CC BY
40© Коллектив авторов, 2013 УДК 616-092:612.017.1] =092:612.6.05:577.21
АНАЛИЗ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК CD4+CD25+FOXP3+ ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
С.Н. Быковская1, 2, доктор медицинских наук, профессор, А.В. Карасев1, А.В. Лохонина1, Е.Б. Клейменова1, доктор медицинских наук
'Медицинский центр Банка России, Москва, 2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва
E-mail: stemcell@inbox.ru
Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+FoxP3+CD127°w (Т ) относятся к небольшой субпопуляции CD4+ Т-клеток с супрес-сорными свойствами, которые играют критическую роль в поддержании аутотолерантности и иммунного гомеостаза. Функция Трег направлена на подавление воспаления и аутоиммунных реакций и определяется генетическими факторами, в частности, фактором транскрипции FoxP3. Нарушение функции FoxP3 ассоциируется с дефективной Т-клеточной регуляцией и аутоиммунным воспалением. У больных системной красной волчанкой, сахарным диабетом типа 1, неспецифическим язвенным колитом, тиреоидитом и другими аутоиммунными заболеваниями выявляются пониженная экспрессия FoxP3 и дефективная регуляция Т-клеток. Нами показаны снижение у больных количества циркулирующих Т и нарушение их супрессорной функции. Количество Т уменьшалось при обострении и повышалось в период ремиссии. Способность подавлять пролиферацию Т-клеток in vitro, выделенными из крови больных циркулирующими Тре, значительно ниже, чем клетками здоровых доноров. Иммунофе-нотип клеток крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями и показателями количества Т может служить диагностическим тестом для определения клинического статуса, как предиктор обострения и прогностический фактор, касающийся результатов лечения.
Ключевые слова: регуляторные T-клетки, аутоиммунные заболевания
CD4+CD25+FOXP3+ T REGULATORY CELL ANALYSIS IN AUTOIMMUNE DISEASES S.N. Bykovskaya1,2, A.V. Karasev1, A.V. Lokhonina1, E.B. Kleimenova'
'Medical Center of the Bank of Russia, 2The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov, Moscow
Regulatory T-cells CD4+CD25+FoxP3+CD127ow (Тгее) belong to the family of CD4+ T-cell subpopulation. Tregs display the suppressive activity and play a critical role in regulation and maintenance of autotolerance and immune homeostasis. The generation and differentiation of Tregs controlled by the transcription factor FoxP3, provide their ability of inhibition both of inflammation and autoimmune reactions. Dysfunction ofFoxP3 is associated with the defective T-cell regulation and autoimmune aggression. Patients with systemic lupus erythematosus (SIE), type I diabetes, inflammatory bowel diseases, thyroiditis and other autoimmune diseases demonstrate lower expression of FoxP3 and defective regulation of Treg function. Recently, we have shown downregulation of number and inhibited suppressive function of circulating Tregs in patients with remitting relapsing multiple sclerosis (RRMS) and SIE. Number of Treg cells dropped during the periods of relapse and elevated in remission. Increasing the duration and severity of disease was followed by the decline of Treg cell numbers. The ability of circulating T-cells separated from peripheral blood of patients to inhibit proliferation in vitro was lower in comparison with the same ability ofT of healthy control donors. The circulating Tregs count in patients with autoimmune diseases may serve as a diagnostic test for estimation of relapse, and/or indicator for therapy.
Key words: regulatory T-cells, autoimmune diseases
Аутоиммунные заболевания характеризуются длительным хроническим течением с развивающейся тяжелой инвалидизацией и летальным исходом. Аутоиммунные заболевания возникают вследствие активации Т- и В-лимфоцитов, специфичных против собственных клеток организма, что приводит к повреждению и потере функции тканей и органов больного. В основе этой патологии лежит генетически опосредованное нарушение механизмов толерантности, которые в норме обеспечивают
поддержание общего баланса иммунной системы организма [3].
Лечение аутоиммунных заболеваний сводится главным образом к применению иммуносупрес-сивной терапии, которая подавляет пролиферацию и функциональную активность большинства клеток иммунной системы, что вызывает появление тяжелых побочных эффектов. В естественных условиях в организме человека гомеостаз клеток иммунной системы осуществляется за счет баланса
между Т- и В-лимфоцитами, которые опосредуют цитотоксическую провоспалительную активность, и супрессорными клетками, направленными на подавление функции этих клеток, т.е. на подавление воспаления.
Известно несколько субклассов Т-клеток, выполняющих супрессорные функции. Прежде всего, натив-ные, возникающие в тимусе регуляторные Т-клетки CD4+CD25+FoxP3+ (Трег); кроме того, выявлены индуцируемые регуляторные Т-клетки 1 типа (Трег 1), образованные на периферии, продуцирующие интер-лейкин-10 (ИЛ-10) и трансформирующий ростовой фактор-ß (TGFß), которые подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов; супрессорной активностью обладают также Т-лимфоциты хелперы 3-го типа (Th3), которые возникают на периферии и опосредуют супрессию через секрецию TGFß. Поскольку Трег 1 и Th3 не имеют своего уникального Т-клеточного маркера, они могут быть идентифицированы только по функциональной активности в экспериментальных условиях [22].
Регуляторной функцией обладают также индуцируемые на периферии CD8+ Трег, двойные негативные регуляторные Т-клетки CD3+CD4-CD8-, NK Трег CD4+Va14+ NKT, и у5 T-клетки. Выявлено 4 возможных механизма действия Трег: секреция ингибиторных цитокинов (ИЛ10 и TGFß), апоптоз эффекторных лимфоцитов, индуцированный молекулами гранзи-мов и перфоринов, ингибиция продукции цитокинов в эффекторных Т-клетках, ведущая к их апоптозу, подавление функции дендритных клеток [30]. Однако общее количество таких регуляторных клеток крайне мало, их применение в практической медицине проблематично.
