CC BY
16
Экспериментальные исследования
УДК: 611.36:57.043:612.017.1
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ АЛЛОГЕННЫХ И КСЕНОГЕННЫХ ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ НА ИММУННЫЙ СТАТУС КРЫС С ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ
А.М.ХАДЖИБАЕВ1, М.Д.УРАЗМЕТОВА1, А.А.МАДАМИНОВ1, Ф.А.ХАДЖИБАЕВ1, Л.И.МИРКАМАЛОВА2, М.И.АБДУКАДЫРОВА1
Comparative estimation of influence allogenic and xenogenic isolated hepatocytes on the rats immune status with acute hepatic insufficiency
A.M.KHADJIBAEV, M.D.URAZMETOVA, A.A.MADAMINOV, F.A.KHADJIBAEV, L.I.MIRKAMALOVA, M.I.ABDUKADIROVA
Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи1,
V V V 2
Центральный военный клинический госпиталь МО РУз
В эксперименте на белых беспородных крысах с острым поражением печени на моделях острой печеночной недостаточности (ОПН), индуцированной гепатотоксическими (КЦ) методами, применяли трансплантацию изолированных гепатоцитов (ИГ) аллогенных (крыс) и ксеногенных (новорожденных ягнят и поросят - ИГНЯ и ИГП). Исследованиями основных параметров иммунного статуса (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ и CDW+клетки, ФАН и ЦИК) выявлено, что ксеногенные ИГНЯ и ИГП оказывают действие, аналогичное алло-генным ИГ крыс: способствуют нормализации измененных показателей. Разница заключается в недостоверном отличии действия ИГНЯ и ИГП (2-12%) от ИГ крыс. Установлена возможность применения трансплантации ИГ новорожденных ягнят и поросят при лечении острого поражения печени.
Ключевые слова: изолированные гепатоциты, трансплантация, острое поражение печени, острая печеночная недостаточность, иммунный статус.
In experiment on white not purebred rats with an acute lesion of a liver on models of acute hepatic insufficiency (AHI), induced hepatotoxic (ГСЦ methods, applied transplantation of the isolated hepatocytes (IH) of allogenic (rats) and xenogenic (newborn lambs and pigs - IHNL and IHP). By researches of key parameters of the immune status (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ and CD19+ cells), it was taped, that xenogenic IHNL and IHP have the an effect similar allogenic IH of rats: normalization of the changed indicators promote. The difference consists in doubtful difference of action IHNL and IHP (2-12 %) from IH of rats. Possibility of application of transplantation of IH of newborn lambs and pigs is established at treatment of an acute lesion of a liver.
Key words: isolated hepatocytes, transplantation, acute lesion of a liver, acute hepatic insufficiency, immune status.
Частота поражений печени токсической и вирусной природы, которые занимают большой удельный вес, имеет тенденцию к увеличению. Ежегодно около 26 тыс. из трех миллионов больных с хроническими заболеваниями печени умирают от недостаточности и цирроза [12,14,15]. Единственным методом радикальной терапии этих больных является трансплантация печени. Однако применяется она довольно редко. Одним из подходов к решению проблемы на современном этапе является использование клеточных технологий, в частности трансплантация изолированных гепатоцитов (ИГ) человека. Но из-за дефицита донорского материала необходимо изыскание другого эффективного и доступного клеточного материала [4,8,13]. Интерес представляют ИГ новорожденных каракульских ягнят (ИГНЯ), основным препятствием для применения которых является естественный иммунологический барьер реципиента. За основу нами были взяты положительные результаты применения островковых клеток поджелудочной железы новорожденных ягнят при лечении больных с сахарным диабетом [1,3,5].
Цель исследования — сравнительный анализ эффективности применения трансплантации аллогенных и ксеногенных ИГ при остром поражении печени в эксперименте на основании иммунологических показателей.
Материал и методы
В эксперименте использованы 80 половозрелых беспородных крыс-самцов массой от 150 до 200 г. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986), и с одобрения Национального этического комитета. Острое поражение печени получали путем создания гепатотоксической модели острой печеночной недостаточности (ОПН) с помощью внутрибрюшинного введения чистого СС14 в дозе 1 мл/кг массы тела. Животные были разделены на 4 группы: 1-я контрольная группа с моделью ОПН без трансплантации, 2-я — животные с ОПН и трансплантацией аллогенных ИГ крыс (ИГК), 3-я — животные с ОПН и трансплантацией ИГ новорожденных ягнят (ИГНЯ) и 4-я — животные с ОПН и трансплантацией ИГ новорожденных поросят (ИГП).
