CC BY
77
percutaneous radiofrequency ablation of 44 renal tumors in 31 patients: Analysis of predictors for complications and technical success. Cardiovasc. Intervent. Radiol. 2006; 29: 811-8.
5. Zlotta A. R., Wildschutz T., Raviv G. et al. Radiofrequency interstitial tumor ablation (RITA) is a possible new modality for treatment of renal cancer: Ex vivo and in vivo experience. J. En-dourol. 1997; 11: 251-8.
6. Nikfaijam M., Muralidharan V., Christophi C. Mechanisms of focal heat destruction of liver tumors J. Surg. Res. 2005; 127: 208-23.
7. Matuszewski M., Michajlowski J., Michajlowski I. et al. Impact of radiofrequency ablation on PBMC subpopulation in patients with renal cell carcinoma. Urol. Oncol. 2011; 29: 724-30.
8. Wissniowski T. T., Hansler J., Neureiter D. et al. Activation of tumorspecific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 2003; 63: 496-500.
9. Ali M. Y., Grimm C. F., Ritter M. et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 2005; 43: 817-22.
10. den Brok M. H., Sutmuller R. P., van der Voort R. et al. In situ tumor ablation creates an antigen source for the generation of antitumor immunity. Cancer Res. 2004; 64: 4024-9.
11. Hansler J., Wissniowski T. T., Schuppan D. et al. Activation and dramatically increased cytolytic activity of tumor specific T lymphocytes after radio-frequency ablation in patients with he-patocellular carcinoma and colorectal liver metastases. World J. Gastroenterol. 2006; 12: 3716-21.
12. Napoletano С., Taurino F., Biffoni M. et al. RFA strongly modulates the immune system and antitumor immune response in metastatic liver patients. Int. J. Oncol. 2008; 32: 481-90.
13. Rughetti A., Rahimi H., Rossi P. et al. Modulation of blood circulating immune cells by radiofrequency tumor ablation. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2003; 22: 247-50.
14. Yu H. C., Moon J. I., Jin Z. W. et al. Effect of radiofrequency ablation of the liver on cell mediated immunity in rats. World J. Surg. 2005; 29: 739-43.
15. Zerbini A., Pilli М., Penna A. et al. Radioffequency thermal ablation of hepatocellular carcinoma liver nodules can activate and enhance tumor-specific T-cell responses. Cancer Res. 2006; 66: 1139-46.
16. de Reijke T. M., Bellmunt J., van Poppel H. et al. EORTC-GU group expert opinion on metastatic renal cancer. Eur. J. Cancer. 2009; 45: 765-73.
17. Schueller G., Kettenbach J., Sedivy R. et al. Heat shock protein expression induced by percutaneous radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma in vivo. Int. J. Oncol. 2004; 24: 609-13.
18. Rai R., Richardson C., Flecknell P. et al. Study of apoptosis and heat shock protein (HSP) expression in hepatocytes following radiofrequency ablation (RFA). J. Surg. Res. 2005; 129: 147-51.
19. Pilla L., Squarcina P., Coppa J. et al. Natural killer and NK-Like T-cell activation in colorectal carcinoma patients treated with au-tologous tumor-derived heat shock protein 96. Cancer Res. 2005; 65: 3942-9.
Поступила 05.09.14 Received 05.09.14
© коллектив авторов, 2015 удк 616.133-004.6-07:616.155.32-078.33
Пылаева Е. А., Потехина А. В., Балахонова Т. В., Рулева Н. Ю., Масенко В. П., Ноева Е. А., Красникова Т. Л., Арефьеа Т. И.
эффекторные и регуляторные субпопуляции лимфоцитов крови у пациентов с атеросклерозом сонных артерий
ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, 121552, Москва, Россия
Введение. Хроническое воспаление артериальной стенки при атеросклерозе модулируется лимфоцитарными субпопуляциями. Эффекторные лимфоциты, включая Т-хелперы 1 типа (Tx1) и Т-хелперы 17 (Tx17), обладают провоспали-тельными свойствами, регуляторные Т-лимфоциты - противовоспалительными. Цель работы - исследование баланса циркулирующих Трег, Tx1 и Tx17 у больных с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий. Материал и методы: из 66 пациентов по данным УЗДС сонных артерий сформировали 3 группы: I - пациенты со стенозом менее 30% (n = 15), II - стеноз 30-50% (n = 29), III - стеноз более 50% (n = 22). У 22 пациентов выявлены нестабильные ате-росклеротические бляшки в сонных артериях. Лимфоциты типировали методом прямой иммуноцитофлюориметрии: Treg определяли как CD4+CD25highCD127low и как CD4+FoxP3+ лимфоциты, активированные Т-лимфоциты (Такт) - как CD4+CD25lowCD127high. Для анализа CD4+IL17a+Th17 и CD4+INFgamma+Th1 мононуклеарные клетки предварительно активировали в культуре. Уровни СРБ, IL-10, sCD25 и IL-17a в сыворотке определяли методами нефелометрии, хемилюминесценции (Immulite) и ИФА. Результаты: Содержание Tрег(CD4+CD25hi9hCD127low) ниже, а соотношение Тх1/Трег^4^25Ыд^1271™') выше в группе III по сравнению с группой I. Индекс Такт (cD4+CD25lowCD127hi9h)/ Трег^4^25М9^1271™') был выше, а соотношение Трег^4^25М9^127|™')Ях17 - ниже в группах II и III по сравнению с группой I. У пациентов с нестабильными АСБ соотношение Tрег(CD4+CD25hi9hCD127low)/Tx17 было ниже по сравнению с пациентами со стабильными АСБ. Содержание sCD25 (Ед/мл) было выше у пациентов II и III групп по сравнению с группой I. Корреляционный анализ показал наличие прямой связи между уровнем sCD25 и содержанием Tx17 и обратной связи между уровнем sCD25 и количеством Tрег(CD4+CD25hi9hCD127low) , соотношениями Tрег(CD4+CD25hi9hCD127low)/Tx17 и Трег^4Тс>хР3+уТх17. Заключение: При прогрессии и дестабилизации атеросклероза сонных артерий происходит нарушение баланса про- и противовоспалительных лимфоцитарных субпопуляций, отражением которого является изменение уровня sCD25.