РЕГУЛЯТОРНЫЕ В10-КЛЕТКИ
Недавно идентифицирован субкласс регулятор-ных В-клеток, секретирующих ИЛ10. Фенотипиче-ски эта субпопуляция В-клеток характеризуется как CD1hiCD5+CD19hi. Субкласс В10-клеток специфически подавляет активацию и воспалительные реакции Т-лимфоцитов через продукцию ИЛ10. Клетки В10 проявляют себя как негативные регуляторы при аутоиммунных заболеваниях у мышей [9]. В норме у человека выявляется всего около 1% В10-клеток, и пока мало известно, какую роль эти клетки играют при аутоиммунных заболеваниях.
РОЛЬ Т В ИММУННЫХ РЕАКЦИЯХ
рег 1
Трег представляют собой уникальную линию Т-лимфоцитов, которые играют ключевую роль в создании толерантности к аутоантигенам и предотвращении аутоиммунных заболеваний и аллергии. Более того, Трег играют основную роль в контроле трансплантационной толерантности. Роль Трег впервые продемонстрирована на мышах 2 группами ученых в 1990 г. (S. Sakaguchi с сотрудниками и В. Hall с
сотрудниками), которые показали, что тимэктомия, проведенная до 4-5-го дня неонатального периода, приводит к появлению аутоиммунных заболеваний, таких, как гастрит, тиреоидит, сахарный диабет (СД), воспалительные заболевания кишечника [13, 34].
В многочисленных исследованиях на моделях аутоиммунных заболеваний у животных показано, что развитие такого заболевания может быть купировано адоптивным переносом Трег [35]. В последующем выяснилось, что под контролем фактора транскрипции forkhead box P3 (FoxP3) в тимусе происходит позитивная селекция Трег, где они взаимодействуют с интратимическим эпителием, эспрессирующим молекулы 2-го класса гистосовместимости, где идет отбор Трег, «знакомых» с собственными клетками организма. Таким образом, на периферии Трег играют центральную роль в поддержании толерантности, подавляя губительные аутоиммунные Т-клетки в тканях и органах и, как следствие, потеря Трег функции, очевидно, является фундаментальным фактором аутоиммунитета [16].
Таким образом, была открыта и охарактеризована субпопуляция Т-клеток, которые могут быть использованы для создания толерантности к аутоантигенам и подавления реактивности Т- и В-лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях. Подробное изучение биологических свойств и поверхностных маркеров этих клеток должно помочь в понимании их функции и применении в практической медицине.
ХАРАКТЕРИСТИКИ Т :
« рег
СВОЙСТВА, МАРКЕРЫ, РОЛЬ FOXP3+
Т впервые выявлены по экспрессии CD25, ко-
рег r г '
торый представляет собой а-цепь высокоаффинного рецептора к ИЛ2. В крови человека определяется примерно 4—6% CD4+CD25+ T-клеток с высоким уровнем экспрессии CD25, обладающих супрессор-ной функцией. Однако CD25 может кратковременно экспрессироваться и на активированных CD4+CD25+ эффекторных Т-клетках, что осложняет точное определение Трег. Позднее была выявлена субпопуляция CD4+CD25hi Т-клеток, которые и осуществляют супрессорные функции, тогда как клетки с низкой экспрессией а-цепи рецептора ИЛ2, CD4+CD25low регуляторной функцией не обладают и, очевидно, представляют собой эффекторные CD4+ Т-клетки в стадии активации [5].
Недавние исследования показали, что фактор транскрипции Foxp3 выявляется главным образом в ядре Трег и играет ключевую роль в их развитии и функции. Дефект Трег вследствие мутации гена Foxp3 вызывает развитие тяжелого аутоиммунного синдрома IPEX (Х-сцепленная иммунная дизрегуля-ция, полиэндокринопатия, энтеропатия) — тяжелого наследственного заболевания у детей [11]. Однако следует помнить, что FoxP3 также может времен-
но выявляться у эффекторных Т-клеток в ходе их активации. В последние годы выявлен негативный маркер Трег, CD127, a-цепь рецептора ИЛ7 (M.H7Ra) [21], который экспрессируется на эффекторных, но не регуляторных Т-клетках. Фенотип Трег при использовании этого маркера можно представить как CD4+CD25+FoxP3+CD127low, таким образом появилась возможность дифференцировать Трег и эффек-торные CD4+CD25+ Т-клетки.
Уникальные маркерные характеристики Трег позволяют выделить их из крови пациента, культивировать ex vivo и вырастить значительные количества этих клеток с целью последующей иммунотерапии.
Помимо перечисленных выше уникальных для Трег молекул, эти клетки экспрессируют цитотокси-ческий ассоциированный с Т-лимфоцитами анти-ген-4 (CTLA-4), который, очевидно, определяет их цитотоксические свойства по отношению к клеткам-мишеням; глюкокортикоид-индуцированный TNF-рецептор a-семейства GITR [33], который вовлечен в процессы супрессорной активности Трег; CD 103 (aE-интегрин), CD62L (L-селектин), «рецептор хоминга» для лимфоцитов, проникающих в лимфоид-ные ткани, а также некоторые из toll-like-рецепторов (TLR).
Трег CD4+ обнаруживают усиленную экспрессию CD45RO, маркера клеток памяти, однако недавно было показано, что существует субпопуляция Трег, на мембране которых выявляется CD45RA, маркер наивных Т-клеток, что указывает на их тимусное происхождение и позволяет отличить натуральные Трег от индуцированных на периферии. Изучение рецепторов и лигандов, расположенных на мембране Трег, дает возможность выявить пути миграции и функциональные свойства этих клеток.
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
И МЕХАНИЗМЫ СУПРЕССИИ Т
рег
Сами по себе Трег анергичны, не секретируют ИЛ2 и в экспериментах in vitro не пролиферируют в ответ на стимуляцию Т-клеточного рецептора. Для генерации и функционирования Т ег необходимо присутствие ИЛ2 [10].
Трег клетки характеризует способность подавлять механизмы воспаления. Эти клетки контролируют различные типы иммунного ответа, которые включают подавление функций эффекторных Т-лимфоцитов CD8+ [31], Т-хелперов CD4+CD25- [19], макрофагов, NK [37] и B-клеток [49]. Методы оценки функциональной активности Трег in vitro основаны на определении ингибиции пролиферации или подавления продукции цитокинов эффекторными Т-клетками, кокультивируемыми с Трег.
