетки инкубировали в течение 5 ч при температуре 37 °С и 5% СО2.
Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлюориметрии в потоке. Для выявления поверхностных антигенов использовали флюоресцентно меченные моноклональные антитела CD4-FITC, CD25-PC5, CD127-PE (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, eBioscience). Для идентификации внутриклеточных белков использовали наборы для фиксации и пермеабилизации клеток (eBioscience) и флюоресцентно меченные антитела (Foxp3-Alexa488, IL17A-PE, и IFN-y-FITC, eBioscience). Окрашивание клеток антителами к цитокинам проводили после активации в
культуре. Лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов, фиксацию и пермеабилизацию клеток выполняли в соответствии с протоколами производителей. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлюориметрии в потоке (FACSCalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния. nTreg типировали как Т-лимфоциты CD4+CD25highCD127low. Th1 и Th17 типировали как Т-лимфоциты CD4+IFN-Y+ и CD4+IL17+, соответственно. Treg типировали также в мононуклеарной фракции как Т-лимфоциты CD4+FoxP3+.
Определение содержания IL-17, IL-10, высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ), sCD25 в крови больных. Концентрацию sCD25 и IL-10 в сыворотке крови определяли хе-милюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC-Siemens). Концентрацию IL-17 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом с использованием набора Bender MedSystems. Концентрацию СРБ определяли высокочувствительным методом на нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия — США).
Статистический анализ данных. Нормальный характер распределений оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. При несоответствии распределения данных нормальному закону для их описания использовали медиану и квартили (25-й процен-тиль; 75-й процентиль). Для межгрупповых сравнений в случае нормально распределенных данных применяли критерий t Стью-дента, в случае несоответствия нормальному закону — критерий U Манна—Уитни. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков использовали критерий х2. Корреляционный анализ проводили с использованием метода Спирмена. Различия считали статистически значимыми при_р<0,05. В работе применялся пакет статистических программ Statistica 7,0.
Результаты
Группы больных статистически значимо не различались по основным клинико-анамнестическим характеристикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови (табл. 1).
Содержание nTreg CD4+CD25highCD127low в 1-й группе (пациенты без клинически значимого поражения КА) статистически значимо выше, чем в 4-й группе (пациенты с многососудистым поражением коронарного русла) (см. рисунок, а). Содержание Th17 в 1-й группе статистически значимо ниже, чем в 4-й группе (см. рисунок, б).
Мы оценили баланс про- и антиатерогенных субпопуляций лимфоцитов по отношению количества Th17 к Treg CD4+FoxP3+, Th1 и суммарного количества (Th1+ Th17) к Treg CD4+FoxP3+. В 3-й и 4-й группах отношения Th17 к Treg CD4+FoxP3+ была статистически значимо выше, чем в 1-й группе (см. рисунок, в). Аналогичные результаты получены для отношения Th17 к nTreg CD4+ CD25highCD127low (p<0,05). У больных с прогрессирующим течением атеросклероза КА (3-я группа) отношение Th1/Treg и (Th1+Th17)/Treg выше, чем у больных без прогрессирования коронарного атеросклероза (2-я группа) (см. рисунок, г).
Статистически значимых межгрупповых различий по уровням IL-10, IL-17, вч-СРБ в крови не выявлено. Концентрация sCD25 в крови у пациентов 4-й группы выше, чем у пациентов 1-й группы (табл. 2).