Ключевые слова: атеросклероз; воспаление; регуляторные T-лимфоциты; T-хелперы 1 типа; T-хелперы 17; sCD25.
_Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(1): 38-44.
Для корреспонденции: Пылаева Екатерина Алексеевна, iamfrommsu@yandex.ru;
For correspondence: Pylaeva Ekaterina Alekseevna, iamfrommsu@yandex,ru
Pylaeva E. A., Potekhina A. V., Balakhonova T. V., Ruleva N. Y., Masenko V. P., Noeva E. A., Krasnikova T. L., Arefieva T. I. EFFECTOR AND REGULATORY BLOOD LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN CAROTID ATHEROSCLEROSIS
Russian Cardiology Research and Production Complex. 121552, Moscow, Russian
Objective: Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of artery wall regulated by T-lymphocyte subsets. Effector T cells (Teff), including T-helpers 1 (Th1) and T-helpers 17 (Th17) have proinflammatory properties while regulatory T-cells (Treg) were shown to possess anti-inflammatory activity. Aim: To investigate Treg, Th1 and Th17 balance in blood of patients with different stages of carotid atherosclerosis. Materials and methods: Based on carotid artery sonography, 66 subjects were categorized into 3 groups: having mild stenosis less than 30% (Gr.I, n = 15), moderate stenosis less than 50% (Gr.II, n = 29), severe stenosis 50% and above (Gr.III, n = 22). 22 patients (33%) were categorized as having unstable atherosclerotic plagues. Treg were identified as CD4+CD25highCD127low and CD4+FoxP3+cells, Tact - CD4+CD25lowCD127high, Thl7 - CD4+IL17a+, Th1 - CD4+INFgamma+cells. Serum levels of hsCRP, IL-10, sCD25 and IL-17a were analyzed by nephelometry, Immulite and ELISA, respectively. Results: CD4+CD25highCD127low Treg were lower and Th1/Treg (CD4+CD25highCD127low) ratio was higher in Gr.III than in Gr.I. Tact/Treg (CD4+CD25highCD127low) ratio was higher and Treg (CD4+CD25highCD127low)/Th17 ratio was lower in Gr.II and Gr.III compared with Gr.I. Treg (CD4+CD25highCD127low)/Th17 ratio was lower in patients with unstable than with stable carotid atherosclerotic plaques, sCD25 level was higher in Gr.II and Gr.III than in Gr.I and positively correlated with Th17 level, negatively correlated with CD4+CD25highCD127low Treg level and Treg CD4+CD25highCD127low/Th17 and CD4+FoxP3+Treg/Th17 ratios.
CD4+CD251owCD127high Tact level was higher in smokers than nonsmokers. Conclusion: The imbalance in pro- and anti-inflammatory lymphocyte subpopulations plays role in carotid atherosclerosis progression and destabilization. sCD25 level reflects the immune imbalance in carotid atherosclerosis.
Keywords: atherosclerosis, inflammation, regulatory T-cells, T-helper 1 cells, T-helper 17 cells, sCD25.
citation: Immunologiya. 2015; 36(1): 38-44.
введение.
Атеросклероз (АС) - хроническое воспалительное заболевание артериальной стенки, развивающееся на фоне накопления и модификации липопротеидов в интиме сосуда. Ранние стадии атерогенеза ассоциированы с внутриклеточными (жировые пятна и полоски), а затем и внеклеточными (т. н. преатерома) отложениями липидов, активацией эндоте-лиоцитов, гладкомышечных клеток, поступлением моноцитов из кровотока. На поздних стадиях АС образуются атеро-склеротические бляшки (АСБ), в которых могут развиваться признаки фиброза, кальциноза и деструкции. Наряду с макрофагами и пенистыми клетками в АСБ определяются лимфоциты, основную часть которых составляют CD4+-клетки и дендритные клетки, участвующие в презентации антигенов лимфоцитами [1-4]. По мнению большинства исследователей, аутоантигенами при атеросклерозе являются липопро-теиды и их производные, образующиеся в процессах окисления [5, 6].