Механизмы супрессии до конца не выяснены. В ряде исследований показано, что супрессорный эффект Трег опосредован межклеточным контактом с клеткой-мишенью [19]. В экспериментах с исполь-
зованием трансгенных мышеи найдено несколько молекул, которые могут быть вовлечены в цитоток-сический эффект Т — таких, как GITR, CTLA-4,
т т рег ? ? ^
СБ223, связанный с клетками СБ4+ [40]. Важную роль в иммуносупрессии, опосредованной Трег, играют ингибиторные цитокины TGF и ИЛ10 [33]. Недавно обнаружен еще один цитокин, ИЛ35, секретируемый Трег, который действует на клетки-мишени дистанционно [29].
Дендритные клетки (ДК) играют ключевую роль в инициации иммунного ответа. Роль этих клеток заключается в поглощении антигена, который затем подвергается расщеплению (процессингу) и последующей презентации антигенной детерминанты в ассоциации с антигенами 2-го класса гистосовме-стимости наивным Т-клеткам. В спокойном состоянии незрелые «резидентные» ДК находятся в тканях. Незрелые ДК экспрессируют низкие уровни МНС II (молекул 2-го класса гистосовместимости), костиму-ляторных молекул и провоспалительных цитокинов. Захват антигена сопровождается сигналами опасности, высвобождаемыми поврежденными тканями. На эти сигналы реагируют связанные с мембраной или цитоплазматические поё-Ике-рецепторы (NLR), запускается процесс созревания ДК, который сопровождается экспрессией МНС II и костимуляторных молекул СБ40, СБ80, и СБ86, а также провоспали-тельных цитокинов, активирующих Т-клетки — таких, как ИЛ1Р, ИЛ6 и ИЛ12 [6].
В случаях, когда ДК захватили антиген, но не получили сигнала от или NLR-лигандов, они
превращаются в «полузрелые» ДК, которые экспрес-сируют высокий уровень молекул МНС II, но не обнаруживают экспрессии костимуляторных молекул и провоспалительных цитокинов и проявляют то-лерогенные (в противоположность иммуногенным) свойства [6]. Толерогенные ДК превращают наивные Т-клетки в FoxP3+ Трег, секретирующие супрессивные толерогенные факторы, такие, как ИЛ10, TGF, рети-ноевая кислота и лиганды программированной смерти [20]. Эти данные демонстрируют критическую роль дендритных клеток при генерации Трег и означают, что незрелые аутологичные дендритные клетки можно будет применять для индукции Трег в организме пациента.
Дисфункция Т . Функциональный дефект Трег выявлен при многих аутоиммунных заболеваниях — таких, как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, множественный склероз, СД типа 1, воспалительные заболевания кишечника, псориаз [2].
Пониженная активность Трег при аутоиммунных заболеваниях может быть следствием дефекта одного из механизмов, влияющих на их жизнедеятельность. Это может быть неадекватная экспрессия клеточных поверхностных молекул, вовлеченных в механизм контактзависимой супрессии, таких, как
CTLA-4, CD39, CD223, FAS-лиганд (CD95), гран-зим А, а также утрата способности секретировать растворимые факторы TGF, ИЛ10, ИЛ35, которые вовлечены в механизмы супрессии. Влияние на механизмы иммуносупрессии оказывают прежде всего генетические факторы. Имеет значение также локальное расположение иммунокомпетентных клеток, участие антигенпрезентирующих клеток и ци-токинов (таких, как TNF), которые могут влиять на функцию Трег [45].
Дефективная продукция и пониженная активность ИЛ2 относятся к факторам, вовлеченным в процесс иммунной дизрегуляции. К примеру, у больных СКВ выявлена дизрегуляция продукции не только ИЛ2, но и других членов семейства этого цитокина (ИЛ15, ИЛ21). Показано, что регуляторы транскрипции, ответственные за подавление продукции ИЛ2 в Т-клетках больных СКВ, находятся в состоянии дисбаланса, что объясняет редуцированный уровень ИЛ2, выявленный у больных СКВ [15]. Введение умеренных доз экзогенного ИЛ2 может устранить дисбаланс и нормализовать функцию Трег у больных.
С другой стороны, воспаление и разрушение тканей может быть связано с таким фактором, как резистентность эффекторных Т-клеток к супрессорному воздействию Т-регуляторов, как, например, показано не только в моделях аутоиммунных заболеваний у животных, но и у пациентов с СКВ и СД типа 1.
НАТУРАЛЬНЫЕ И ИНДУЦИРОВАННЫЕ Трег
CD4+CD25+FoxP3+ регуляторные Т-клетки подразделяют на 2 основных группы: натуральные Трег, возникшие в тимусе, и Трег, индуцированные на периферии de novo из пула предшественников наивных CD4+ Т-клеток после встречи с экзогенным антигеном при участии ИЛ2 и TGFß. Обе субпопуляции экспрессируют FoxP3 и подавляют иммунный ответ через контактзависимый механизм и продукцию растворимых факторов, включая цитокины TGF, ИЛ10 и ИЛ35 [45]. Регуляторные Т-клетки тимусного происхождения CD4+CD25+FoxP3+ сохраняют маркерные характеристики, супрессорную функцию и экс-прессируют FoxP3. Недавно способность различать натуральные Трег тимусного происхождения от Трег, индуцированных на периферии, была облегчена открытием специфических мест диметилирования в промотере FoxP3 и экспрессии ядерного протеина Helios, который уникален для натуральных Трег тимусного происхождения [39].
Адаптивные Трег клетки могут быть индуцированы из популяции клеток CD4+FoxP3+ после стимуляции Т-клеточного рецептора в присутствии TGFß и ИЛ2. Эти клетки экспрессируют те же клеточные маркеры, что и натуральные Трег, и подавляют иммунный ответ через цитокины и контактзависимые механизмы. Их можно отличить от натуральных Т
рег
по признакам метилирования FoxP3 и отсутствию экспрессии Helios.
