CC BY
43
Экспериментальные исследования
УДК: 616.36-008.64:615.6-02-085
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Ф.А.ХАДЖИБАЕВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, А.А.МАДАМИНОВ, Р.К.АХМЕДОВА, М.И.АБДУКАДЫРОВА
Efficiency of human fetal hepatocytes transplantation in treatment acute liver failure in experiment
F.A.KHADJIBAEV, M.D.URAZMETOVA, A.A.MADAMINOV, R.K.AHMEDOVA, M.I.ABDUKADIROVA
Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи
На экспериментальной модели СЦ проявлялся лечебный эффект ксеногенных фетальных гепатоцитов 18-22 -недельных плодов человека, о чем свидетельствовали данные выживаемости и улучшение биохимических показателей крыс с моделью острой печеночной недостаточности и внутриселезеночной трансплантацией. У животных с острой печеночной недостаточностью токсического генеза использование ксеногенных гепатоцитов раннего уровня онтогенетического развития сопровождалось положительной динамикой биохимических показателей, способствовало уменьшению проявлений гепатоцеребральной недостаточности, предупреждало развитие печеночной комы и позволяло на 40,0% снизить летальность. Фетальные гепато-циты плодов человека являются уникальным материалом, которые легко приживаются в чужом организме и позволяют исключить при их трансплантации использование дорогостоящих иммуносупрессоров, обладающими побочными эффектами.
Ключевые слова: фетальные клетки, трансплантация гепатоцитов, плод человека, острая печеночная недостаточность, крысы, четыреххлористый углерод.
On experimental model CCl4 the medical effect xenogenic of the human fetal hepatocytes (HFH) of 18-22 week to what data of survival rate and improvement of biochemical indicators of rats with model acute liver failure (ALF) and intrasplenic transplantation testified was shown. At animals with ALF of a toxic genesis use of xenogenic hepatocytes of early level of ontogenetic development is accompanied by positive dynamics of biochemical indicators, promotes reduction of implications hepatocerebral to insufficiency, warns development of a hepatic coma and allows to lower a lethality on 40,0 %. HFH are a unique material which easily gets accustomed in another's organism and allow to exclude at their transplantation use expensive immunosepressors, by-effects rendering.
Key words: fetal xenograft, hepatocyte transplantation, human embryo, acute hepatic failure, rat, carbon tetrachloride.
В настоящее время трансплантация фетальных гепатоцитов, эмбриональных стволовых клеток предложена в качестве альтернативы ортотопической пересадки печени при острой печеночной недостаточности (ОПН), при которой летальность достигает 80-92% [2, 6, 9-11]. Трансплантация не только обеспечивает временное восстановление функции в период ожидания операции, но и является терапией ряда метаболических расстройств и ОПН. Так, в эксперименте на мышах было показано, что трансплантированные предшественники эпителиальных клеток фетальной печени пролиферируют и дифференцируются как в гепато-циты, так и в эпителиальные клетки желчных протоков с высокой способностью к репопуляции, способствуя восстановлению функции печени и снижению выраженности фиброза [16]. Однако этот метод не оказывает стойкого терапевтического эффекта, в связи с чем применяется редко, хотя в ряде случаев позволяет улучшить функцию печени и, таким образом, увеличить продолжительность и качество жизни пациентов [14]. И хотя эмбриональные стволовые клетки в настоящее время представляют наилучшую in vitro модель для дифференциации гепатоцитов, этические ограничения и возможная малигнизация ограничивают их использование в клинической практике [15].
Существующая методика пересадки печени явля-
ется достаточно эффективной, но чрезвычайно сложной в техническом плане и требует немалых средств. Кроме того, остается открытой проблема донора печеночной ткани. Это диктуют необходимость поиска новых методов лечения, наиболее перспективным из которых является использование фетального клеточного материала, имеющего большой потенциал роста и пролиферации, выраженную активность и способность к дифференцировке из-за способности продуцировать большой набор различных факторов роста и регенерации, т.е. цитокинов и их антагонистов.
Цель - экспериментальное изучение эффективности фетальных гепатоцитов человека (ФГЧ) при лечении ОПН у крыс.