Различные популяции лимфоцитов оказывают модулирующее влияние на течение воспалительного процесса в АСБ. В моделях АС у животных показана существенная роль Т-хелперов 1 типа (Тх1) и продуцируемого ими интерферона-гамма в прогрессировании заболевания [7, 8]. Проатерогенным действием, согласно большинству работ, также обладают секретирующие интерлейкин (ИЛ)-17 Т-хелперные клетки (Тх17) [9]. В свою очередь, регулятор-ные Т-лимфоциты (Трег) путем контактного взаимодействия и продукции «противовоспалительных» цитокинов ИЛ-10 и трансформирующего фактора роста-бета участвуют в подавлении роста АСБ [10-12]. Клинические данные указывают на снижение количества и активности циркулирующих Трег и увеличение содержания Тх1, Тх17 и ИЛ-17 в крови при остром коронарном синдроме (ОКС) - инфаркте миокарда и приступе нестабильной стенокардии [13, 14]. В единственном проспективном исследовании показано, что низкий уровень Трег в крови является независимым фактором риска инфаркта миокарда [15]. Исследования, выполненные у пациентов со «стабильным» коронарным АС, в частности, со стабильной стенокардией и стенотическими изменениями коронарных артерий, единичны. Аштгай с соавт. (2010) не обнаружили отклонений в содержании Трег у пациентов со стабильной стенокардией [16]. Следует отметить, что в данном исследовании разделение пациентов на группы с различной степенью тяжести заболевания проводилось только по клиническим показателям (наличию или отсутствию стено-
кардии), а не с помощью ангиографии. Нами было впервые показано, что прогрессирование коронарного атеросклероза, документированное ангиографически, связано с изменением соотношения Трег/Тх17 в пользу «провоспалительного» компонента [17, 18].
Данные о субпопуляционном составе лимфоцитов крови у пациентов с атеросклерозом брахиоцефальных артерий нельзя назвать однозначными. Так, рядом авторов выявлено увеличение содержания Тх17 и продуцируемых цитокинов в крови у пациентов с выраженным АС и нестабильными АСБ в сонных артериях, а также увеличение содержания Тх17 и уменьшение количества Трег в крови у пациентов, перенесших острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) [19, 20]. С другой стороны, данные Ammirati с соавт. (2010) свидетельствуют об отсутствии изменений в содержании Трег у пациентов с прогрессирующим увеличением толщины комплекса интима-медиа (ТИМ) сонных артерий [16]. В настоящем исследовании мы проанализировали содержание Тх1, Тх17 и Трег, а также ассоциированных цитокинов и маркеров воспаления (ИЛ-17, ИЛ-10, С-реактивный белок (СРБ), sCD25) в крови у пациентов с атеросклеротическими поражениями брахиоцефальных артерий.
Материал и методы
1. Пациенты. В исследование включены 66 пациентов, наблюдающихся в ФГБУ РКНПК МЗ РФ, Институте клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова. В исследование не включались пациенты, перенесшие ОКС или ОНМК, операцию коронарного шунтирования или транслюминальной баллонной ангиопластики со стентированием в течение 6 мес до проведения исследования, а также пациенты с сахарным диабетом, злокачественными новообразованиями, хронической почечной или печеночной недостаточностью, острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и пациенты, принимавшие иммуно-тропные препараты. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1.
2. Ультразвуковое дуплексное сканирование (УЗДс) экстракраниального сегмента брахиоцефальных артерий. Исследование экстракраниального отдела брахиоце-фальных артерий проводилось с помощью линейного датчика с частотой 17,5 МГц (PHILIPS iU22 ultrasound system, Philips Inc., Eindhoven, Netherlands). Все измерения проводились в зонах общей сонной артерии (ОСА), ее бифуркации и внутренней сонной артерии (ВСА) с обеих сторон, и вклю-
Рис. 1. Примеры УЗДС.
а - утолщение ТИМ, плоская атеросклеротическая бляшка, суживающая просвет артерии менее чем на 30% (группа I); б - гетерогенная атеросклеро-тическая бляшка, суживающая просвет артерии на 40% (группа II); в - гомогенная гипоэхогенная атеросклеротическая бляшка, суживающая просвет артерии более чем на 50%, кровоизлияние в бляшку (группа III); г - нестабильная атеросклеротическая бляшка (гетерогенная, с преобладанием каль-циноза, изъязвленной поверхностью, суживающая просвет сосуда более чем на 50%).
чали в себя оценку в продольных (передней косой, боковой, задней косой) и поперечной проекциях. Определение ТИМ и АСБ проводились согласно протоколу Consensus Statement from the American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force (2008) [21]. ТИМ > 0,9 мм расценивалась как утолщение комплекса интима-медиа. Критериями АСБ служили выявление структуры, выдающейся в просвет артерии более чем на 0,5 мм или на 50% от ТИМ соседних участков артериальной стенки, увеличение ТИМ на 1,5 мм и более или сужение просвета артерии на 20% и более. "Нестабильные" АСБ включали гомогенные гипоэхогенные бляшки, гетерогенные АСБ с преобладанием гипоэхогенного компонента, прилежащего к просвету артерии, гетерогенные образования с преобладанием кальциноза, гемодинамически значимые бляшки и бляшки, имеющие изъязвленную поверхность. В зависимости от максимальной степени стеноза ОСА и ВСА были сформированы 3 группы: группа I - пациенты с увеличением ТИМ, локальными АСБ или диффузными АСБ и стенозом менее 30% (n = 15) (рис. 1, а); группа II - пациенты с пролонгированным (диффузным) поражением каротид-ного бассейна и максимальной степенью стеноза менее 50%
(n = 29) (рис. 1, б); группа III - пациенты с диффузным поражением бассейна и максимальной степенью стеноза 50% и более (n = 22) (рис. 1, в). У 22 пациентов - 4-х из группы II и 18-ти из группы III, - выявлены нестабильные АСБ (рис. 1, г); 44 пациента имели стабильные поражения.
