CC BY
18
УДК: 612.359: 612.351.6:618.393:616.08
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВНУТРИСЕЛЕЗЕНОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА КАК СПОСОБА КОРРЕКЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КРЫС
М.Д.УРАЗМЕТОВА, Р.Ш.МАВЛЯН-ХОДЖАЕВ, А.А.МАДАМИНОВ, Р.К.АХМЕДОВА, М.И.АБДУКАДЫРОВА, Ф.С.ЮСУПОВА
Morphofunctional estimation of efficiency of intrasplenic transplantation of fetal human hepatocytes as a way of hepatic insufficiency correction at rats
M.D.URAZMETOVA, R.SH.MAVLYAN-HODJAEV, A.A.MADAMINOV, R.K.AHMEDOVA, M.I.ABDUKADIROVA, F.S.YUSUPOVA
Республиканской научный центр экстренной медицинской помощи
Белым беспородным крысам с ОПН, воспроизведенной методом однократного внутрибрюшинного введения неразведенного четыреххлористого углерода, внутриселезеночно трансплантировали фетальные гепа-тоциты человека (ФГЧ), что оказывало положительное влияние на все биохимические параметры крови. На 14-21-е сутки после введения ФГЧ в пульпу селезенки крыс с моделью ОПН в паренхиме печени развивались репаративно-восстановительные процессы, что выражалось, главным образом, в гипертрофии и гиперплазии гепатоцитов. Соединительнотканные тяжи между печеночными дольками к концу эксперимента исчезали не полностью, что свидетельствовало о частичном восстановлении структуры печени животных. Значительным и основным фактором в восстановлении паренхимы являлась полиплоидия печеночных клеток, выражающаяся в увеличении размеров ядер гепатоцитов и гипертрофия самих клеток, что является косвенным подтверждением приживления ФГЧ в печени крыс с моделью ОПН.
Ключевые слова: морфология, фетальные гепатоциты человека, острая печеночная недостаточность, четыреххлористый углерод, внутриселезеночная трансплантация гепатоцитов.
White outbred rats with ALF reproduced by a method of unitary intraperitoneal introduction of undiluted Carbon Tetrachloride, intrasplenic have been transplanted Human's Fetal Hepatocytes (HFH). Transplantation of HFH by an animal with ALF had positive impact on all biochemical parametres of blood of investigated animals. Morphological researches have shown, that in a parenchyma of a liver of rats after introduction of HFH in a pulp of a lien to rats with model ALF in a liver parenchyma for 14-21 days there were the reparativ-regenerative processes expressed mainly in a hypertrophy and a hyperplasia of hepatocytes. Connective tissue taenia between hepatic lobes by the end of experiment disappeared, but not completely, that testified partial restoration of structure of animals liver. And a major factor in parenchyma restoration was the polyploidy of hepatic cells expressed in augmentation of the sizes of kernels of hepatocytes and a hypertrophy of cells that is indirect acknowledgement of engraftment HFH in a liver of rats with model ALF was appreciable.
Keywords: Morphology, Human's Fetal Hepatocytes (HFH), Acute Liver Failure (ALF), Carbon Tetrachloride Poisoning, Intrasplenic Transplantation Hepatocytes.
Экспериментальные исследования
По данным ВОЗ, смертность от хронической печеночной недостаточности занимает пятое место среди других заболеваний, а от острой печеночной недостаточности (ОПН) достигает 70-90% [6,7,9,13]. Печеночная недостаточность может осложнять течение не только заболеваний гепато-панкреатодуоденальной зоны, но и других органов и систем организма. Описаны случаи молниеносной печеночной недостаточности при миллиарном туберкулезе, раке легкого, болезни Альцгеймера и другой патологии [8].
Лечение печеночной недостаточности с помощью трансплантации зрелых соматических и фетальных гепатоцитов является новым этапом развития практической гепатологии [2,5,4,11,14]. Трансплантация ге-патоцитов направлена на восстановление утраченных функций печени пациента и активацию регенерации неповрежденной паренхимы печени. Такой подход объясняется тем, что даже в очень сильно поврежденной печени часть паренхиматозных клеток окружающих зоны некроза, является жизнеспособной и при определённых условиях может регенерировать [10].