Среди обследуемых больных было 68 (85%) мужчин и 12 (15%) женщин. Группы мужчин и женщин сопоставимы по основным клинико-анамнестическим характери-
Таблица 1. Клиническая характеристика 80 пациентов, включенных в исследование
1-я группа (п=18), 2-я группа (я=21), 3-я группа (п=16), с 4-я группа (и=25)
Параметр без коронарного ате- без прогрессирова- прогрессированием многососудистое
росклероза ния атеросклероза атеросклероза поражение
Пол, мужчины 13 (72%) 20 (91%) 14 (88%) 21 (84%)
Возраст, годы 61+13 60+11 61+11 63+8
Ожирение, ИМТ >30 6 (33%) 8 (36%) 8 (50%) 5 (20%)
Артериальная гипертония 15 (83%) 15 (68%) 16 (100%) 21 (84%)
ИМ в анамнезе 0 11 (50%) 6 (38%) 14 (56%)
Лейкоциты, млн/мл 7,4+1,7 6,8+1,7 7,8+1,6 7,8+2,3
Лимфоциты, млн/мл 2,3+0,8 2,1+0,6 2,6+0,7 2,4+0,6
Курение 4 (22%) 8 (36%) 4 (25%) 13 (52%)
Холестерин, ммоль/л 5,2+1,3 4,8+0,8 4,9+0,9 4,7+1,2
Триглицериды, ммоль/л 1,6+0,7 1,8+1,4 1,9+1,1 1,7+0,7
Глюкоза, ммоль/л 5,46+0,5 5,45+1,2 5,8+1,3 5,6+1,1
Коронарное стентирование проводилось за 23,8+8,4 и 22,4+8,7 мес до включения во 2-ю и 3-ю группы соответственно ПНА — 12 (54%) ПКА — 9 (41%) ОА — 7 (32%) ПНА ПКА ОА — — 8 (50%) — 8 (50%) — 4 (25%)
Прогрессирование коронарного атеросклероза — повторный стеноз более 50% просвета сосуда по данным КГ на момент включения в группу ПНА ПКА ОА — — 7 (43%) — 6 (38%) — 4 (25%)
Таблица 2. Содержание sCD25, К-17, К-10, вч-СРБ в крови у обследованных больных
Показатель 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа
sCD25, ед/мл 568 (428; 779) 682 (544; 1159) 608 (430; 772) 832 (664; 1010)*
1Ь-10, пг/мл 2,6 (1,8; 3,3) 2,4 (1,8; 3,1) 2,9 (1,9; 3,7) 2,2 (1,9; 2,5)
1Ь-17, пг/мл 1,0 (1,0; 2,0) 1,0 (1,0; 2,5) 1,0 (1,0; 4,25) 1,5 (1,0; 5,5)
вч-СРБ, мг/л 2,1 (1,6; 5,0) 1,0 (0,5; 3,3) 1,5 (1,0; 6,2) 3,0 (1,1; 7,8)
Примечание. * — различия статистически значимы по сравнению с 1-й группой (р<0,05).
Таблица 3. Содержание п^^ CD4+CD25highCD127low и 1Ы7 и отношение содержания п^^ CD4+CD25highCD127low и Treg CD4+FoxP3+ к ^17 у пациентов с ИМ в анамнезе и без отягощенного анамнеза
Показатель ИМ в анамнезе (я=27) Без ИМ в анамнезе (я=53)
пЪ^ CD4+CD25highCD127low, % от числа лимфоцитов CD4+ 3,6% (2,8; 5,1%) 4,8% (3,7; 6,5%)*
ТЫ7 CD4+IL-17+, % от числа лимфоцитов CD4+ 1,8 % (1,1; 2,2%) 1,1% (0,8; 1,6%)*
CD4+CD25highCD127low пЪ^/ТЫ7 2,3 (1,2; 4,1) 4,0 (2,6; 8,8)*
CD4+FoxP3+ Т^/ТЫ7 4,0 (2,8; 6,6) 7,3 (5,1; 12,7)*
Примечание. * — различия статистически значимы по сравнению с пациентами с перенесенным ИМ (р<0,05).
стикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови. У женщин содержание лимфоцитов CD4+ и Тгея CD4+ БохР3+, выраженному в процентах от числа лимфоцитов, оказалось выше, чем у мужчин —52 (46,5; 54,5)% и 42 (38; 50)% ^<0,05) и 4,2 (3,65; 4,95)% и 3 (2,3; 3,8)% ^<0,05) соответственно.