Трансплантацию ИГК, ИГНЯ и ИГП проводили подкожным введением взвеси гепатоцитов, а в контрольной — равного объема среды разведения. Для получения ИГ использовали печень 10 крыс и 10 новорожденных каракулевых ягнят 4-7-дневного возраста и 10 поросят. Гепатоциты выделяли по методу Р.Бе§!еп (1976) с применением ЭДТА. Жизнеспособность гепатоцитов оценивали по их окрашиванию 0,2% раствором трипа-
нового синего с подсчетом клеток в камере Горяева. Клетки трансплантировались при жизнеспособности более 85%. Полученные гепатоциты разводили до концентрации 20 млн клеток/мл и хранили в пеницилли-новых флаконах при 40 С до использования.
Трансплантацию ИГ животным производили в период между 30 и 34 часами после моделирования острого поражения печени. Пятьдесят миллионов (0,5x108) ресуспендированных гепатоцитов вводили под кожу спины специальной иглой, соединенной с 1 мл шприцем. Иммуносупрессия при этом не применялась. После процедуры трансплантации животных помещали в теплое помещение со свободным доступом к воде и пище.
Клиническое состояние оценивали с помощью унифицированной методики с учетом пятибалльной степени печеночной энцефалопатии [8]. Функцию печени определяли с помощью биохимических показателей сыворотки крови животных (общий билирубин, альбумин, активность аланинаминотрансферазы — АлАТ и аспартатаминотрансферазы — АсАТ и аммиака) унифицированными методами, принятыми в клинической практике (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Оценка иммунного статуса включала определение относительного содержания Т- и В-лимфоцитов (CD3+, СЭ20+лимфоцитов), иммунорегуляторных лимфоцитов Т-хелперов/индукторов (CD4) и Т-цитотоксических супрессоров (CD8), натуральных киллеров (CD16) методом непрямого розеткообразования [2,7] с применением моноклональных антител серии ИКО (МедБиоСпектр, Россия), определение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).
Результаты и обсуждение
Состояние иммунной системы является индикатором, отражающем влияние на организм различных экзо- и эндогенных воздействий. Поэтому нами изучены основные параметры иммунного статуса крыс с патологически измененной под воздействием CCl4 печенью.
В таблице представлены параметры иммунного статуса у крыс с ОПН, индуцированной CCl4 и контрольных животных. На 3-й день в периферический крови экспериментальных животных относительное содержание CD3+-клеток (Т-лимфоцитов) снижалось в среднем в 1,5 раза до 28,8±0,59% (в контроле 44,1±0,71%; р<0,01). Количественное содержание Т-клеток на 7-й и 14-й день эксперимента достоверно
уменьшалось соответственно на 11,6 и 9,5% (р<0,05).
На 3-й день эксперимента содержание Т-хелперов/ индукторов достоверно снижалось в 1,6 раза до 19,2±0,56% против 29,7±0,57% в контроле (р<0,01). Уровень СЭ4+-клеток к концу эксперимента несколько возрастал. Так, на 7-й день этот показатель был равен 20,0 ± 0,55%, а на 14-й день - 21,5±0,68%, несколько приближаясь к контролю (табл.). При этом установлена тенденция к снижению количества СЭ8+клеток до 16,6±0,57% в 1-е сутки эксперимента против 19,1±0,57% в контроле. К концу эксперимента на 7-й и 14-й дни этот показатель уменьшился до 15,2±0,50 и 17,4±0,81%. При этом соотношение СЭ4/СЭ8 снижалось от 1,16 до 1,24, несколько увеличиваясь к 7-му дню эксперимента до 1,32 против 1,55 в контроле.
Количественное содержание натуральных киллеров определяли по идентификации на поверхности лимфоцитов СЭ16 рецепторов. Так, у крыс с СС14-индуцированной ОПН относительное содержание СЭ16+клеток на 3-й день эксперимента составило 12,0±0,51%, что в 1,46 раза превышало контроль (р<0,05). На 7-й и 14-й дни содержание СЭ16+клеток несколько снижалось, оставаясь, однако, выше контроля.
Содержание В-лимфоцитов определяли по идентификации на их поверхности СЭ20-рецепторов. В динамике эксперимента наблюдалось небольшое колебание содержания СЭ20+клеток: 19,4±0,53, 20,1±0,71 и 20,5±0,64% на 3-е, 7-е и 14-е сутки против 21,9±0,43% в контроле (р>0,05).