Цель работы - изучение морфофункциональных
критериев эффективности внутриселезеночной трансплантации изолированных гепатоцитов в коррекции тяжелой формы печеночной недостаточности у экспериментальных животных.
Материал и методы
В качестве донорского материала использовали печень из плодов человека. Фетальные гепатоциты человека (ФГЧ) (18-22 нед. внутриутробного развития) получали в результате легальных абортов, выполне-ных в поздние сроки по медицинским показаниям в отделении патологии беременности 1-й, 6-й и 9-й городских больниц г. Ташкента. Для получения гепатоцитов из печени плода использовали методику выделения клеток, состоящую из 4 этапов: I —нерецир-куляторная перфузия печени ЭДТА-содержащим раствором, II — рециркуляторная перфузия печени раствором, содержащим 0,025% коллагеназы, III — диспергирование печени, IV — отмывка гепатоцитов центрифугированием [1]. При микроскопировании клеточного состава полученных ФГЧ определялись гепатоциты и их предшественники — гепатобласты до
Морфофункциональная оценка эффективности внутриселезеночной трансплантации фетальных гепатоцитов
60%, гемопоэтические клетки (в том числе макрофаги) — до 30% и непаренхиматозные клетки — до 10%. Выход клеток из 1 г ткани печени составил 12,6±0,28 (х108), жизнеспособность в первые 2 часа после получения — 96,2±3,4%. Жизнеспособность клеток оценивали следующим способом: 300 мкл раствора трипа-нового синего добавляли к 100 мкл суспензии клеток (конечная концентрация трипанового синего 0,45%).
Модель ОПН воспроизводилась путем однократного внутрибрюшинного введения половозрелым беспородным крысам-самцам неразведенного гепатотроп-ного токсина СС14 в дозе 1 мл/кг [3]. Животные были разделены на две группы. Всего в эксперименте использовано 140 половозрелых беспородных крыс-самцов массой 170-220 г. 1-ю (контрольную) группу составили крысы с моделью ОПН. Во 2-ю (сравнительную) группу вошли животные, которых лечили с помощью ФГЧ без дополнительного введения иммуносу-прессоров. Для этого им внутриселезеночно трансплантировали свежевыделенные ФГЧ на вторые сутки после индуцирования ОПН в дозе 15-20 млн клеток в объеме 0,15-0,20 мл в питательном растворе RPMI 1640 лапаротомическим доступом в нижний и средний полюс паренхимы селезёнки в 2-3 точки путем медленной и осторожной инъекции 1 мл туберкулиновым шприцем в течение 1,0-1,5 мин (рис.). В момент введения селезенку слегка смачивали физиологическим раствором, предохраняя его от высыхания. После окончания процедуры введения клеток кровотечения и разрыва капсулы селезенки не наблюдалось. Такой способ введения ФГЧ выбран нами потому, что вена селезенки имеет общий кровоток с печенью, что позволяет вводимым в течение 20 минут ФГЧ сразу попадать в ткань печени. Кроме того, по данным разных авторов, селезенка ввиду общности филогенетического развития с печенью имеет способность удерживать часть фетальных клеток в своей паренхиме, образовывая, таким образом, очаги (пулы) размножения из ФГЧ.
Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986), и с одобрения Национального этического комитета. За экспериментальными животными наблюдали в течение 21 суток. Биохимические параметры крови изучали после забоя животных на 0, 7-е, 14-е сутки. Забой осуществляли под эфирным наркозом.
Световая микроскопия была выполнена в отделении патоморфологии РНЦЭМП и клинико-биохимической лаборатории. Для обзорной световой микроскопии материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. На светооптическом уровне исследовали парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином для оценки морфологии клеток, суданом III для определения липидов и по Ван -Гизону — для визуализации фиброзного процесса.
Гистологически оценивалось полнокровие центральных и воротных вен, выраженность жировой дистрофии гепатоцитов, очаги некроза гепатоцитов состояние перипортальных трактов (разрастание соединительной ткани, формирование междольковых септ, инфильтрация) и желчных капилляров (изменения эндотелия, холестаз), воспалительно-
клеточная инфильтрация паренхимы, наличие делящихся клеток.