Материал и методы
В качестве донорского материала использовали печень из 3-х плодов человека. ФГЧ (18—22 нед. внутриутробного развития) получали в результате абортов, сделанных в поздние сроки по медицинским показаниям в отделении патологии беременности 1-й, 6-й и 9-й городских больниц г. Ташкента. Для получения гепатоцитов из печени плода использовали методику выделения клеток, состоящую из 4 этапов: нерецирку-ляторная перфузия печени ЭДТА-содержащим раствором, рециркуляторная перфузия печени раствором,
содержащим 0,025% коллагеназы, диспергирование печени, отмывка гепатоцитов центрифугирование. При микроскопировании клеточного состава полученных ФГЧ определялись гепатоциты и их предшественники - гепатобласты до 60%, гемопоэтические клетки (в том числе макрофаги) - до 30% и непаренхиматозные клетки - до 10%. Выход клеток из 1 г ткани печени составил 12,6+0,28 (х108), жизнеспособность в первые 4 часа после получения - 91,7±1,1%. Жизнеспособность клеток оценивали добавлением 300 мкл раствора трипанового синего к 100 мкл суспензии клеток (конечная концентрация трипанового синего 0,45%).
Модель ОПН воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения неразведенного гепато-тропного токсина СЦ в дозе 1 мл/кг половозрелым беспородным крысам-самцам. Животные были разделены на две группы по 15 в каждой. Всего в эксперименте использовали 105 половозрелых беспородных крыс самцов массой 150 - 200 г. 1 - ю(контрольную) группу составили крысы с моделью ОПН. 2 -ю (сравнения) группу составили животные, которых лечили с помощью ФГЧ без дополнительного введения иммуносупрессоров. Для этого им внутриселезеночно трансплантировали свежевыделенные ФГЧ на вторые сутки после индуцирования ОПН в дозе 15-20 млн клеток в объеме 0,15-0,20 мл в питательном растворе RPMI 1640 лапаротомическим доступом в нижний и средний полюс паренхимы селезёнки в 2-3 точки путем медленной и осторожной инъекции 1-мл туберкулиновым шприцем в течение 10-15 минут (рис. 1). В момент введения селезенку слегка смачивали физиологическим раствором, предохраняя ее от высыхания. После окончания процедуры введения клеток кровотечения и разрыва капсулы селезенки не наблюдалось. Такой способ введения ФГЧ выбран нами потому, что вена селезенки имеет общий кровоток с печенью, что позволяет вводимым в течение 20 минут ФГЧ сразу попадать в ткань печени. Кроме того, по данным разных авторов, селезенка ввиду общности филогенетического развития с печенью имеет способность удерживать часть фетальных клеток в своей паренхиме, образовывая, таким образом, очаги (пулы) размножения из ФГЧ.
Эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используе-
Рис. 1. Внутриселезеночная трансплантация крысам с ОПН ФГЧ.
мых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986) и с одобрения Национального этического комитета РУз (протокол №4 от 13.04.2011). За экспериментальными животными наблюдали в течение 14 суток. Биохимические параметры крови изучали после забоя животных в 0-, 7-и, 14-е сутки наблюдения. Забой осуществляли под эфирным наркозом.
Для сравнительного анализа динамики изменения показателей в ходе эксперимента использовали непараметрическую статистическую обработку результатов. Для оценки достоверности различий до и после воздействия применялся критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий между двумя несопряжёнными совокупностями использовался критерий Манна-Уитни. Для расчетов использовался статистический пакет программ Statistica. Значения p<0,05 рассматривались как достоверные. Для описания выживаемости крыс в группах использовали метод Кап-лан-Мейера, позволяющий анализировать выживаемость в двух и более группах животных. Для сравнения групп использовали лог-ранговый критерий.
Результаты исследования
После введения четыреххлористого углерода наблюдалось токсическое поражение печени с картиной ОПН. При ОПН в крови крыс происходили достоверные нарушения всех биохимических параметров, напрямую связанных с поражением ткани печени. Трансплантация ФГЧ животным с ОПН оказывала положительное влияние на все биохимические параметры крови животных (табл.).
Лабораторным признаком печеночно-клеточной недостаточности является нарастание концентрации билирубина. В эксперименте у животных с моделью ОПН на 7-е сутки обнаружено достоверно увеличение содержания общего билирубина в 4,0 раза с пиком на 14-е сутки до 31,33±11,86 мкмоль/л (по сравнению с данными здоровых - 6,83±2,09). Через 5 и 12 суток после трансплантации ФГЧ отмечалось снижение повышенного уровня общего билирубина в среднем на 31,5%, с достоверным снижением по отношению к данным крыс в соответствующие сроки исследования без трансплантации только на 7-е сутки (p<0,05).