У животных с СС14-индуцированной ОПН 3-й день эксперимента ФАН достоверно снижалось до 40,3±0,51%, что на 22% ниже контроля (р<0,01), а на 14-е сутки — до 34,9±0,85% (табл.). Со стороны неспецифических факторов защиты отмечалось увеличение количества натуральных киллеров (СЭ16+) и резкое подавление ФАН. Содержание ЦИК у животных с ОПН на 3-й день возрастало 2 раза, а к концу эксперимента — в 3,35 раза (р<0,001).
Таким образом, при ОПН, индуцированной СС14, регистрируются неспецифические изменения основных параметров иммунного статуса, свидетельствующие о количественном Т-клеточном дефиците с нарушением процесса иммунорегуляции (снижение имму-норегуляторного индекса — ИРИ), естественных факторов защиты (повышение натуральных киллеров и снижение ФАН) и гуморального звена иммунной системы (повышение ЦИК) (рис. 1). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными [6].
Для устранения ОПН на ее фоне животным прово-
Таблица. Показатели иммунного статуса крыс с ОПН, индуцированной CCI4, М ± m
Иммунологический показатель Контроль, n=10 3-й День эксперимента 7-й 14-й
CD3,% 44,1 ± 0,71 28,8±0,59* 32,4±0,58* 33,4±0,64*
CD4,% 29,7 ± 0,57 19,2±0,56* 20,0±0,55* 21,5±0,68*
CD8,% 19,1 ± 0,57 16,6±0,57* 15,2±0,50 17,4±0,81
CD4/CD8 1,55 1,16 1,32 1,24
CD16,% 8,2 ± 0,36 12,0±0,51* 11,3±0,74 10,3±0,54
CD20, % 21,9 ± 0,43 19,4±0,53 20,1±0,71* 20,5 ± 0,64
ФАН, % 51,6 ± 0,54 40,3 ± 0,51* 36,7 ±0,85* 34,9 ±0,85*
ЦИК, усл. ед. 28,1 ± 0,43 55,4 ±0,80* 64,1±0,74* 94,2 ± 0,74*
*— р<0,05 по сравнению с контролем.
Сравнительная оценка влияния аллогенных и ксеногенных изолированных гепатоцитов на иммунный статус
100 50
■ 003
■ 0020
□ 004
□ 008
■ ИРИ
■ 0016 ■ ФАН □ ЦИК
Рис. 1. Показатели иммунного статуса у крыс с развитием ОПН на 3-е, 7-е и 14-е сутки эксперимента, % к контролю.
дили трансплантацию аллогенных (ИГК) и ксеногенных (ИГНЯ и ИГП) гепатоцитов методом подкожной инъекции между 30-34 часами после индукции ОПН.
Положительное влияние аллогенных и ксеногенных ИГ на иммунологические показатели животных, в отличие от контроля при ОПН и групп животных с ОПН и трансплантацией, наблюдалось на 3-е и 7-е сутки эксперимента. Более выраженная тенденция к нормализации параметров иммунного статуса, особенно к концу эксперимента отмечалась в результате трансплантации ИГ крыс. Так, на 14-е сутки количество Т-лимфоцитов (СЭ3+клеток) при трансплантации аллогенных ИГК увеличилось на 20%, а в группах с ксе-нотрансплантацией (ИГНЯ и ИГП) на 13 и 15%; число иммунорегуляторных СЭ4+ увеличилось на 20,2% против 11,4 и 14,5% соответственно, ФАН возросла на 24% против 18,6 и 22,7%.
Высокие показатели СЭ20+, СЭ16+клеток и ЦИК в результате трансплантации ИГК снизились на 7, 1 и 202%, а ИГНЯ и ИГП — на 0,5, 5 и 204% (рис. 2).
250 200
ИНН
■ 003
■ 0020
□ 004
□ 008
■ ИРИ
■ 0016 ■ ФАН □ ЦИК
ОПН
ИГК
ИГЯ
ИГП
Рис. 2. Влияние трансплантации аллогенных (ИГК) и ксеногенных (изолированных гепатоцитов новорожденных ягнят - ИГНЯ) и ИГП на показатели иммунного статуса крыс с ОПН на 14-е сутки эксперимента, % к контролю.
Влияние ксеногенных гепатоцитов при трансплантации, в отличие от аллогенных, проявилось в статистически недостоверном снижении иммунологических показателей на 2-12% (р>0,05). ИГ поросят, в отличие от ИГ ягнят, оказывали аналогичное действие на показатели иммунного статуса, в некоторых случаях больше приближаясь к действию ИГ крыс (рис. 3).