Поскольку маркерные характеристики и функциональная активность индуцированных de novo Трег полностью совпадает с биологическими свойствами нативных Трег, образованных в тимусе, появляется возможность индуцировать Трег ex vivo, в стерильных условиях, для последующего введения тому же пациенту, у которого была взята кровь для сепарации и культивирования клеток-предшественников.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК
Факторы, которые способствуют развитию тимуса, периферическому росту и выживаемости Трег, оказывают влияние на экспрессию FoxP3. Такие факторы включают CD28, TGFp, дендритные клетки и общий цитокиновый рецептор, у-цепь (ус) цитоки-нов ИЛ2, ИЛ4, ИЛ7, ИЛ15. Регуляторные Т-клетки можно индуцировать in vitro культивированием с ИЛ2 и одновременной стимуляцией Т-клеточного рецептора антителами к CD3 и костимулирующим молекулам CD28.
СНИЖЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т ПРИ АУТОИММУННЫХ
рег
ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА
В последние годы получены многочисленные сведения о роли Трег в патогенезе различных аутоиммунных заболеваний. Среди них такие тяжелые хронические заболевания, как ревматоидный артрит, СКВ [42], рассеянный склероз [1], аутоиммунный поли-гландулярный синдром II типа, бронхиальная астма, псориаз, атопический дерматит, СД типа 1.
Редуцированное содержание циркулирующих CD4+CD25hi T-клеток у пациентов с аутоиммунной патологией коррелирует с тяжестью заболевания и плохим прогнозом. Чтобы пролить свет на патологические нарушения, связанные с этими заболеваниями, был проведен количественный и качественный анализ Т у больных. Результаты показали, что
рег J J '
Трег дефективны в большинстве аутоиммунных заболеваний.
Системная красная волчанка. Для СКВ характерны множественные дефекты иммунной системы, в том числе гиперактивность В-клеток, дефекты процессов лимфоидной активации, нарушение продукции цитокинов. У пациентов с СКВ выявлено снижение содержания СD4+СD25+ Трег-клеток в периферической крови. Это снижение коррелирует с активностью СКВ, подавлением синтеза ИЛ10 и TGFp. У детей, страдающих СКВ, снижение СD4+СD25+ Т-клеток в периферической крови коррелирует с тяжестью заболевания. При этом в популяции СD4+СD25+ Т-клеток, выделенных из крови больных в период обострения СКВ, выявле-
на гиперэкспрессия GITR, а в общей популяции CD4+ Т-клеток найдено повышенное содержание мРНК, кодирующей экспрессию CTLA-4 и FохРЗ. Показано также, что у пациентов с СКВ в период обострения снижение уровня Трег не связано с их перемещением в периферические лимфатические узлы или пораженные органы [26]. По мнению авторов, исчезновение Т обусловлено повышением
г ' рег J
их чувствительности к апоптозу, опосредованному Fas-лигандом.
Нами обследованы 43 пациента с СКВ [24]. Уровень клеток CD4+CD25highFoxP3+ у исследованных больных был значительно редуцирован, пропорция Трег в группе доноров была более чем в 2 раза выше, чем в группе больных. Анализ первичных нелеченых больных по сравнению с ранее лечеными пациентами и донорами выявил существенно пониженные количества Трег. Супрессорная активность регулятор-ных Т-клеток, выделенных из периферической крови больных, была редуцирована. Наши экспериментальные результаты в смешанной культуре лимфоцитов показали, что Трег больных подавляют пролиферацию эффекторных CD4+CD25- или CD8+ Т-клеток только на 35—55%, тогда как клетки доноров ингибируют пролиферацию на 100%.
Рассеянный склероз (РС). На ранней стадии заболевания аутореактивные Т-клетки попадают в ЦНС, где происходят их реактивация резидентными анти-генпрезентирующими клетками, представляющими миелиновые антигены, рекрутирование наивных иммунных клеток, запускается каскад иммунных реакций. Это локальное воспаление приводит к повреждению миелиновой оболочки, олигодендроцитов и аксонов и в результате — к появлению типичных неврологических симптомов у больных РС. Иммунные клеточные инфильтраты и бляшки демиелинизации в головном и спинном мозге служат наглядным патологическим признаком.
Принято считать, что патогенетические мие-линреактивные Трег у пациентов с РС не подвергаются периферической толерантности из-за нарушенной в организме иммунорегуляции [1]. Экспрессия продукта гена FoxP3 может быть измерена методом обратной транскрипции mRNA (RT-PCR) или путем определения белка методом western blotting. Эти исследования показали низкую экспрессию уровня FoxP3 в популяции Т-клеток CD4CD25+ от больных РС по сравнению с таковой у здоровых (контроль) [17]. Аналогичные результаты продемонстрированы и другими авторами. Сопоставление обострения и ремиссии заболевания выявило значимо низкий уровень Трег в активной фазе рассеянного склероза и дефект функциональной активности Трег, независимо от стадии аутоиммунного процесса.
По данным J. Haas и соавт. [30], количество Трег равномерно распределено между кровью и церебро-
спинальной жидкостью (ЦСЖ) больных РС, тогда как результаты лаборатории K. Venken и соавт. [42] показывают, что содержание Трег при РС достоверно больше в ЦСЖ, чем в периферической крови. В исследованиях J. Haas [12] показано снижение супрес-сорных функций Трег в крови больных РС вследствие изменения гомеостаза и нарушенного высвобождения Трег из тимуса, тогда как другие авторы считают, что функциональный дефект Трег связан с низким уровнем экспрессии мРНК и подавлением секреции ИЛ10.
Есть данные о роли Трег непосредственно в месте паренхиматозного воспаления в ЦНС. По существу, Трег в пределах ЦНС могут противодействовать воспалительным компонентам, обеспечивая противовоспалительный и нейропротективный эффекты. У больных РС это может подтверждаться обнаружением Трег в ЦСЖ и их количественным преобладанием по сравнению с содержанием в периферической крови, особенно при обострении процесса. Некоторые авторы полагают, что эти результаты могут быть связаны с увеличением миграции Трег из крови в место воспаления при РС или могут отражать de novo поколения Трег в участке воспаления ЦНС.