Одним из основных показателей активности патологического процесса в печени является цитолиз. У животных с моделью ОПН активность индикаторных ферментов на 7-е и 14-е сутки достоверно возрастала. Так, активность АЛТ повышалась в 2,0 и 2,2 раза, АСТ
— в 1,6 и 2,0 раза. Статистически достоверное снижение активности ферментов отмечено через 5—12 суток после трансплантации ФГЧ: АЛТ —на 62 - 69%, АСТ
— на 58 - 62%.
Основным признаком ОПН является печеночная энцефалопатия, оказывающая решающая влияние на течение ОПН и прогноз заболевания. Этот симптом развивается вследствие проникновения эндогенных нейротоксинов через гематоэнцефалический барьер и их воздействия на астроглию как результат недостаточности клеток печени. Основную роль в этом механизме играет аммиак, занимающий ведущее место среди эндогенных нейротоксинов. В наших исследованиях концентрация аммиака в крови при ОПН повышалась во все сроки наблюдения в 1,8 - 2,4 раза. Пересадка ФГЧ способствовала достоверному снижению
Таблица. Биохимические показатели крови крыс после индукции ОПН и лечением путем внутриселезеночной трансплантации ФГЧ (±SD)
Показатель
Здоровые
Модель ОПН (числитель) и лечение (знаменатель) 2-е сут.
7-е сут. 14-е сут.
27,64±10,49* 31,33±11,86*
8,85±2,34** 9,58±4,62
27,64±10,49* 31,33±11,86*
40,62±8,82** 37,58±6,37
60,27±6,69* 66,50±10,82*
37,54±8,26** 45,58±10,16
217,91±34,34* 270,83±66,82*
126,69±32,70** 167,50±43,00
7,65±1,49* 11,67±2,82*
4,23±0,72** 5,49±1,58**
232,64±82,41* 178,00±68,33
135,08±43,56** 123,75±23,33
Билирубин общий, мкмоль/л
Альбумин, г/л АЛТ, мккат/л АСТ, мккат/л Мочевина, мкмоль/л Аммиак, мкмоль/л
6,83±2,09 45,60±7,22 30,60±7,35 136,73±37,71
3,65±0,72 96,80±16,94
Внутриселезе-ночная трансплантация ФГЧ
Примечание. * — достоверность различий (тест Вилкоксона p<0,05) по отношению к данным до трансплантации, ** — по отношению к данным в соответствующие сроки исследования без трансплантации.
этого показателя за счет воздействия донорских ФГЧ на организм экспериментальных животных, что совпадало с клиническими проявлениями уменьшения симптомов гепатоцеребральной недостаточности.
Эффективность лечения крыс 2-й группы оценивали также по их выживаемости. Выживаемость крыс на 7-е сутки составила 26,7% против 13,3% в группе животных без трансплантации. Максимальное продление жизнеспособности было зафиксировано на 14-е сутки: выживаемость животных с трансплантацией составила 60,0% против 20,0% без нее. Разница выживаемости между группами животных с трансплантацией ИГ и без трансплантации к концу наблюдения составила 40%, т.е. достоверно увеличилась в 2 раза (Р=0,0262) (рис. 2). Это подтверждает лечебный эффект применяемых в лечении ОПН у экспериментальных животных ФГЧ.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что коррекция ОПН может реализовываться двумя путями: 1) путем временного замещения функций
Рис. 2. Кривые 14-суточной выживаемости Каплана-Мейера после индукции ОПН (1-я гр.) и лечения внут-риселезеночной трансплантацией ФГЧ (2-я гр.). Тест Logrank = 0,0262).
пораженного органа с использованием различных методов, которые включают детоксикационные мероприятия и поддержание секреторной функции; 2) за счет увеличения скорости процессов регенерации.
Обсуждение
Гепатоциты млекопитающих представляют собой дифференцированные полиплоидные клетки, которые при нормальных условиях стабильно находятся в фазе G0/G1 клеточного цикла (рис. 3). Длительность существования таких митотически инертных гепатоци-тов соответствует продолжительности жизни человека. Результаты научных исследований позволяют квалифицировать гепатоцит как унипотентную коммити-рованную популяцию стволовых клеток, способных поддерживать постоянство структуры и функции печени при повреждении любой этиологии [1,3,7,8]. В случае утраты части паренхимы печени гепатоциты проявляют практически безграничную способность к раз-
Рис. 3. Многоступенчатая модель регенерации печени: разделена на две фазы, наполняя (активная) и прогрессия клеточного цикла. Активизирование — обратимый процесс, инициированный цитокинами. Активизирование сенсибилизирует клетки к факторам роста.