Для сравнительного анализа динамики изменения показателей в ходе эксперимента использовали непараметрическую статистическую обработку результатов. Для оценки достоверности различий до и после воздействия применялся критерий Вилкоксона. Для расчетов использовался статистический пакет программ Statistica. Значения p<0,05 рассматривались как достоверные.
Результаты и обсуждение
После введения четыреххлористого углерода наблюдалось токсическое поражение печени с картиной ОПН. При ОПН в крови крыс происходили достоверные нарушения всех биохимических параметров, напрямую связанных с поражением ткани печени. Трансплантация ФГЧ животным с ОПН оказывала положительное влияние на все биохимические параметры крови (табл.).
Лабораторным признаком печеночно-клеточной недостаточности является нарастание концентрации билирубина. В эксперименте у животных с моделью ОПН на 7-е сутки обнаружено достоверно увеличение содержание общего билирубина в 4,0 раза с пиком на 14-е сутки до 31,33±11,86 мкмоль/л (у здоровых 6,83±2,09). Через 5 и 12 суток после трансплантации ФГЧ повышенный уровень общего билирубина снижался в среднем на 31,5%, с достоверным снижением по отношению к данным крыс в соответствующие сроки исследования без трансплантации только на 7-е сутки (p<0,05).
Одним из основных показателей активности патологического процесса в печени является цитолиз. У животных с моделью ОПН активность индикаторных ферментов на 7-е и 14-е сутки достоверно повышалась: АЛТ — в 2,0 и 2,2 раза, АСТ — в 1,6 и 2,0 раза. Статистически достоверное снижение активности ферментов регистрировалось через 5-12 суток после трансплантации ФГЧ: АЛТ — на 62-69%, АСТ — на 58-62%.
Основным признаком ОПН является печеночная энцефалопатия, оказывающая решающее влияние на течение ОПН и прогноз заболевания. Этот симптом развивается вследствие проникновения через гемато-энцефалический барьер эндогенных нейротоксинов и их воздействия на астроглию как результат недостаточности клеток печени. Основную роль в этом механизме играет аммиак, занимающий ведущее место среди эндогенных нейротоксинов. В наших исследованиях концентрация аммиака в крови при ОПН во все сроки наблюдения возрастала в 1,8-2,4 раза. Пересадка ФГЧ способствовала достоверному снижению этого показателя за счет воздействия донорских ФГЧ на организм экспериментальных животных, что совпадало с уменьшением клинических симптомов гепатоцере-бральной недостаточности.
Таким образом, саногенные механизмы алло-трансплантации ФГЧ включают дезинтоксикационный и ускоряющий процесс пролиферации клеток при остром токсическом повреждении органа.
Выраженная патология отмечена при макроскопическом исследовании погибших на 5-6-е сутки крыс при лапаротомии — плотная поверхность печени красноватой окраски, зернистость и закругленность
^гШШШШ ЕШЯМИИ
Ш,- ■ •.•ГЛ. '
■ " / : ■■. ^ « ш 3 £ s, Щ ■ Ts» t ■. s Я
• ► л . ■ * i- -x и iSllTilI é rV » • .
«A. V
/ •„.' . , v ; - 3 •
. • * «
• ; « •
• f «•• ^ • >
краев. При микроскопическом исследовании выявлены повреждения гепатоцитов с очагами некрозов (более 1/3 площади среза) и лейкоцитарной инфильтрацией, участки дискомплексации балочных структур. Наиболее выраженные изменения были обнаружены на светооптическом уровне в зоне портальных трактов (рис.).