3. Получение и активация мононуклеарных клеток крови. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (р = 1,077, Sigma). Клетки, 5 млн/мл, ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки крови человека (Life Technologies), и для активации культивировали в течение 5 ч при 370С и 5% CO2 в присутствии 25 нг/мл форболмири-статацетата, 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (Sigma).
4. Иимунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов). Для выявления поверхностных антигенов использовали флюоресцентно меченные моноклональные антитела CD4-FITC, CD25-PE, CD127-PC5, CD45-APC (Becton Dickinson, Beckman Coulter, eBioscience). Для лизиса эритроцитов и фиксации клеток использовали растворы Facs Lysing Solution и CellFLX (Becton
Рис. 2. Содержание СЭ4+С025Ь'«ЬС0127|0" Трег (% от СЭ4+ лимфоцитов) (а), отношение содержания Тх1 к СЭ4+С025Ь'«ЬС0127|0" Трег (б), отношение содержания С04+С025|о"С0127ЫвЬ Такт к С04+С025ЫвЬС0127|0" Трег (в), отношение содержания С04+С025ЫвЬС0127|0" Трег к Тх17 (г) и содержание sCD25 (е) в крови у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий (группы 1-Ш); отношение содержания С04+С025Ь]вЬС0127|0" Трег к Тх17 (д) у пациентов со стабильными и нестабильными АСБ. Данные представлены как медиана и интеквартиль-ный размах; * р < 0,05.
Dickinson). Для идентификации маркерного внутриклеточного белка Foxp3 Трег и цитокинов в активированных лимфоцитах использовали наборы для фиксации и пермеабилиза-ции клеток и флюоресцентно меченные антитела (CD4-PC5, Foxp3-Alexa488, IL17a-PE и INF@-FITC) производства eBioscience. Все стадии подготовки проб проводили в соответствии с протоколами производителей. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлюорометрии в потоке на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) с лазерами 488 и 635 нм. Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Активированные CD4+ лимфоциты (Такт) выделяли по низкой (CD25) и высокой - [CD127(CD4+CD25lowCD127Msh)] интенсивности окрашивания антителами; Трег типировали как CD4+CD25highCD127low клетки (при окрашивании в крови) и
CD4+FoxP3+ (при окрашивании мононуклеарных клеток); Тх1 и Тх17 как CD4+INF+ и CD4+IL17a + лимфоциты соответственно.
5. Определение содержания ИЛ-17, ИЛ-10, СРБ, sCD25 в крови больных. Исследование концентрации sCD25 и ИЛ-10 в сыворотке крови проводили хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC-Siemens). Концентрацию ИЛ-17 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом с использованием набора Bender MedSystems. Концентрацию СРБ определяли высокочувствительным методом на нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия-США).
6. Статистический анализ данных. Нормальный характер распределений доказывали с помощью критерия Шапиро-Уилка, данные представлены как среднее +/- стандартное отклонение. При несоответствии распределения
Таблица 1
Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование
Показатель 1-я группа (n = 15) 2-я группа (n = 29) 3-я группа (n = 22) Стабильные (n = 44) Нестабильные (n = 22)
Мужчины 12 (80%) 22 (76%) 20 (91%) 35 (80%) 19 (86%)
Возраст, лет 55(50-73) 65 (59-74) 65 (59-70) 64 (55-73) 65 (59-69)
Индекс массы тела, кг/м2 27(25-31) 28 (26-29) 29(27-31) 28 (26-30) 29(26-31)
Курение 1 (7%) 9 (31%) 8 (36%)# 9 (20%) 9 (41%)
Артериальная гипертензия (%) 11 (73%) 26 (90%) 20 (91%) 38 (86%) 19 (86%)
Общий холестерин, ммоль/л 4,55 (4,38-5,14) 4,44 (3,86-5,04) 4,26 (3,68-4,80) 4,48 (3,95-4,88) 4,40 (3,50-5,40)
Липопротеиды низкой плотности, ммоль/л 2,06 (1,67-3,95) 1,70 (1,14-1,99) 1,59 (1,32-1,94) 1,69 (1,44-2,06) 1,72 (1,33-2,08)
Липопротеиды высокой плотности, ммоль/л 0,99 (0,78-1,50) 1,27 (1,14-1,45) 1,36 (1,00-1,56) 1,27 (1,01-1,47) 1,34 (1,19-1,42)
Триглицериды, ммоль/л 1,62 (1,15-2,20) 1,52 (1,00-1,82) 1,37 (1,04-1,69) 1,52 (1,02-1,90) 1,39 (1,01-1,81)
Глюкоза, ммоль/л 5,57 (5,30-5,86) 5,48 (5,03-6,15) 5,10 (4,73-5,48)* 5,56 (5,25-6,04) 5,00 (4,70-5,36)
Примечание. *p < 0,05, #p = 0,05 по сравнению с группой I.