В результате трансплантации ИГ улучшение клинического состояния животных совпадало с положительными изменениями иммунологических параметров. Побочных эффектов после лечения мы не наблюдали.
Как аллотрансплантация, так и ксенотранспланта-ция ИГ способствовали увеличению процента выжива-
■ ИГЯ
■ ИГП
150 100 50 0
СйЭ Сй20 СР4 СР8 ИРИ Сй16 ФАН ЦИК
Рис. 3. Показатели иммунного статуса крыс с трансплантацией ксеногенных изолированных гепа-тоцитов новорожденных ягнят (ИГЯ) и ИГП на 14-е сутки эксперимента, % к контролю.
ния и продолжительности жизни экспериментальных животных. Так, если у животных с острым поражением печени выживаемость на 14-е сутки эксперимента составила 20%, то при трансплантации ИГК, ИГНЯ и ИГП выживание к концу опыта увеличилось до 50%, т.е. в 2,5 раза.
Ранее было показано [8-10], что основной причиной гибели животных от ОПН является степень печеночной энцефалопатии. Установлено, что V степень печеночной энцефалопатии наблюдалась у 50% у животных с СС!4. Тяжесть степени печеночной энцефалопатии была связана с биохимическими показателями, отражающими нарушение метаболизма в печени: повышение уровня общего билирубина, АлАТ, АсАТ, аммиака.
Иммунологические исследования при ОПН на модели, индуцированной СС!4 выявили неспецифические изменения основных параметров иммунного статуса, определяющие количественный Т-клеточный дефицит с нарушением процесса иммунорегуляциии (снижение Т-хелперов/индукторов (СЭ4+лимфоци-тов), изменение естественных факторов защиты с подавлением ФАН и увеличением количества натуральных киллеров (СЭ16+клеток), а также изменения гуморального звена иммунитета, проявляющиеся в резком (в 3,3-3,5 раза) увеличении ЦИК в сыворотке крови.
На модели ОПН у крыс СС!4 было апробировано лечебное действие, трансплантации ИГК, ИГНЯ и ИГП с использованием живой культуры гепатоцитов путем подкожной инъекции.
Трансплантация ИГ способствовала увеличению процента выживания и продолжительности жизни экспериментальных животных. Трансплантация ИГНЯ и ИГП на фоне индуцирования ОПН, недостоверно отличаясь, вызывала изменение иммунологических показателей с тенденцией к нормализации, что являлось одной из главных причин стабилизации достигнутых результатов (рис. 3).
Положительные иммунологические изменения показывают иммунокорригирующее действие трансплантации ксеногенных ИГ при ОПН. При сопоставлении эффективности влияния трансплантации ксено-генных (ИГНЯ и ИНП) и аллогенных гепатоцитов крыс (ИГК) на иммунный статус выявлена недостоверная разница между ними, что объясняется менее выраженными антигенными свойствми эмбриональных клеток, в отличие от клеток взрослого организма. Все
250
200
50
0
3 с
7 с
14 с
150
100
50
0
вышесказанное определяет возможность использования в качестве донорского материала при ОПН ксено-генных ИГНЯ и ИГП, при этом трансплантации ИГП и ИГК имеют минимальные отличия.
Эффективность лечения определяется не столько детоксикационными свойствами гепатоцитов, но и поступлением в кровь реципиента факторов регенерации печени из трансплантируемых клеток - ИСР-фактора роста гепатоцитов, ТСРа-трансформирующего фактора рости, ФНО - фактора некроза опухоли, ИЛ-6 и др. [9]. Эмбриональные клетки и клетки новорожденных животных проявляют высокую пролифератив-ную активность, обладают меньшей чувствительностью к факторам роста [11], что позволяет использовать изолированные эмбриональные гепатоциты для улучшения биологической функции при остром поражении печени.
Выводы:
1. По эффективности влияния на иммунологические показатели животных с ОПН не выявлено достоверных различий между трансплантацией гепатоци-тов аллогенных (ИГ крыс) и ксеногенных (ИГНЯ и ИГП) гепатоцитов.
2. Не выявлено достоверной разницы между влиянием на иммунный статус трансплантации ксеноген-ных ИГНЯ и ИГП.
3. На основании иммунологических исследований установлена возможность применения при остром поражения печени трансплантации ксеногенных ИГ новорожденных ягнят и поросят.