Среди обследованных доля пациентов, перенесших инфаркт миокарда (ИМ), составила 34% (п=27), доля пациентов без ИМ в анамнезе — 66% (п=53). Давность перенесенного ИМ составила 59 (19; 70) мес. В группе пациентов, перенесших ранее ИМ, доля курильщиков на момент обследования была значимо больше, чем среди пациентов без ИМ в анамнезе. По остальным основным клинико-
анамнестическим характеристикам, факторам риска развития ИБС и содержанию основных популяций лейкоцитов в периферической крови указанные группы были сопоставимы.
По сравнению с пациентами с неотягощенным анамнезом у больных с ИМ в анамнезе выявлены увеличение содержания лимфоцитов CD4+, уменьшение содержания пТгея CD4+CD25highCD127low и увеличение содержания ТЪ17. У пациентов с отягощенным по ИМ анамнезом отношение Тгея, определяемое как CD4+CD25highCD127low и CD4+FoxP3+, к ТЫ7 оказалось меньше, чем у пациентов без ИМ в анамнезе (табл. 3). При сравнении содержания и соотношения указанных клеточных субпопуляций у курящих и некурящих пациентов различий не выявлено.
Содержание nTreg CD4+CD25highCD127low (а) и Th17 CD4+IL-17+ (б) (% от числа лимфоцитов CD4+), отношение содержания Th17 к CD4+FoxP3+ Treg (в) у пациентов с различной степенью выраженности и прогрессирования коронарного атеросклероза; отношение содержания про- (Th1, Th17) и противовоспалительных (CD4+FoxP3+ Treg) субпопуляций лимфоцитов у пациентов без прогрессирования и с прогрессированием атеросклероза КА (г).
Обсуждение
Состояние эффекторного и регуляторного звена иммунитета при ИБС привлекает в последние годы особое внимание ученых и клиницистов. В большинстве исследований продемонстрированы снижение уровня и су-прессорной активности Тгея и повышение количества ТЫ7 в кровотоке у больных СС и различными формами обострения ИБС — ОКС, нестабильной стенокардией и ИМ — по сравнению с индивидами без коронарного атеросклероза. Следует отметить, что при ОКС иммунологические изменения могут быть следствием некроза миокарда и острого эмоционального стресса [39].
В настоящем исследовании мы оценили баланс проа-терогенных (ТЫ и ТЫ 7) и антиатерогенных (Тгея, в том числе пТгея) популяций лимфоцитов и ассоциированных с ними растворимых маркеров у больных со стабильным течением ИБС, различной выраженностью и скоростью прогрессии коронарного атеросклероза. У больных с тяжелым многососудистым атеросклерозом КА (4-я группа) по сравнению с пациентами без значимого коронарного атеросклероза (1-я группа) мы наблюдали изменение субпопуля-
ционного состава лимфоцитов крови — снижение содержания регуляторных Т-лимфоцитов и увеличение содержания ТЫ7. У больных с прогрессирующим течением коронарного атеросклероза (3-я группа) отмечалось повышение отношений ТЫ7/Тгея, и (ТЫ+ТЫ7)/Тгея по сравнению с таковым у больных без коронарного атеросклероза и признаков прогрессии заболевания (1-я и 2-я группы).
Концентрации 1Ь-10, 1Ь-17 и вч-СРБ в крови у пациентов разных групп статистически значимо не различались. Концентрация sCD25 в крови у больных с многососудистым коронарным атеросклерозом выше, чем у больных без атеросклеротического поражения КА, что, вероятно, свидетельствует об активации лимфоцитов. При анализе концентрации вч-СРБ выявлена ожидаемая тенденция к более высокому его уровню у больных с выраженным атеросклерозом коронарного русла (3-я и 4-я группы) по сравнению с таковым у пациентов без значимого атеросклероза КА (1-я группа); отсутствие статистически значимых различий, вероятно, связано с малочисленностью групп.