Таблица 2
Содержание клеточных субпопуляций в крови больных
Показатель 1-я группа (n = 15) 2-я группа (n = 29) 3-я группа (n = 22) Стабильные (n = 44) Нестабильные (n = 22)
Лейкоциты, млн/мл 7,2 (6,2-7,4) 7,5 (6,4-8,5) 6,9 (6,3-7,9) 7,2 (6,4-8,4) 7,2 (6,4-8,1)
Лимфоциты, % 34,9 (27,6-39,6) 30,3 (24,2-35,4) 34,3 (29,3-38,5) 31,2 (26,2-38,9) 32,6 (28,5-35,9)
CD4+ (% от лимфоцитов) 42,0 (37,0-49,0) 40,0 (35,0-45,5) 39,5 (29,5-48,0) 42,0 (35,0-45,0) 41,5 (34,0-48,5)
CD4+CD25hiвh CD127low Трег (здесь и ниже % от CD4+) 5,1 (4,5-6,4) 4,2 (3,6-6,0) 4,0 (3,6-4,6)* 4,2 (3,7-6,0) 4,0 (3,6-5,1)
CD4+CD25low 127ыв1 Такт 36,1 (24,5-50) 41,2 (32,2-54,7) 37,6 (32,4-43,8) 36,7 (28,3-50,0) 38,2 (32,4-44,0)
CD4+Foxp3+ Трег 7,0 (6,0-8,3) 7,2 (6,2-9,8) 7,8 (6,0-9,0) 7,1 (6,0-9,4) 8,0 (6,7-9,8)
CD4+IL17a+ Тх17 0,9 (0,7-1,2) 1,2 (0,8-1,7) 1,3 (0,8-2,0) 1,2 (0,8-1,5) 1,3 (0,8-1,9)
CD4+IFNy+ Тх1 21,4 (12,8-25,0) 23,3 (15,5-30,2) 19,1 (17,6-27,8) 24,2 (16,0-30,4) 17,7 (15,0-23,3)
Примечание. *p < 0,05 по сравнению с группой I.
данных нормальному закону для их описания использовали медиану и квартили (25-й - 75-й процентиль). Для межгрупповых сравнений, в случаях нормально распределенных данных, использовали Т-критерий Стьюдента; в случаях несоответствия нормальному закону - U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков использовали тест %2. Корреляционный анализ проводили методом Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. В работе применяли пакет статистических программ Statistica 7.0.
Результаты.
Группы пациентов с различной степенью выраженности АС сонных артерий, стабильными и нестабильными изменениями стенки были сопоставимы по основным клиническим характеристикам и лабораторным показателям (табл. 1). Следует отметить, что относительное число курильщиков было наименьшим в группе I и наибольшим - среди пациентов с нестабильными АСБ.
Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов крови показал, что у пациентов с выраженным стенозом сонных артерий (III группа) по сравнению с пациентами с малоиз-мененными артериями (I группа) количество циркулирующих Трег (CD4+CD25highCD127low) снижено (табл. 2, рис. 2, а), а соотношение Тх1/Трег (Cd4+CD25lüghCD127low) увеличено (рис. 2, б). У пациентов с малоизмененными сосудами (I) по сравнению с пациентами со средней и высокой степенью стеноза (группы II и III) индекс Такт(CD4+CD25lowCD127ыgh)/ Трег(CD4+CD25ЫghCD127low) оказался ниже (рис. 2, в), а соотношение Трег (CD4+CD25highCD127low)/Тх17 - выше (рис. 2, г). Пациенты с нестабильными АСБ имели более низкие значения соотношения Трег (CD4+CD25highCD127low)/Тх17 по сравнению с пациентами со стабильными АСБ (рис. 2, д).
Содержание sCD25 (Ед/мл) в крови оказалось выше у пациентов II и III групп по сравнению с группой I (табл. 3, рис. 2, е). Корреляционный анализ показал наличие прямой связи между уровнем sCD25 и содержанием Тх17 (r = 0,322; p < 0,05) и обратной связи между уровнем sCD25 и количеством Трег (CD4+CD25highCD127low) (r = -0,32; p < 0,05), соотноше-
ниями Трег(CD4+CD25highCD127low)/Тх17 (r = -0,34; p < 0,05) и Трег (CD4+FoxP3+)/Тх17 (r = -0,30; p < 0,05). Значимые межгрупповые различия в содержании ИЛ-10 и СРБ в крови не были выявлены. Обращает на себя внимание тенденция к более высокому содержанию ИЛ-17 в крови у пациентов III группы по сравнению с I группой (табл. 3).
В зависимости от содержания Трег(CD4+CD25ЫghCD127low) и Тх17 в крови пациенты были разделены на 4 группы: в 1-й из них критериями были высокое содержание Трег (более 4,30% от CD4+клеток) и низкое содержание Тх17 (менее 1,23% от CD4+), во 2-й - высокое содержание Трег и высокое содержание Тх17 (более 1,23z% от CD4+), в 3-й - низкое содержание Трег (менее 4,30% от CD4+) и низкое содержание Тх17, в 4-й - низкое содержание Трег и высокое содержание Тх17. В каждой группе определена доля пациентов с различной степенью поражения сонных артерий (стеноз менее 30%, стеноз 30-50%, стеноз более 50%) (рис. 3). Как выяснилось, в группе I превалировали больные с наименьшими признаками заболевания, тогда как в группе 4 таких пациентов не оказалось.