По нашим собственным данным [1], клетки крови 52 пациентов с РРС в стадии обострения (по шкале EDSS) были исследованы методом флоуцитоме-трии, в том числе 18 пациентов — и при обострении, и в период ремиссии. Мы выявили редуцированное количество Трег у больных в стадии обострения (1,33+0,95%), которое повышалось вдвое в стадии ремиссии (2,47+1,72), но не достигало уровня у здоровых доноров (3,52+1,37%). Супрессорная функция Трег больных была редуцирована и при обострении, и во время ремиссии. Содержание Трег уменьшалось с увеличением длительности заболевания и по мере его прогрессирования. Мы показали обратную зависимость между количеством Трег и тяжестью заболевания, определяемого по шкале EDSS. Количество Трег составляло 1,97+0,9% в группе больных с продолжительностью заболевания <36 мес и 0,73+0,4% — при ее увеличении до 88,5+45,1 мес, что свидетельствует о важной роли Трег в прогрессировании заболевания.
СД типа 1 — аутоиммунное заболевание, которое возникает в результате воспаления и деструкции инсулинпродуцирующих клеток островков поджелудочной железы. В результате больные на протяжении всей жизни остаются зависимы от инсулиновой терапии. Это заболевание связывают с нарушением регу-ляторной функции Т-клеток.
В первых исследованиях было показано, что количество циркулирующих Трег, которые определяли по экспрессии CD25+ в популяции CD4+ Т-клеток, понижено. Однако в последующих работах, где Трег оценивали по экспрессии CD4+CD25hi или CD4+FохP3+CD45RA+, эти результаты не под-
твердились; было показано, что количество циркулирующих Трег у больных СД типа 1 не отличается от такового у здоровых доноров [7]. Хотя общее количество циркулирующих Трег у пациентов выглядит нормальным, функция этих клеток в местах активного воспаления оказалась нарушена. Недавно было показано, что выживание в местах воспаления и функциональная активность Трег больных редуцированы. Гистологическое исследование островков Лангерганса, взятых у пациентов немедленно после смерти, продемонстрировало незначительное количество Т-клеток FохP3+ [44].
Функциональный дефект Трег у больных СД типа 1 изучен несколькими группами ученых. Трег больных, выделенные на магнитных шариках или методом флоуцитометрии, характеризуются пониженной су-прессорной функцией при кокультивировании с ауто-логичными эффекторными Т-клетками CD4+CD25-[32].
Недавно выявлен еще один аспект проблемы: резистентность эффекторных Т-клеток больных СД типа 1 (особенно долго болеющих) к супрессивному действию Трег. Двумя группами исследователей показано, что резистентность свойственна эффекторным Т-клеткам и не зависит от природы Трег (нативные или индуцированные).
Нарушенная функция Трег может быть связана с пониженной секрецией ИЛ2. S. Long и соавт. [23] нашли, что у больных СД понижена способность отвечать на ИЛ2; авторы сопоставляют этот дефект с низкой экспрессией FохP3. ИЛ2-сигналинг критичен для генерации, выживания и функционирования Т . Сами по себе Т не секретируют ИЛ2 и
рег рег r r J
полностью зависят от его продукции обычными Т-клетками. У страдающих СД типа 1 продукция ИЛ2 редуцирована и, как следствие, выявляется дисфункция Трег. Эти дефекты Трег включают пониженную экспрессию протеина FoxP3, подавленную супрессорную активность и усиленный апоптоз [38]. Следовательно, кратковременное лечение ИЛ2 для восстановления пула Трег может быть эффективным с целью поддержания толерантности у больных СД типа 1. Показано также, что низкие дозы ИЛ2 усиливают экспрессию CD25+ и Bcl-2 в Трег, расположенных в островках Лангерганса, что позволяет достичь долговременной протекции от обострений. Напротив, высокие концентрации ИЛ2 усиливают иммунный ответ и обостряют течение заболевания у NOD-мышей. Возможно, подбор дозы и режима терапии ИЛ2 найдут свое применение для больных СД типа 1.
Неспецифический язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) — идиопатическое неспецифическое воспаление кишечника, протекающее с периодическими обострениями и ремиссиями. ЯК и БК поражают миллионы людей во всем мире. Показано, что иммунная патология у таких больных отражает
неадекватную функцию Трег. Например, в периферической крови пациентов с обострением ЯК отмечено пониженное содержание Трег по сравнению с показателями у тех же больных в стадии ремиссии [46]. Трег играют важную роль в контроле воспаления слизистой оболочки кишечника, ограничивая развитие Т-клеточного ответа на собственные бактерии и способствуя иммунному ответу на патогенную микрофлору.
При изучении содержания и функциональных характеристик Трег, локализованных в мезенте-риальных лимфатических узлах, выявлено повышенное количество этих клеток у больных с ЯК по сравнению с таковым у здоровых доноров. Т-клетки CD4+CD25+, выделенные из мезентериальных лимфатических узлов пациентов с ЯК, экспрессиру-ют FoxP3+ и, несмотря на активное воспаление в слизистой оболочке кишечника, демонстрируют свойства Трег. Эти клетки проявляют супрессорную активность in vitro, ингибируя пролиферацию эф-фекторных CD4+CD25- Т-клеток и подавляя продукцию цитокинов Th1 (IFN, ИЛ2) и Th2 (ИЛ5, ИЛ13) [47].
Действительно, у пациентов с БК клетки FохP3+CD4+ аккумулируются в участках активного мукозального воспаления, включая гранулемы, однако их количество в периферической крови больных с обострением БК значительно понижено. Клетки CD4+CD25+, выделенные из брызжеечных лимфатических узлов пациентов с БК, и при ремиссии, и в период обострения усиливают экспрессию FoxP3+ при стимуляции in vitro и подавляют пролиферацию эффекторных Т-клеток CD4+CD25- [36].
Оценка процентного содержания Трег, определяемых маркерами CD4+ и FохP3+ в популяции моно-нуклеарных клеток (МНК) периферической крови, по сравнению с количеством Т слизистой оболоч-
рег
ки прямой кишки у больных БК и ЯК, выявила пониженное содержание Трег в периферической крови больных и аккумуляцию этих клеток в воспаленной мукозе. Авторы предполагают, что функция Трег может быть частично подавлена, что становится причиной обострений этого заболевания [43].
По мнению С. Veitkamp и соавт. [41], дефицит Трег может вести к недостаточной компенсации хронически активированных Т-лимфоцитов. Авторы проанализировали роль апоптоза в клетках CD4+FoxP3+ на срезах тканей больных в период обострения методом иммуноцитохимии и TUNEL, а также в клетках периферической крови CD4+CD25+FoxP3+ методом флоу-цитометрии и с помощью окраски на аннескин-V. Был выявлен повышенный апоптоз Т , расположен-
рег
ных в воспаленной слизистой оболочке (по сравнению с невоспаленной). Редуцированное количество и усиленный апоптоз Трег в периферической крови больных сопровождались повышенной активностью каспазы в их сыворотке.