множению при чрезвычайно высокой скорости регенерации — при неоднократной хирургической резекции от 70 до 80% клеточной массы паренхимы печени ее восстановление происходит за 5-6 дней. Факторы, продуцируемые как самой печенью, так и внепече-ночными тканями, взаимодействуя между собой и со специфическими рецепторами клеточных мембран, регулируют этот компенсаторный механизм.
I. Sakaida и соавт. [12] сообщают, что трансплантированные стволовые клетки костного мозга за счет увеличения экспрессии матриксных металлопротеи-наз и разрушения коллагеновых волокон уменьшают фиброз печени. Это способствует улучшению выживаемости мышей с CU-индуцированным повреждением печени. Но остается неясной связь этих изменений с непосредственным влиянием клеток.
На трансгенных мышах (ALuPA, Fah-/-) доказано, что зрелые гепатоциты, в отличие от других соматических клеток, имеют больший лимит Хейфлика, проявляя способность более чем к 100 репликативным циклам и полностью репопулируют печень у животных VI—VIII трансплантационного поколения [13]. Следовательно, гепатоциты характеризуются способностью к самоподдержанию на протяжении всей жизни организма, что является одной из основных характеристик клеток стволовых пространств и позволяет рассматривать дифференцированную паренхимальную клетку печени как унипотентную стволовую клетку. Считается, что унипотентность гепатоцитов связана с полиплоидным набором хромосом. В постнатальном онтогенезе размножение гепатоцитов характеризуется чередованием ацитокинетических и завершенных митозов, что приводит соответственно к состоянию одно- и двуядерности. Диплоидные двуядерные клетки к самовоспроизведению не способны, в результате чего у взрослых животных единичные диплоидные клетки печени сохраняются как предшественники всего ряда полиплоидных гепатоцитов. После повреждения печени митозы без цитокинеза исключаются, и деление клеток происходит по традиционному, завершенному типу, в результате чего пролиферирующая популяция гепатоцитов становится одноядерной. Поэтому двухъядерные клетки закладываются при нормальном медленном росте печени как потенциальные источники будущего клона одноядерных полиплоидных гепатоцитов с неограниченным числом потомков в условиях регенерации. Следовательно, заместительная клеточная терапия гепатоцитами и другими высокодифференцированными клетками позволяет через культуру избавиться от эндотелия и примеси тех сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлечены в процесс иммунного отторжения [4,5].
Таким образом, несмотря на различие в видовых характеристиках клеточного материала, нами в эксперименте установлена высокая эффективность их использования при лечении ОПН. Одной из главных причин этого является иммунологическая незрелость донорских фетальных клеток плодов человека ввиду неполноценности набора его антигенов. Благодаря этому иммунная система крыс-реципиентов, которым вводят изолированные фетальные гепатоциты, не в состоянии их распознать, а значит, и отторгнуть. Во-вторых, фетальные клетки еще сами недостаточно
зрелы, чтобы атаковать нового хозяина. В-третьих, пересаженные фетальные клетки мобилизуют и стимулируют собственные защитные силы организма, являясь, таким образом, мощным фактором, стимулирующим рост клеток. Это характеризуются выраженными антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. Несмотря на то, что имплантация фетальных клеток не является «генной терапией», вполне возможно, что биологически активные вещества, содержащиеся в них, способствуют экспрессии «молчащих» генов.
Выводы:
1. У животных с ОПН токсического генеза использование ксеногенных гепатоцитов раннего уровня онтогенетического развития (печень плода человека) сопровождается положительной динамикой биохимических показателей, способствует уменьшению проявлений гепатоцеребральной недостаточности, предупреждает развитие печеночной комы и позволяет на 40,0% снизить летальность.
2. ФГЧ являются уникальным материалом, которые легко приживается в чужом организме и позволяют исключить при их трансплантации использование дорогостоящих иммуносупрессоров, оказывающих массу побочных эффектов.
Литература
1. Берсенев А.В. Трансплантация клеток эмбриональной печени и стволовых клеток костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий атероге-неза. Автореф. дис.... канд. мед. наук. М 2003; 18.
2. Долгих М.С. Современные технологии создания имплантируемой биоискусственной печени. Био-мед химия 2010; 56(4): 425-442.
3. Курильская Т.Е. Патогенетическое обоснование фетальной терапии в профилактике и комплексном лечении ишемической болезни сердца: Автореф. дис.... д-ра мед. наук. Иркутск 1999; 36.