Учитывая важную роль курения как фактора, способствующего атерогенезу, мы провели дополнительный анализ иммунологических показателей в группах курящих и некурящих пациентов. Оказалось, что по сравнению с некурящими у курящих больных относительное содержание активированных (CD4+CD25lowCD127high) Т-хелперных клеток выше (18,6 (14,0-22,0) против 14,3 (11,0-19,0), % от CD4+, p < 0,05). По остальным показателям различий не было. При исключении из анализа курящих пациентов выявленные взаимосвязи между иммунологическими показателями и тяжестью АС сонных артерий сохранялись (данные не приведены).
Обсуждение.
В отличие от результатов экспериментальных работ, выполненных на моделях атерогенеза у животных, клинические данные о роли адаптивного иммунитета в регуляции воспалительных процессов при АС немногочисленны и противоречивы. Многие из них получены при ОКС, в основе которого лежит «дестабилизация» АСБ, ее разрыв и тромбоз. В этих
Таблица 3
Содержание "растворимых" маркеров воспаления в крови больных
Показатель 1-я группа (n = 15) 2-я группа (n = 29) 3-я группа (n = 22) Стабильные (n = 44) Нестабильные (n = 22)
С-РБ (мг/л) 1,58 (0,66-2,2) 1,30 (0,73-9,23) 1,21 (0,70-4,71) 1,18 (0,73-2,52) 1,38 (0,58-5,46)
ИЛ-17 (пг/мл) 0,84 (0,13-1,25) 1,00 (0,60-3,06) 1,44 (1,00-5,50)# 1,00 (0,60-2,58) 1,00 (1,00-5,00)
ИЛ-10 (пг/мл) 1,98 (1,54-2,75) 2,42 (1,82-3,04) 2,14 (1,71-2,92) 2,09 (1,65-2,89) 2,46 (1,88-3,00)
sCD25 (Ед/мл) 487 (399-568) 849 (564-1081)* 768 (551-1047)* 642 (485-894) 719 (543-1162)
Примечание. *p < 0,05, #p = 0,05 по сравнению с группой I.
Стеноз Ц Менее 30% 1 30-50% Ш Более 50%
2
Трег t Тх17 î
3
Трег I Тх17 I
4
Трег 4 Тх17 t
Рис. 3. Распределение пациентов по тяжести атеросклеротиче-ского поражения сонных артерий в зависимости от содержания
CD4+CD25highCD127low Трег и Тх17.
работах продемонстрировано изменение соотношения Тх1, Тх17 и Трег в пользу «провоспалительных» субпопуляций. Такие иммунологические изменения могут быть следствием как повреждения миокарда [22], так и острого эмоционального стресса [23], сопровождающего ОКС. Необходимо подчеркнуть особую значимость работы Wigren с соавт. (2012), которые показали, что низкий уровень Трег у пациентов без анамнеза сердечно-сосудистых заболеваний является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении долгосрочного риска развития инфаркта миокарда [15].
Исследования параметров клеточного иммунитета при стабильном течении коронарного АС имеют ряд ограничений. Так, ангиографические методы оценки коронарного кровотока не позволяют выявить начальные атеросклероти-ческие изменения, при которых просвет сосуда может оставаться практически неизмененным. УЗДС крупных сосудов является доступным, неинвазивным и недорогим методом обследования пациентов с АС. Преимущества УЗДС перед ангиографией, помимо неинвазивности и отсутствия лучевой нагрузки, состоят в возможности выявления начальных и эксцентрических атеросклеротических поражений, не изменяющих просвет сосуда, и оценки структуры АСБ (плотность, гомогенность, васкуляризация, наличие кальцина-тов). К сожалению, оценка коронарного русла с помощью трансторакального ультразвукового исследования крайне затруднена. В то же время, УЗДС брахиоцефальных артерий позволяет получить точную информацию о состоянии артериальной стенки.
Комплексная оценка показателей клеточного иммунитета позволила нам выявить изменение иммунного баланса в пользу провоспалительного процесса у пациентов с более выраженными поражениями и с признаками «нестабильности» АСБ.
При ранних изменениях стенки сонных артерий (увеличении ТИМ при отсутствии АСБ) сдвиги в содержании Трег в крови отсутствуют [16]. По-видимому, участие лимфоци-тарного компонента в регуляции воспалительной реакции при атерогенезе проявляется на более поздних стадиях АС. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные Lui с соавт. (2012), указывающие на снижение содержания Трег и более высокое содержание Тх17 и ассоциированных цитокинов у пациентов с выраженными атеросклеротическими изменениями и нестабильными АСБ в сонных артериях по сравнению с пациентами без АСБ в сонных артериях [19], а также наши результаты.