Интестинальный гомеостаз представляет собой динамичный баланс между защитным иммунитетом хозяина и регуляторными супресссорны-ми механизмами. Нарушение иммунной регуляции кишечника ведет к его хроническому воспалению, и Трег играют важную роль в поддержании инте-стинального гомеостаза через механизмы активации супрессорных цитокинов, таких как ИЛ 10 и TGFp [18].
Псориаз. Аутоиммунное хроническое воспали -тельное заболевание кожи. Этим заболеванием в мире поражено 2—3% населения. Псориатические красные бляшки представляют собой опосредованные Т-клетками воспалительные образования в коже, характеризуемые эпидермальной гиперпролиферацией и аберрантно дифференцированным эпидермисом. В образцах биопсии кожи больных псориазом снижено количество FoxP3+ Т , особенно в
рег
острой фазе заболевания [48]. Как отмечалось выше, СВ4+СВ25ЫЕТохР3+ Т являются ингибиторами им-
рег
мунного ответа, однако в условиях воспаления эти клетки могут дифференцироваться в популяцию клеток ТЫ7. Это провоспалительные клетки, которые секретируют ИЛ17А и ИЛ22. В коже пациентов с тяжелой формой псориаза выявляются именно клетки ИЛ17А+^охР3+/СБ4+.
В последние годы исследователи изучают многочисленные факты, указывающие на связь псориаза с повышенным риском кардиоваскулярных заболеваний. Интересно, что факторы риска для больных псориазом, особенно при тяжелой форме заболевания, с высокой частотой совпадают с факторами риска у больных с кардиоваскулярной патологией и инфарктом миокарда. Более того, псориаз считают фактором риска при кардиоваскулярных заболеваниях [4]. Псориаз и атеросклероз характеризуют одинаковые воспалительные механизмы. В псориатических бляшках локальный выброс фактора некроза опухоли (ФНО) вовлекает дифферен-цировку иммунных клеток и цитокинов, инициирует пролиферацию кератиноцитов и образование бляшек. При атеросклерозе воспалительные клетки иммунной системы аккумулируются в местах поврежденного эндотелия и участвуют в образовании бляшек.
Эффект цитокинов, секретируемых субпопуляциями ТЫ и ТЫ 7, подавляется регуляторными Т-клетками. Противовоспалительный эффект Трег у больных псориазом и атеросклерозом патологически изменен. Впервые роль Трег в крови больных псориазом исследовали М. Каgen и соавт. [28]. Они не нашли большой разницы между содержанием Трег в периферической крови больных и у здоровых (волонтеры). Однако ингибиторная функция Трег у больных оказалась значительно понижена [28].
Атеросклероз. У пациентов с заболеванием коронарных артерий редуцировано количество и по-
давлена функция Трег. При атеросклерозе Трег могут служить источником или мишенью для TGFP, который является специфическим ингибитором секреции цитокинов Th1 и Th2. Ранее было показано, что у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) изменен «репертуар» Т-клеток, что выражается в усилении уровня продукции интерферона-у (ИФНу) клетками CD4+CD8-. Эти данные подтверждаются наблюдениями, согласно которым у больных ОКС повышено количество клеток с про-воспалительными цитокинами, ТЫ. Было предположено, что у таких больных подавлена функция Трег и, как следствие, понижена продукция противовоспалительных сигналов (ИЛ10, TGFP), что способствует экспансии и активации проатерогенных клеточных субпопуляций (таких, как ТЫ) [8, 14]. Это мнение поддерживают исследования, показавшие, что в плазме пациентов с распространенным атеросклерозом и ОКС редуцирована продукция TGFp и ИЛ10. Недавно было показано, что при одинаковой степени атеросклеротических изменений коронарных артерий у пациентов с ОКС значительно понижено количество натуральных Трег и редуцирована их функция по сравнению с Трег у больных со стабильной стенокардией [14]. Более того, Трег, взятые от пациентов с ОКС, более чувствительны к апоптозу, вызванному окисленными липопротеидами низкой плотности (ЛПНП).
Имеются скудные сведения о содержании Трег в атеросклеротических бляшках. О. De Boer и соавт. [8] сравнивали образцы нормальной артериальной стенки и адвентицию бляшек на разных стадиях созревания. Присутствие Трег определяли по экспрессии FoxP3 или GITR в популяции Т-клеток. Выяснилось, что в норме в стенке артерий не содержится Трег в адвентиции и интиме пораженных сосудов вы-являляется 0,5—5% Трег клеток, которые, как предполагается, играют роль в подавлении медленно текущего воспалительного процесса в атеросклеро-тических бляшках.
Эти результаты подтверждаются исследованиями S. Han и соавт. [14], которые показали, что у пациентов с нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокарда значительно редуцировано количество Т-регуляторных клеток, и что эта редукция обратимо коррелирует с повышенным содержанием клеток Th1, что выявлялось коэкспрессией маркеров CD3 и ИФНу.
Как известно, для подавления развития атеросклеротических ЛПНП применяют статины — лекарства, понижающие уровень общего холестерина и холестерина ЛПНП в крови. Механизм действия статинов связан с подавлением действия фермента ГМГ-КоА-редуктазы, участвующего в одном из этапов образования эндогенного холестерина в печени. Однако недавно был показан плейотропический эффект этих препаратов, предохраняющий также
эндотелий и оказывающий влияние на иммунную систему. K. Mausner-Fainberg и соавт. [25] обнаружили повышение количества циркулирующих Трег у больных в результате приема статинов. Более того, они показали in vitro, что препарат из группы ста-тинов индуцирует повышение количества FoxP3 экспрессирующих клеток и значительное усиление их ингибиторных свойств. Авторы предполагают, что статины могут приводить к конверсии периферических Т-хелперных клеток в адаптивные Т-регуляторы и что они оказывают сильное влияние на пул периферических Трег у человека. Авторы считают, что эти данные могут пролить свет на механизмы формирования и стабилизации атероскле-ротических бляшек.