Литература
1. Арипов У.А. Пересадка островковых клеток Лангер-ганса поджелудочной железы в лечении инсулин-зависимого (1-типа) сахарного диабета. Актуальные проблемы хирургии и трансплантологии. Ташкент 1997; 14-17.
2. Залялиева М.В. Методы определения субпопуляций лимфоцитов у человека. Метод. рекомендации. Ташкент 2004; 18.
3. Исламов Б.Ф. Хирургическое лечение инсулинзави-симого сахарного диабета пересадкой островковых клеток поджелудочной железы (экспериментально -клиническое исследование). Автореф. дис. ... д-ра мед.наук. Ташкент 1998; 36.
4. Онищенко Н.А. Клеточная технология и современная медицина. Новости дня 2008; 23.
5. Уразметов К.Г., Мамадалиев Ш.Х., Исламов Б.Ф., Елецкая Н.В. Влияние пересадки аллогенных остров-ковых клеток поджелудочной железы у крыс с ал-локсановым диабетом. Докл АН РУз 1995; 2: 51-54.
6. Хаджибаев А.М., Акзамов А.А., Уразметова М.Д Иммунная система при тяжелой печеночной недостаточности. Мед журн Узбекистана 2004; 1-2: 216-219.
7. Чередеев А.Н., Горлина Н.К., Козлов И.Г. СЭ-маркеры в практике клинико-диагностических ла-
бораторий. Клин лаб диагностика 1999; 6: 25-32.
8. Шиманко И.И., Мусселиус С.Г. Острая печеночная недостаточность. М Медицина 1993; 288.
9. Bilir B.M., Guinette D., Karrer F. Hepatocyte transplantation in acute liver failure. Liver Transpl 2000; 6: 32-40.
10.Chongsrisawat V., Hutagalung Y., Poovorawan Y. Liver function test results and outcomes in children with аcute liver failure due to dengue infection. South Asian J Trop Med Public Htalth 2009; 40 (1): 47-53.
11.Demetrion A.A., Matry R.R., Hughes R.D. et al. Hepatocyte transplantation for inherited factor VII deficiency. Transplantation 2004; 78: 1812-1814.
12.Habib A., Wendy M.B., Douglas M.H. Long-Term management of cirrhosis Appropriate supportive care is both critical and difficult. Postgr Med 2001.
13.Horslen S.P., Fox I.J. Hepatocyte transplantation. Transplantation 2004; 77: 1481-1486.
14.Muraca M., Gerunda G., Neri D. et al. Hepatocyte transplantation as a treatment for glycogen storage disease type 1a. Lancet 2002; 359: 317-318.
15.Riordan S.M., Williams R. Acute liver failure: targeted artificial and Hepatocyte-based support of liver regeneration and reversal of multiorgan failure. [Review] [156 refs]. J Hepatol 2000; 32 (1 Suppl): 63-76.
УТКИР БУЙРАК ЕТИШМОВЧИЛИГИ БУЛГАН КАЛАМУШЛАРНИНГ ИММУН *ОЛАТИГА АЖРА-ТИЛГАН АЛЛОГЕН ВА КСЕНОГЕН ГЕПАТОЦИТ-ЛАР ТАЪСИРИНИ КИЁСИЙ БА^ОЛАШ
А.М.Хаджибаев1, М.Д.Уразметова1, А.А.Мадаминов1, Ф.А.Хаджибаев1, Л.И.Миркамалова2, М.И.Абдукадырова1 Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази1, Мудофаа вазирлигининг Марказий харбий клиник госпитали2
Зотсиз ок рангли каламушларда утказилган тажри-баларда уткир жигар етишмовчилиги модели гепато-токсик CCL4 услуби ёрдамида чакирилиб, уларда ал-логен (каламушларнинг) ва ксеноген (янги тугилган кузичокларнинг ва чучка болаларининг) ажратилган гепатоцитлар трансплантацияси кулланилди. Иммун холатнинг асосий параметрлари (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ и CD19+клетки, ФАН и ЦИК)ни урганиш на-тижасида ажратилган аллаген ва ксеноген гепатоцитлар узгарган курсаткичларни бир хил даражада нор-маллаштириши ани кланди. Янги ту гилган кузичокларнинг ва чучка болаларининг ажратилган гепатоцитлари трансплантациясини жигарнинг уткир шикастланишларини даволашда куллаш мумкинлиги тажрибада курсатилган.
Контакт: проф.Уразметова Маиса Дмитриевна 100107, Ташкент, ул. Фархадская, 2. РНЦЭМП.
E-mail: urazmetovr@gmail.com