У пациентов с нестабильными АСБ, включенных в наше исследование, различия в субпопуляционном составе оказались менее выраженными. По-видимому, вследствие гете-
рогенности критериев «нестабильности» практически все пациенты с выраженным атеросклеротическим поражением сонных артерий (стеноз более 50%) попали в группу с нестабильными АСБ. Можно предположить, что межгрупповые различия у пациентов со стабильными и нестабильными АСБ были обусловлены именно различной долей пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением сонных артерий.
Нами также был выявлен более высокий уровень sCD25 в крови у пациентов с выраженным диффузным поражением брахиоцефальных артерий (группы II и III) по сравнению с пациентами без значимого поражения артерий (группа I). sCD25 - растворимая («отщепленная» с поверхности клетки) форма рецептора ИЛ-2, основным, источником которой являются активированные лимфоциты [24]. Уровень sCD25 значительно повышается при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях [25], а также при онкологических заболеваниях, когда его источником может быть Трег [26, 27].
Подтверждено повышение уровня sCD25 у пациентов с ОКС и стабильной стенокардией [28, 29]. Ранее нами было показано увеличение содержания Трег и пропорциональное увеличение концентрации sCD25 в сыворотке у пациентов с АС коронарных артерий через 1 месяц после имплантации стентов с рапамициновым покрытием. Являясь цитостати-ческими агентами, рапамицин и его аналоги подавляют иммунный ответ, опосредованный в том числе эффекторными лимфоцитами, и обладают уникальным действием, обеспечивающим выживание Трег. Вероятно, выявленное в данной работе увеличение содержания sCD25, пропорциональное увеличению уровня Трег, было обусловлено действием рапа-мицина [17].
В связи с тем, что содержание sCD25 в крови оказалось прямо пропорционально количеству Тх17 и обратно пропорционально содержанию Трег, мы считаем, что данный показатель может отражать процесс активации лимфоцитов при атеросклерозе.
Обнаруженные изменения в соотношении регуляторных и эффекторных субпопуляций лимфоцитов, способных контролировать воспалительный процесс в АСБ, могут явиться дополнительным независимым фактором риска прогрессии заболевания и развития его осложнений. Результаты исследований в данной области позволят разработать инновационный подход к выявлению больных с высоким риском прогрессии атеросклероза.
ЛИТЕРАТУРА
18. Пылаева Е. А., Потехина А. В., Проваторов С. И., Раскина К. В., Рулева Н. Ю., Масенко В. П. и др. Эффекторные и регу-ляторные субпопуляции лимфоцитов крови при стабильном течении ИБС. Терапевтический архив. 2014; 9: 24-30. 28. Мазуров В. И., Стволов С. В., Линецкая Н. Э., Балдуева И. А. Содержание провоспалительных цитокинов интерлейкина-2, интерлейкина-8 и растворимого рецептора интерлейкина-2 в крови у больных ишемической болезнью сердца различных вариантов. Терапевтический архив. 2001; 12: 14-7.
Поступила 28.05.14
REFERENCES
1. Stary H. C., Chandler A. B., Glagov S., Guyton J. R., Insull W. Jr., Rosenfeld M. E. et al. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council onArteriosclerosis. American Heart Association. Circulation. 1994; 89: 2462-78.
2. Stary H. C., Chandler A. B., Dinsmore R. E., Fustet V., Glagov S., Insull W. Jr. et al.A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis. American Heart Association. Circulation. 1995; 92: 1355-74.
3. Jonasson L., Holm J., Skalli O., Bondjers G., Hansson G. K.
Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis. 1986; 6: 131-8.
4. Bobryshev Y. V., Lord R. S., Rainer S., Jamal O. S., Munro V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol. Res. Pract. 1996; 192(5): 462-7.
5. van Puijvelde G. H., Hauer A. D., de Vos P., van den Heuvel R., van Herwijnen M. J., van der Zee R. et al. Induction of oral tolerance to oxidized low-density lipoprotein ameliorates atherosclerosis. Circulation. 2006; 114: l968-76.
6. Wigren M., Kolbus D., Duner P., Ljungcrantz I., Soderberg I., Bjorkbacka H. et al. Evidence for a role of regulatory T cells in mediating the atheroprotective effect of apolipoprotein B peptide vaccine. J. Intern. Med. 2011; 269: 546-56.
7. Whitman S. C., Ravisankar P., Elam H., Daugherty A. Exogenous interferon-gamma enhances atherosclerosis in apolipoprotein E-/- mice. Am. J. Pathol. 2000; 157(6): 1819-24.
8. Laurat E., Poirier B., Tupin E., Caligiuri G., Hansson G. K., Bari@ ety J. et al. In vivo downregulation of T helper cell 1 immune responses reduces atherogenesis in apolipoprotein E-knockout mice. Circulation. 2001; 104(2): 197-202.
9. Gao Q., Jiang Y., Ma T., Zhu F., Gao F., Zhang P. et al. A critical function of Th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice. J. Immunol. 2010; 185(10): 5820-7.
10. Mor A., Planer D., Luboshits G., Afek A., Metzger S., Chajek-Shaul T. et al. Role of naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells in experimental atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27(4): 893-900.
11. Pinderski L. J., Fischbein M. P., Subbanagounder G., Fishbein M. C., Kubo N., Cheroutre H. et al. Overexpression of interleukin-10 by activated T lymphocytes inhibits atherosclerosis in LDL receptor-deficient Mice by altering lymphocyte and macrophage phenotypes. Circ. Res. 2002; 90(10): 1064-71.