4. Назыров Ф.Г. Современные этические аспекты использования новых биотехнологий в медицине. Медикал Экспресс. 2009; 2: 3-5 (http:// medicalexpress.uz/index.php?id=bioethics-article-10&lang=ru).
5. Онищенко Н.А., Клименко Е.Д., Поздняков О.М. Клеточная терапия как способ коррекции патогенетических нарушений при дислипидемии и ранних стадиях атерогенеза. Вестн РАМН 2006; 9-10: 88-95.
6. Пархисенко Ю.А., Алексеев Д.В. Использование экстракорпоральных систем поддержки печени при острой или молниеносной печеночной недостаточности в трансплантологии. Хирургия 2004; 4: 55-60.
7. Рунович А.А., Пивоваров Ю.И., Курильская Т.Е. и др. Изменения показателей липидного обмена и системы гемостаза при внутривенной и внутрипеченоч-ной трансплантации неонатальных аллогенных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхо-лестеринемии. Пат физиол 2005; 1: 14-16.
8. Стрекаловский Д.В., Никифоров С.Б., Гольдберг О.А. и др. Влияние трансплантации фетальной ткани печени на морфологические изменения при экспериментальном атеросклерозе. Бюл экспер биол. 1998; 1: 134-137.
9. Чикотеев С.П., Товаршинов А.И., Плеханов А.Н.,
Лепехова С.А. Трансплантация изолированных гепатоцитов при печеночной недостаточности. Клин мед 2003; 81(4): 11-15.
10.Leifeld L., Merk P., Schmitz V. et al. Course and therapy of acute liver failure. Eu^ J Med Res, 2008;13 (2):87-91.
11.Lu B.R., Gralla J., Liu E. et al. Evaluation of a scoring system for assessing prognosis in pediatric acute liver failure. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6 (10): 11401145.
12.Sakaida I., Terai S., Yamamoto N. et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice. Hepatology 2004; 40 (6): 1304-1311.
13.Sandgren E.P., Quaife C.J., Paulovich A.G. Pancreatic tumor pathogenesis reflects the causative genetic lesion. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88(1): 93-97.
14.Smets F., Najimi M., Sokal E.M. Cell transplantation in the treatment of liver diseases. Pediatr. Trans-plant2008; 12 (1): 6-13.
15.Wu D.C., Boyd A.S., Wood K.J. Embryonic stem cell transplantation: potential applicability in cell replacement therapy and regenerative medicine. Front Biosci 2007; 12: 4525-4535.
16.Zheng J.F., Liang L.J., Wu C.X. et al. Transplantation of fetal liver epithelial progenitor cells ameliorates experimental liver fibrosis in mice. Wld J. Gastroenterol 2006; 12 (45): 7292-7298.
ЭКСПЕРИМЕНТДА УТКИР ЖИГАР ЕТИШМОВ-
ЧИЛИГИНИ ДАВОЛАШДА ОДАМ ФЕТАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРИНИНГТРАНСПЛАНТАЦИЯСИ САМАРАДОРЛИГИ
Ф.А.Хаджибаев, М.Д.Уразметова, А.А.Мадаминов,
Р.К.Ахмедова, М.И.Абдукадырова Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази
CCl4 экспериментал моделида одамнинг 18-22 хафталик хомила фетал гепатоцитларини транспланта-циясининг даволаш самараси намоён булди. Бу холат уткир жигар етишмовчилиги булган ва талок ичига фетал гепатоцитлар трансплантация килинган кала-мушларнинг яшаб кетиши ва клиник-биохимёвий курсаткичларнинг яхшиланишида уз аксини топди. Токсик генезли уткир жигар етишмовчилиги булган жониворларни даволашда эрта онтогенетик ривожла-ниш холатидаги ксеноген гепатоцитларнинг куллани-лиши биокимёвий курсаткичларнинг ижобий динами-касига эришиш билан бир каторда, гепатоцеребрал етишмовчилигининг хам камайишига, жигар комаси келиб чикишини олдини олишга ёрдам берди ва улим курсаткичини 40%га камайтиришга имкон берди. Одам хомиласининг фетал гепатоцитлари ноёб материал булиб, ёт организмда енгил яшаб кета олди ва бир катор салбий таъсирларга эга булган кимматбахо иммуносупрессорларни куллашдан воз кечиш имкони-ни берди.
Контакт: Мадаминов Айбек Азатович,
Экспериментальный отдел РНЦЭМП.
100107, Ташкент, ул Фархадская, 2.
Тел.: +99897-1572030.