В нашем исследовании показано, что у женщин содержание Тгея CD4+FoxP3+ выше, чем у мужчин, количе-
ство nTreg CD4+CD25highCD127low не зависело от пола пациентов. В недавно опубликованном исследовании G. Afshan и соавт. [40], включившем 50 практически здоровых мужчин и 47 женщин молодого возраста (16—25 лет), выявлено, что у женщин содержание nTreg CD4+CD25high ниже, чем у мужчин. В наше исследование включены пациенты пожилого возраста, в том числе женщины в постменопаузе, с атеросклерозом КА. Известно, что с увеличением возраста уменьшается созревание лимфоцитов в тимусе и изменяется содержание Treg за счет уменьшения количества nTreg и увеличения количества индуцированных на периферии iTreg [41]. Вероятно, этот процесс протекает по-разному у женщин и мужчин. Вопрос о роли Treg как дополнительного защитного фактора в отношении атеросклероза у женщин нуждается в дальнейшем изучении.
Показанные нами закономерности изменения иммунного баланса — увеличение содержания Th17 и уменьшение содержания Treg и их отношения Treg/Th17 у пациентов, перенесших ИМ, подтверждают результаты выполненного ранее исследования J. George и соавт. [42], в котором установлено, что у пациентов с перенесенным ИМ (т.е. нестабильными проявлениями атеросклероза) различной давности содержание Treg и IL-10 в крови ниже, чем у пациентов без обострений атеросклероза в анамнезе. Прогностическая значимость содержания популяции регуляторных Т-клеток в отношении прогрессирова-ния ИБС и развития ее обострений рассмотрена в работе M. Wigren и соавт. [43]. В проспективном исследовании проанализированы данные 700 пациентов пожилого возраста, за которыми проводилось наблюдение с 1991—1994 по 2008 г. Показано, что содержание Treg CD4+FoxP3+ на момент включения в исследование у пациентов, перенесших ИМ за период наблюдения, было ниже, чем у пациентов без осложнений.
Таким образом, на основании данных литературы и собственных результатов мы предполагаем, что изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов крови
играют определенную роль в прогрессии коронарного атеросклероза, однако требуются дальнейшие исследования, чтобы определить место данных параметров в диагностическом и прогностическом поиске у больных ИБС.
Модуляция параметров клеточного и гуморального иммунитета является перспективным направлением разработки потенциальных терапевтических подходов к лечению больных с атеросклерозом, включающих разработку вакцин, стимулирующих опосредованную Treg иммунологическую толерантность к аутоантигенам в АСБ, низкодозовую терапию иммуносупрессорными средствами, введение нейтрализующих антител к цито-кинам или окисленным липопротеидам низкой плотности, клеточную терапию с применением толерогенных дендритных клеток. Первая подкожная вакцина, направленная на формирование специфичных к пептидному фрагменту АроВ-100 Treg с целью создания иммунологической толерантности готовится к первой фазе клинических исследований в 2014—2015 гг. при поддержке компании Cardiovax. Доклинические исследования показали высокую (70%) эффективность препарата в снижении прогрессирования атеросклероза при интраназальном введении у мышей АроЕ—/. В настоящее время проводятся исследования нейтрализующих антител к интер-лейкину-1 (канакинумаб, «Новартис») и антител к пептидному фрагменту окисленной формы АроВ-100 (MLDL1278a, спонсировано BioInvent International AB/ Genentech) при атеросклерозе КА и сонных артерий, результаты ожидаются в 2016 г. Изучение иммунологических основ атерогенеза позволит подобрать наиболее эффективную иммунологическую терапию для пациентов с различными нарушениями иммунологического баланса. Все эти данные свидетельствуют о перспективности исследования параметров клеточного иммунитета при атеросклерозе.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №12-04-00945-а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005; 352: 1685—1695.