12. Zhong Y., Wang X., Ji Q., Mao X., Tang H., Yi G. et al. CD4+LAP+ and CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induced by nasal oxidized low-density lipoprotein suppress effector T cells response and attenuate atherosclerosis in ApoE-/-mice. J. Clin. Immunol. 2012; 32(5): 1104-17.
13. Cheng X., Yu X., Ding Y. J., Fu Q. Q., Xie J. J., Tang T. T. et al. The Thl7/Treg imbalance in patients with acute coronary syndrome. Clin. Immunol. 2008; 127(1): 89-97.
14. Han S. F., Liu P., Zhang W., Bu L., Shen M., Li H. et al. The opposite-direction modulation of CD4+CD25+Tregs and T helper 1 cells in acute coronary syndromes. Clin. Immunol. 2007; 124(1): 90-7.
15. Wigren M., Björkbacka H., Andersson L., Ljungcrantz I., Fredrikson G. N., Persson M. et al. Low levels of circulating CD4+FoxP3+ T cells are associated with an increased risk for development of myocardial infarction but not for stroke. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2012; 32(8): 2000-4.
16. Ammirati E., Cianflone D., Banfi M., Vecchio V., Palini A., De Metrio M. et al. Circulating CD4+CD25hiCD127lo regulatory T-Cell levels do not reflect the extent or severity of carotid and coronary atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30(9): 1832-41.
17. Potekhina A. V., Provatorov S. I., Sokolov V. O., Pylaeva E. A., Masenko V. P., Noeva E. A. et al. CD4(+)CD25(high) CD127(1ow) regulatory T cells in patients with stable angina and their dynamics after intracoronary sirolimus-eluting stent implantation. Hum. Immunol. 2011; 72(7): 553-7.
18. Pylaeva E. A., Potekhina A. V., Provatorov S. I., Raskina K. V., Ruleva N. Y., Masenko V. P. et al. Effector and regulatory blood lymphocyte subpopulations in stable coronary artery disease. Terapevticheskiy arkhiv. 2014; 9: 24-30. (in Russian)
19. Liu Z. D., Wang L., Lu F. H., Pan H., Zhao Y. X., Wang S. J. et al. Increased Th17 cell frequency concomitant with decreased Foxp3+ Treg cell frequency in the peripheral circulation of patients with carotid artery plaques. Inflamm. Res. 2012; 61(10): 1155-65.
20. Li Q., Wang Y., Yu F., Wang Y. M., Zhang C., Hu C. et al. Peripheral Thl7/Treg imbalance in patients with atherosclerotic cerebral infarction. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013; 6(6): 1015-27.
21. Stein J. H., Korcarz C. E., Hurst R. T., Lonn E., Kendall C. B., Mohler E. R. et al. American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. Use of carotid ultrasound to identify subclinical vascular disease and evaluate cardiovascular disease risk: a consensus statement from the American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. Endorsed by the Society for Vascular Medicine. J. Am. Soc. Ecgocardiogr. 2008; 21(2): 93-111.
22. Yu M., Hu J., Zhu M. X., Zhao T., Liang W., Wen S. et al. Cardiac fibroblasts recruit Th17 cells infiltration into myocardium by secreting CCL20 in CVB3-induced acute viral myocarditis. Cell. Physiol. Biochem. 2013; 32(5): 1437-50.
23. Wang H. Y., Gao W. T., He Q. H., Yang C., Gu W., Yan J. et al. Endogenous glucocorticoid increases the basal level of Treg-Th17 balance under early phase of stress. Clin. J. Traumatol. 2012; 15(6): 323-8.
24. Brusko T. M,, Wasserfall C. H., Hulme M. A., Cabrera R., Schatz D., Atkinson M. A. Influence of membrane CD25 stability on T lymphocyte activity: implications for immunoregulation. PLoS One. 2009; 4(11): e7980.
25. Hoeger P. H., Niggemann B., Ganschow R., Dammann C., Haeuser G. Serum levels of sCD23 and sCD25 in children with asthma and in healthy controls. Allergy. 1994; 49(4): 217-21.
26. Li L. F., Wang H. Q., Liu X. M., Ren X. B. Epirubicin inhibits soluble CD25 secretion by Treg cells isolated from diffuse large B-cell lymphoma patients. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2013; 14(3): 1721-4.
27. Pedersen A. E., Lauritsen J. P. CD25 shedding by human natural occurring CD4+CD25+ regulatory T cells does not inhibit the action of IL-2. Scand. J. Immunol. 2009; 70: 40-3.
28. Mazurov V. I., Stvolov S. V., Linetskaia N. E., Baldueva I.A. Levels of anti-inflammatory cytokines inter1eukin-2, interleukin-8, and soluble interleukin-2 receptor in blood of patients with various forms of ischemic heart disease. Terapevticheskiy arkhiv. 2001; 73(12): 14-7. (in Russian)
29. Simon A. D., Yazdani S., Wang W., Schwartz A., Rabbani L. E. Elevated plasma levels of inter1eukin-2 and soluble IL-2 receptor in ischemic heart disease. Clin. Cardiol. 2001; 24: 253-6.
Received 28.05.14