У всех крыс, погибших на 7-е сутки, при исследовании структуры печени наблюдались изменения, аналогичные таковым у погибших на 5-е сутки животных . Морфологические изменения в печени крыс, погибших на 8-9-е сутки, были представлены мелкоочаговыми некрозами, поврежденными гепатоцитами (до 1/3 площади среза), около некротически измененных гепатоцитов имелись скопления нейтрофилов. На 10-е сутки у погибших крыс отмечалась инфильтрация пе-рипортальных зон лимфоцитами. Сами гепатоциты были полиморфными. Как правило, клетки были увеличены в размерах. В цитоплазме их присутствовали
Рис. Структура печени при CCL4-UHdyu,up0eaHH0Ü ОПН. 7-21-е сутки эксперимента, световая микроскопия. Окраска гематоксилином и эозином, x200. А — контрольная группа, Б — основная группа. 1 - центральная вена; 2 - синусоиды, 3 — вакуолизированные гепатоциты; 4 - очаги, соответствующие локализации липидов при окраске суданом III.
признаки гидропической и зернистой дистрофии, преимущественно в области центральных вен. Балочное строение печени было нарушено. Имелись двуядер-ные гепатоциты. В ряде случаев наблюдались очаговые некрозы клеток печени. Просветы синусоидных капилляров неравномерно кровонаполнены. Пространства Диссе несколько расширены. В них появлялись тонкие пучки коллагеновых волокон (капилляризация синусоидов). Клетки Купфера увеличены в объеме. Морфологические изменения в печени крыс, погибших на 13-14-е сутки, были представлены жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризовались постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипорталь-ной зоны к центру. Таким образом, наблюдалось нарушение общей архитектоники печени, микроцир-куляторные нарушения, клеточный полиморфизм, разрушение пограничной пластинки; дискомплекса-ция гепатоцитов, жировая, гидропическая и балонная
1
2
Морфофункциональная оценка эффективности внутриселезеночной трансплантации фетальных гепатоцитов ...
Таблица. Биохимические показатели крови крыс после индукции ОПН (числитель) и лечения (знаменатель)
путем внутриселезеночной трансплантации ФГЧ (±SD)
Показатель Модель ОПН
7-е сутки 14-е сутки
Билирубин общий, мкмоль/л 6,83±2,09 27,64±10,49* 8,85±2,34** 31,33±11,86* 9,58±4,62
Альбумин, г/л 45,60±7,22 27,64±10,49* 40,62±8,82** 31,33±11,86* 37,58±6,37
АЛТ, мккат/л 30,60±7,35 60,27±6,69* 37,54±8,26** 66,50±10,82* 45,58±10,16
АСТ, мккат/л 136,73±37,71 217,91±34,34* 126,69±32,70** 270,83±66,82* 167,50±43,00
Мочевина, мкмоль/л 3,65±0,72 7,65±1,49* 4,23±0,72** 11,67±2,82* 5,49±1,58**
Аммиак, мкмоль/л 96,80±16,94 232,64±82,41* 135,08±43,56** 178,00±68,33 123,75±23,33
Примечание. * — достоверность различий (тест Вилкоксона Р<0,05) по отношению к данным до трансплантации, ** — по отношению к данным в соответствующие сроки исследования без трансплантации.
дистрофия гепатоцитов, липофусциноз гепатоцитов, очаговые гепатонекрозы, гиперхромия и полихромия, дегенерация (вакуолизация) ядер гепатоцитов; внут-ридольковая лимфо-плазмоцитарная инфильтрация, перицентральная лимфоидная инфильтрация.
Пересадка ФГЧ способствовала восстановлению и сохранности балочной структуры с преобладанием неповрежденных гепатоцитов, уменьшению жировых включений, увеличению количества непаренхиматозных клеток печени. ФГЧ оказывались наиболее эффективным методом коррекции печеночной недостаточности за счет протективной функции пересаженных клеток (рис.).
Результаты морфологического исследования печени крыс опытной группы после внутриселезеночного введения им ФГЧ в начальные сроки (7 дней) показали, что степень некроза печеночных клеток и воспалительно-клеточной инфильтрации паренхимы, фиброза, дистрофии гепатоцитов, степень пролиферации эпителия желчных протоков были выражены почти в той же степени, что и при изменениях печени крыс контрольной группы. Толстые соединительнотканные тяжи пронизывали паренхиму печени. Довольно большие участки в паренхиме занимали воспалительные инфильтраты, состоящие из лимфоцитов, макрофагов и фибробластов. Выявлялись отек, очаговые кровоизлияния и изменения цвета печени, резкое расширение синусоидов, портальных сосудов и центральных вен, выраженный стаз в них элементов крови.