2. Maron R, Sukhova G., Faria A.M. et al. Mucosal administration of heat shock protein-65 decreases atherosclerosis and inflammation in aortic arch of low-density lipoprotein receptor-deficient mice. Circulation 2002; 106: 1708—1715.
3. George J., Yacov N., Breitbart E. et al. Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with beta-2-glycoprotein I. Cardiovasc Res 2004; 62: 603—609.
4. van Puijvelde G.H., Hauer A.D., de Vos P. et al. Induction of oral tolerance to oxidized low-density lipoprotein ameliorates atherosclerosis. Circulation 2006; 114: 1968—1976.
5. van Puijvelde G.H., van Es T., van Wanrooij E.J. et al. Induction of oral tolerance to HSP60 or an HSP60-peptide activates T cell regulation and reduces atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27 (12): 2677—2883.
6. Wigren M, Kolbus D., Duner P. et al. Evidence for a role of regulatory T cells in mediating the atheroprotective effect of apolipopro-tein B peptide vaccine. J Intern Med 2011; 269: 546—556.
7. Mundkur L., Mukhopadhyay R., Samson S. et al. Mucosal tolerance to a combination of ApoB and HSP60 peptides controls plaque progression and stabilizes vulnerable plaque in Apob(tm2Sgy)Ldlr(tm 1 Her)/J mice. PLoS One 2013; 8 (3): e58364.
8. Jonasson L., Holm J., Skalli O. et al. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis 1986; 6: 131—138.
9. Zhou X., Nicoletti A., Elhage R. et al. Transfer of CD4(+) T cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein E knockout mice. Circulation 2000; 102: 2919—2922.
10. Buono C., Come C.E., Stavrakis G. et al. Influence of interferon-gamma on the extent and phenotype of diet-induced atherosclerosis in the LDLR-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23: 454—460.
11. Buono C., Binder C.J., Stavrakis G. et al. T-bet deficiency reduces atherosclerosis and alters plaque antigen-specific immune responses. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 1596—1601.
12. Sokolov V.O., Krasnikova T.L., Prokofieva L.V. et al. Expression of markers of regulatory CD4+CD25+foxp3+ cells in atherosclerotic plaques of human coronary arteries. Bull Exp Biol Med 2009; 147 (6): 726—729.
13. Fontenot J.D., Rasmussen J.P., Williams L.M. et al. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 2005; 22: 329—341.
14. Suvas S., Kumaraguru U., Pack C.D. et al. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med 2003; 198: 889—901.
15. Vignali D.A.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol 2008; 8 (7): 523—553.
16. Taleb S., Herbin O., Ait-Oufella H. et al. Defective leptin/leptin receptor signaling improves regulatory T cell immune response and protects mice from atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27 (12): 2691—2698.
17. Mor A., Planer D., Luboshits G. et al. Role of naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells in experimental atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27 (4): 893—900.
18. Feng J., Zhang Z., Kong W. et al. Regulatory T cells ameliorate hyperhomocysteinaemia-accelerated atherosclerosis in apoE-/-mice. Cardiovasc Res 2009; 84 (1): 155—163.
19. Erbel C., Dengler T.J., Wangler S. et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol 2011; 106: 125—134.
20. Lubberts E., Koenders M.I., Oppers-Walgreen B. et al. Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of collagen-induced arthritis reduces joint inflammation, cartilage destruction, and bone erosion. Arthritis Rheum 2004; 50: 650—659.
21. Komiyama Y., Nakae S., Matsuki T. et al. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2006; 177: 566—573.
22. Hsu H.C. Yang P., Wang J. et al. Interleukin 17-producing T helper cells and interleukin 17 orchestrate autoreactive germinal center development in autoimmune BXD2 mice. Nat Immunol 2008; 9: 166—175.