Таким образом, индукция Трег in vivo или культивирование in vitro для последующей адоптивной иммунотерапии может остановить появление бляшек или предупредить их разрыв.
Атеросклероз не является классическим аутоиммунным заболеванием с известным аутоантигеном, однако можно предположить, что применение выращенных ex vivo, неспецифически стимулированных Трег, могло бы стать полезным дополнением в комплексе терапевтических мероприятий у больных ОКС.
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ Т
1 рег
Фенотипический анализ Т играет ключевую
рег
роль в клинике аутоиммунных заболеваний как при постановке диагноза, так и для оценки обострения заболевания. Иммунофенотип клеток крови больного может служить показателем обострения или стабилизации аутоиммунного процесса. К примеру, в норме пропорция CD8+ Т-клеток, ко-
торые включают субпопуляцию цитотоксических Т-лимфоцитов, составляет 18—24%, тогда как в стадии обострения у больных РС пропорция этих клеток повышается до 45—50%, а в стадии ремиссии сокращается до 25—35%. Соответственно при обострении пропорция CD4+ Т-клеток существенно понижается, и субпопуляция Трег (CD4+CD25+FoxP3+) падает в 2—3 раза. В результате соотношение Т-хелперы/ цитотоксические Т-лимфоциты (CD4/CD8) в крови больных уменьшается с 2 (уровень нормы) до 1 и ниже. Эти показатели могут служить прогностическим тестом для оценки надвигающегося обострения, подтверждением диагноза аутоиммунного заболевания и стимулом для начала терапевтических мероприятий.
ИММУНОТЕРАПИЯ
Как было показано выше, Трег-клетки представляют собой субпопуляцию долгоживущих неделящихся клеток. Трег, индуцированные ex vivo, по фенотипи-ческим и функциональным характеристикам не отличаются от нативных Трег, покинувших тимус. Это означает, что Трег, взятые у пациента и размноженные ex vivo, могут быть введены обратно тому же больному для восстановления дефицита Трег в его организме. В литературе описано несколько методов культивирования Трег с целью увеличения их количества [27]. Эти методы основаны на стимуляции Тег-клеток CD4+CD25+CD127low анти-CD3 и анти^2г8 антителами и ИЛ2.
Нами разработана методика экспансии Трег ex vivo, которая позволяет увеличить их количество в 500—1500 раз в течение 1 нед. Проведенные нами пилотные испытания показали безопасность и эффективность нового метода терапии аутоиммунных заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Елисеева Д.Д., Завалишин И.А., Караулов А.В. и др. Роль регуляторных Т-клеток в развитии аутоиммунных нарушений при рассеянном склерозе // Вестн. РАМН. - 2012; 3: 68-74.
2. Насонов Е.Л., Быковская С.Н. T-регуляторные клетки при аутоиммунных ревматических заболеваниях // Вестн. РАМН. - 2006; 9-10: 74-82.
3. Насонов Е.В. Перспективы лечения ревматических болезней в начале XXI века // Терапевт. архив. - 2011; 4: 5-9.
4. Armstrong E., Morrow D., Sabatine M. Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes: part II: acute-phase reactants and biomarkers of endothelial cell activation // Circulation. - 2006; 113 (7): 152-5.
5. Baecher-Allan C., Brown J., Freeman G. et al. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood // J. Immunol. - 2001; 167 (3): 1245-53.
6. Banchereau J., Briere F., Caux C. et al. Immunobiology of dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2000; 18: 767-811.
7. Brusko T., Wasserfall C., McGrail K. et al. No alterations in the frequency of FOXP3+ regu-
latory T-cells in type 1 diabetes // Diabetes.
- 2007; 56 (3): 604-12.
8. De Boer O., Van der Meer J., Teeling P. et al. Low numbers of FOXP3 positive regulatory T-cells are present in all developmental stages of human atherosclerotic lesions // PLoS One. - 2007; 2 (8): 779.
9. DiLillo D., Matsushita T., Tedder T. B10 cells and regulatory B cells balance immune responses during inflammation, autoim-munity, and cancer // Ann. N.Y. Acad. Sci.
- 2010; 1183: 38-57.
10. Fontenot J., Rasmussen J., Gavin M. et al. A function for interleukin 2 in Foxp3-ex-pressing regulatory T cells // Nat Immunol.
- 2005; 6 (11): 1142-51.
11. Gambineri E., Torgerson T., Ochs H. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked inheritance (IPEX), a syndrome of systemic autoimmunity caused by mutations of FOXP3,
a critical regulator of T-cell homeostasis // Curr. Opin. Rheumatol. - 2003; 15 (4): 430-5.
12. Haas J., Fritzsching B., Trübswetter P. et al. Prevalence of newly generated naive
regulatory T-cells (Treg) is critical for Treg suppressive function and determines Treg dysfunction in multiple sclerosis // J. Immunol. - 2007; 179 (2): 1322-30.
13. Hall B., Pearce N., Gurley K. et al. Specific unresponsiveness in rats with prolonged cardiac allograft survival after treatment with cyclosporine. III. Further characterization of the CD4+ suppressor cell and its mechanisms of action // J. Exp. Med. -1990; 171 (1): 141-57.
14. Han S., Liu P., Zhang W. et al. The opposite-direction modulation of CD4+CD25+ Tregs and T helper 1 cells in acute coronary syndromes // Clin. Immunol. - 2007; 124 (1): 90-7.
15. Hedrich C., Rauen T., Tsokos G. cAMP-responsive element modulator (CREM)a protein signaling mediates epigenetic remodeling of the human interleukin-2 gene: implications in systemic lupus erythematosus // J. Biol. Chem. -2011; 286 (50): 43429-36.
16. Hsieh C., Lee H., Lio C. Selection of regulatory T-cells in the thymus // Nat. Rev. Immunol. - 2012; 12 (3): 157-67.
17. Huan J., Culbertson N., Spencer L. et al. Decreased FOXP3 levels in multiple sclerosis patients // J. Neurosci. Res. - 2005; 81: 45-52.
18. Izcue A., Coombes J., Powrie F. Regulatory lymphocytes and intestinal inflammation // Annu. Rev. Immunol. - 2009; 27: 313-38.