К 14-м суткам явления отека паренхимы значительно уменьшались, в некоторых участках полностью исчезали. Наблюдались процессы пролиферации эпителия желчных протоков. Гепатоциты в паренхиме печени располагались беспорядочно.
Печеночные балки формировались в основном в непосредственной близости от расширенных сосудов портального тракта и центральных вен. Выявлялось большое количество гипертрофированных гепатоци-тов с большими ядрами. Количество двуядерных гепа-тоцитов несколько увеличивалось. Определялись признаки активации купферовских клеток, особенно вблизи соединительнотканных прослоек.
В последующие сроки (21-е сут.) на отдельных участках паренхимы печени отмечалось частичное восстановление балочной структуры (рис.). Структура и размеры гепатоцитов сильно варьировали. Основную массу паренхимы составляли гипертрофированные гепатоциты с ядрами различных размеров. Восстанавливалась цитоплазма некоторых печеночных клеток, при окраске гематоксилином и эозином они окрашивались в розовый цвет. В непосредственной близости от портальных трактов они были мелкие с плотной зернистой цитоплазмой, часто двуядерные. Ближе к периферии дольки структура печеночных балок не определялась, клетки были крупнее, с большими ядрами. В некоторых участках продолжали определяться участки с жировой дистрофией гепато-цитов. Соединительнотканные прослойки между печеночными дольками становились немного тоньше, чем в предыдущие сроки, иногда исчезали совсем.
Таким образом, развитие токсического гепатита, вызванного однократным введением четыреххлори-стого углерода, сопровождается жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризуется постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру. Морфологические исследования печени крыс с трансплантацией ФГЧ в пульпу селезенки показывают, что в паренхиме печени на 14-21-е сутки развиваются репаратив-но-восстановительные процессы, выражающиеся, главным образом, в гипертрофии и гиперплазии гепа-тоцитов. Соединительнотканные тяжи между печеночными дольками к концу эксперимента исчезают не полностью, что свидетельствует о частичном восстановлении структуры печени животных. При внутрисе-лезеночном введении ФГЧ при CCL4-OnH основным фактором регенерации является полиплоидия печеночных клеток, выражающаяся в увеличении размеров ядер гепатоцитов и гипертрофия самих клеток, восстановлении микротопографических взаимоотношений в ацинусе и создании условий для пролиферации гепатоцитов. Эти данные являются косвенным подтверждением приживления ФГЧ в печени крыс с моделированной острой печеночной недостаточностью.
Заключение
Положительное воздействие ксенотрансплантации фетальных гепатоцитов на поврежденную печень совпадает с эффектами регенерации печени, что обосновывает целесообразность трансплантации клеток, содержащей выделенные фетальные изолированные гепатоциты и создает предпосылки для использования их в клинических условиях при ОПН.
Литература
1. Арипов У.А., Пак Н.П., Исламов Б.Ф. ва бошк.. Донор жигарни тажрибада кучириб утказиш учун уни перфузия ва консервация килишнинг энг кулай усулини ишлаб чикиш Мед журн Узбекистана 1998; 89-91.
2. Грищенко В. И., Лобынцева Г. С., Вотякова И. А., Шерешков С. И. Гемопоэтические клетки эмбриональной печени. Киев Наук думка 1988; 192.
3. Мадаминов А.А., Мурадов Н.Н., Каримов У.Ш., Ик-рамов Б.А. Моделирование острой печеночной недостаточности. Современные аспекты медицины. Материалы 1-й конф. молодых ученых, посв. 600-летию Мирзо-Улугбека. Ташкент 1994; 13-14.
4. Суббота Н. П., Пашинский П. П., Розанова З. Д., Биологические свойства криоэкстрактов эмбриональных тканей. Пробл криобиол 1998; 3: 35-42.