23. Ma H.L., Liang S., Li J. et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. J Clin Invest 2008; 118: 597—607.
24. Gao Q., Jiang Y., Ma T. et al. A critical function of Th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice. J Immunol 2010; 185: 5820—5827.
25. Madhur M.S., Funt S.A., Li L. et al. Role of interleukin 17 in inflammation, atherosclerosis, and vascular function in apolipopro-tein e-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011; 31: 1565—1572.
26.
27.
28. Li Y.J, Zheng D.D., Chen J. et al. Decrease in CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue 2008; 20 (12): 746—767.
29. Zhao Z., Wu Y., Cheng M. et al. Activation of Th17/Th1 and Th1, but not Th17, is associated with the acute cardiac event in patients with acute coronary syndrome. Atherosclerosis 2011; 217 (2): 518—524.
30. Mor A., Luboshits G., Planer D. et al. Altered status of CD4(+) CD25(+) regulatory T cells in patients with acute coronary syndromes. Eur Heart J 2006; 27 (21): 2530—2537.
31. Han S.F., Liu P., Zhang W. et al. The opposite-direction modulation of CD4+CD25+ Tregs and T helper 1 cells in acute coronary syndromes. Clin Immunol 2007; 124 (1): 90—97.
32. Hu Z., Li D., Hu Y. et al. Changes of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome and the effects of atorvastatin. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2007; 27 (5): 524—527.
33. ChengX., Yu X., Ding Y.J. et al. The Th17/Treg imbalance in patients with acute coronary syndrome. Clin Immunol 2008; 127 (1): 89—97.
34. Zhao Y.Q., Fu Q., Li Z.L. et al. Changes of CD4+CD28- T cell and CD4+CD25+ regulatory T cell subsets in patients with coronary heart disease. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao 2007; 27 (4): 474—476.
35. Simon T., Taleb S., Danchin N. et al. Circulating levels of interleukin-17 and cardiovascular outcomes in patients with acute myocardial infarction. Eur Heart J 2013; 34 (8): 570—577.
36. Li Q., Wang Y., Chen K. et al. The role of oxidized low-density lipoprotein in breaking peripheral Th17/Treg balance in patients with acute coronary syndrome. Biochem Biophys Res Commun 2010; 394 (3): 836—842.
37. Ammirati E., Cianflone D., Banfi M. et al. Circulating CD4+CD25hiCD127lo regulatory T-Cell levels do not reflect the extent or severity of carotid and coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010; 30 (9): 1832—1841.
38. B0yum A., L0vhaug D., Tresland L., Nordlie E.M. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand J Immunol 1991; 34 (6): 697—712.
39. WangH.Y., Gao W.T., He Q.H. et al. Endogenous glucocorticoid increases the basal level of Treg-Th17 balance under early phase of stress. Chin J Traumatol 2012; 15 (6): 323—328.
40. Afshan G., Afzal N., Qureshi S. CD4+CD25(hi) regulatory T cells in healthy males and females mediate gender difference in the prevalence of autoimmune diseases. Clin Lab 2012; 58 (5—6): 567—571.
41. Fessler J., Ficjan A., Duftner C. et al. The impact of aging on regulatory T-cells. Front Immunol 2013; 4: 231.
42. George J., Schwartzenberg S., Medvedovsky D. et al. Regulatory T
Taleb S., Romain M., Ramkhelawon B. et al. Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis. J Exp Med 2009; 206: 2067—2077. Zhao Z., Qi Y.Z., Yuan Z.Y. et al. Changes of Foxp3(+); regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 2011; 27 (8): 893—895.
cells and IL-10 levels are reduced in patients with vulnerable coronary plaques. Atherosclerosis 2012; 222 (2): 519—523.
43. Wigren M., Bjôrkbacka H., Andersson L. et al. Low levels of circulating CD4+FoxP3+ T cells are associated with an increased risk for development of myocardial infarction but not for stroke. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2012; 32 (8): 2000—2004.
Поступила 21.11.2013