19. Jonuleit, H., Schmitt E., Stassen M. et al. Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood // J. Exp. Med. - 2001; 193 (11): 1285-94.
20. Kretschmer K., Apostolou I., Hawiger D. et al. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen // Nat. Immunol. - 2005; 6 (12): 1219-27.
21. Liu W., Putnam A., Xu-Yu Z. et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T cells // J. Exp. Med. - 2006; 203 (7): 170g-11.
22. Loez-Hoyos M., Segundo D., Arias M. Cellular immunotolerance in the transplant // Adv. Exp. Med. Biol. - 2012;741: 44-59.
23. Long S., Cerosaletti K., Bollyky P. et al. Defects in IL-2R signaling contribute to diminished maintenance of FOXP3 expression in CD4(+)CD25(+) regulatory T-cells of type
1 diabetic subjects // Diabetes. - 2010; 59 (2): 407-15.
24. Lyssuk E., Torgashina A., Soloviev S. et al. Reduced number and function of CD4+CD25highFoxP3+ regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus // Adv. Exp. Med. Biol. - 2007; 601: 113-9.
25. Mausner-Fainberg K., Luboshits G., Mor A. et al. The effect of HMG-CoA reductase inhibitors on naturally occurring CD4+CD25+ T-cells. Atherosclerosis. - 2008; 197 (2): 829-39.
26. Miyara M., Amoura Z., Parizot C. et al. Global natural regulatory T-cell depletion in active systemic lupus erythematosus // J. Immunol. - 2005; 175 (12): 8392-400.
27. Montcuquet N., Mercier-Letondal P., Perruche S. et al. Regulatory T-cell expansion and function do not account for the impaired alloreactivity of ex vivo-expanded T-cells // Immunology. - 2008. ; 125 (3): 320-7.
28. Mor A., Luboshits G., Planer D. et al. Altered status of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells
in patients with acute coronary syndromes // Eur. Heart. J. - 2006; 27 (21): 2530-7.
29. Niedbala W., Wei X., Cai B. et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T-cells and suppression of Th17 cells // Eur. J. Immunol. - 2007; 37 (11): 3021-29.
30. Peterson R. Regulatory T-cells: diverse phe-notypes integral to immune homeostasis and suppression // Toxicol. Pathol. - 2012; 40: 186-204.
31. Piccirillo C., Shevach E. Control of CD8+ T-cell activation by CD4+CD25+ immu-noregulatory cells // J. Immunol. - 2001; 167 (3): 1137-40.
32. Putnam A., Vendrame F., Dotta F. et al. CD4+CD25high regulatory T cells in human autoimmune diabetes // J. Autoimmun. -2005; 24 (1): 55-62.
33. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T-cells in immunological tolerance to self and non-self // Nat. Immunol. - 2005; 6: 345-52.
34. Sakaguchi S. Thymus and autoimmunity: capacity of the normal thymus to produce pathogenic self-reactive T-cells and conditions required for their induction of autoimmune disease // J. Exp. Med. - 1990; 172 (2): 537-45.
35. Sakaguchi S., Ono M., Setoguchi R. et al. Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T-cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease // Immunol Rev. - 2006; 212:8-27.
36. Saruta M., Yu Q., Fleshner P. et al. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T-cells in Crohn's disease // Clin. Immunol. - 2007; 125 (3): 281-90.
37. Smyth M., Teng M., Swann J. et al. CD4+CD25+ T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer // J. Immunol. - 2006; 176 (3): 1582-7.
38. Tang Q., Adams J., Penaranda C. et al. Central role of defective interleukin-2 production in the triggering of islet autoimmune destruction // Immunity. - 2008; 28 (5): 687-97.
39. Thornton A., Korty P., Tran D. et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+
T regulatory cells // J. Immunol. - 2010; 184 (7): 3433-41.
40. Tsang J., Jiang S., Tanriver Y. et al. In-vitro generation and characterisation of murine CD4+CD25+ regulatory T-cells with indirect allospecificity // Int. Immunopharmacol. -2006; 6 (13-14): 1883-8.
41. Veltkamp C., Anstaett M., Wahl K., et al. Apoptosis of regulatory T lymphocytes is increased in chronic inflammatory bowel disease and reversed by anti-TNFa treatment // Gut. - 2011; 60 (10): 1345-53.
42. Venken K., Thewissen M., Hellings N. et al. Compromised CD4+ CD25(high) regulatory T-cell function in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is correlated with a reduced frequency of FOXP3-positive cells and reduced FOXP3 expression at the single-cell level // Immunology. - 2008; 123 (1): 79-89.
43. Wang Y., Liu X., Zhao Z. et al. Expression of CD4+ forkhead box P3 (FOXP3) + regulatory T-cells in inflammatory bowel disease // J. Dig. Dis. - 2011; 12 (4): 286-94.
44. Willcox A., Richardson S., Bone A. et al. Analysis of islet inflammation in human type 1 diabetes // Clin. Exp. Immunol. -2009; 155 (2): 173-81.
45. Workman C., Szymczak-Workman A., Colli-son L. et al. The development and function of regulatory T-cells // Cell. Mol. Life. Sci. -2009; 66 (16): 2603-22.
46. Yokoyama Y., Fukunaga K., Fukuda Y. et al. Demonstration of low-regulatory CD25High+CD4+ and high-pro-inflammatory CD28CD4+ T-Cell subsets in patients with ulcerative colitis: modified by selective granulocyte and monocyte adsorption apheresis // Dig. Dis. Sci. - 2007; 52 (10): 2725-31.
47. Yu Q., Saruta M., Avanesyan A. et al. Expression and functional characterization of FOXP3+ CD4+ regulatory T-cells in ulcerative colitis // Inflamm. Bowel. Dis. - 2007; 13 (2): 191-9.
48. Yun W., Lee D., Chang S. et al. Role of CD-4CD25FOXP3 Regulatory T-Cells in Psoriasis // Ann. Dermatol. - 2010; 22 (4): 397-403.
49. Zhao D., Thornton A., DiPaolo R. et al. Activated CD4+CD25+ T-cells selectively kill B lymphocytes // Blood. - 2006; 107 (10): 3925-32.