5. Хаджибаев А.М., Уразметова М.Д., Мадаминов А.А. и др. Сравнительная оценка влияния аллогенных и ксеногенных изолированных гепатоцитов на иммунный статус крыс с острой печеночной недостаточностью. Вестн экстр мед 2011; 2: 48-51.
6. Bernal W., Auzinger G., Dhawan A., Wendon J. Acute liver failure. Lancet 2010; 376(9736): 190-201.
7. El-Karaksy H.M., El-Shabrawi M.M., Mohsen N.A. et al. Study of predictive value of pediatric risk of mortality (PRISM) score in children with end stage liver disease and fulminant hepatic failure. Ind J Pediatr 2011; 78 (3): 301-306.
8. Laleman W., Verbeke L., Meersseman P. et al. Acute-on-chronic liver failure: current concepts on definition, pathogenesis, clinical manifestations and potential therapeutic interventions. Exp Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 5(4):523-537.
9. Nguyen N.T., Vierling J.M. Acute liver failure. Curr Opin Organ Transplant 2011; 16(3): 289-296.
10.Teng Y., Wang Y., Li S. et al. Treatment of acute hepatic failure in mice by transplantation of mixed microencapsulation of rat hepatocytes and transgenic human fetal liver stromal cells. Tissue Eng Part C Methods 2010; 16(5): 1125-1134.
11.Touboul T, Vallier L, Weber A. Robust differentiation
of fetal hepatocytes from human embryonic stem cells and iPS // Med Sci (Paris). 2010; 26(12): 1061-1066.
12.Weibel E.R., Kistler G.S., Scherie W.R. Practical stereo-logical methods for morphometric cytology. J Cell Biol 1966; 30: 23-28.
13.Zhang L., Han F., Wu D. et al. Analysis of the clinical features of and responsive factors on the prognosis in patients with fulminant hepatic failure. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2010; 18(8): 614-617.
14.Zhou P., Lessa N., Estrada D.C. et al. Decellularized liver matrix as a carrier for the transplantation of human fetal and primary hepatocytes in mice. Liver Transpl 2011; 17(4): 418-427.
ЖИГАР ЕТИШМОВЧИЛИГИНИ КАМАЙТИРУВЧИ ВОСИТА СИФАТИДА ИНСОННИНГ ФЕТАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРИНИ ТАЛОК ИЧИГА ТРАНСПЛАНТАЦИЯСИНИНГ САМАРАДОРЛИГИНИ КАЛАМУШЛАРДА МОРФОФУНКЦИОНАЛ БА^ОЛАШ М.Д.Уразметова, Р.Ш.Мавлян-Ходжаев, А.А.Мадаминов, Р.К.Ахмедова, М.И.Абдукадырова, Ф.С.Юсупова
Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази
Ок хашаки каламушларда уткир жигар етишмовчи-лиги (УЖЕ) корин ичига бир марта суюклаштирилма-ган турт хлорли углерод юбориш йули билан чакири-либ, сунгра талок ичига инсоннинг фетал гепатоцитла-ри (ИФГ) трансплантация килинганда коннинг барча биохимик узгаришлари ижобий узгарганлиги кузатил-ди. УЖЕ модели булган каламушларнинг талок кунга-расига ИФГ юборилгандан сунг 14-21-кунлари жигар паренхимасида репаратив-тикланиш жараёнлари бошланади ва бу асосан гепатоцитларнинг гипертро-фияси ва гиперплазияси билан намоён булади. Жигар булакчалари орасидаги бириктирувчи тукимали тасмалар тажриба ни^оясига якин анча сурилади ва бу жигар структурасининг кисман тикланишига далолат беради. Гепатоцитлар ядроси улчамларининг каттала-шуви хамда узларининг гипертрофияси билан намоён булувчи жигар хужайраларининг полиплоидияси паренхима тикланишининг салмокли ва асосий омили эканлиги, бу эса ИФГнинг битиб кетишига аломат эканлиги курсатилган.
Контакт: проф. Уразметова Маиса Дмитриевна. РНЦЭМП, экспериментальный отдел. Ташкент 100107, ул. Фархадская, 2. Тел.: +99871-150-4384, E-mail: [email protected]
