CC BY
34
Оригинальная статья
Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpfl (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293
Павлова С.В.1 • Елисафенко Е.А.1 • Шаяхметова Л.Ш.1' 2 • Медведев С.П.1
Павлова Софья Викторовна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории эпигенетики развития1; ORCID: https:// orcid.org/0000-0003-1095-3692 * 630090, г. Новосибирск, ул. Мальцева, 1-16, Российская Федерация. Тел.: +7 (913) 903 13 62. E-mail: sonpavlova@gmail.com
Елисафенко Евгений Анатольевич -
канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории эпигенетики развития1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3204-8178. E-mail: antares@bionet.nsc.ru Шаяхметова Лилия Шагитовна -лаборант научно-образовательного отдела1; бакалавр2
Медведев Сергей Петрович - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории эпигенетики развития1; ORCID: https:// orcid.org/0000-0002-1520-5549
1 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»; 630090, г. Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 10, Российская Федерация
2 ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»; 630090,
г. Новосибирск, ул. Пирогова, 1, Российская Федерация
Актуальность. Создание инструментов редактирования генома эукариот на основе программируемых нуклеаз бактерий из систем CRISPR-Cas открывает обширные перспективы для разработки методов генной терапии, клеточных моделей заболеваний человека, а также изучения проявлений патологического фенотипа, наблюдения за клеточными процессами. От точности внесения двуцепочечных разрывов в целевые участки ДНК зависят безопасность и корректность экспериментов как на клеточном, так и организменном уровнях. Поиск новых вариантов более точных нуклеаз CRISPR-Cas и изучения их способности гидролизовать ДНК в составе нуклеосом in vivo представляется актуальной задачей развития технологий геномного редактирования. Цель - провести анализ активности программируемой нуклеазы AsCpfl (Casi 2a), обладающей низким уровнем нецелевой активности, в локусах генома человека, безопасных для внесения трансгенных конструкций (safe harbor), и сравнить с эффективностью широко применяемой нуклеазы SpCas9 в клетках линии HEK293.
Материал и методы. Выполнен биоинформационный анализ ассоциации целевых районов с нуклеосомами и другими белками в safe harbor локусах AAVS1 и GSH-Chi и транскрип-ционно неактивном гене MYBPC3 кардиального миозинсвязывающего белка 3 в клетках линии HEK293FT на основе данных, полученных методом ATAC-seq базы NCBI SRA для хроматина клеток линии HEK293FT. Проведено создание и внесение плазмидных конструкций, кодирующих нуклеазы SpCas9 и AsCpfl и направляющих РНК в клетки HEK293FT. Осуществлен анализ событий в целевых районах генома клеток линии HEK293FT методом изучения секвенограмм с помощью алгоритма TIDE.
Результаты. Изучение данных экспериментов ATAC-seq для клеток HEK293FT показало, что локус AAVS1 можно отнести к открытому хроматину с низкой плотностью нуклеосом, а локус GSH-Ch1 - к закрытому хроматину. В клетках HEK293FT ген кардиального белка MyBPc3 имеет промежуточные характеристики хроматина. Проведенное исследование эффективности внесения разрывов в изучаемые локусы хроматина клеток HEK293FT нуклеазами выявило, что SpCas9 справляется с хроматином любой плотности нуклеосом, тогда как AsCpfi эффективно вносит разрывы в ДНК только в локусах с открытым хроматином - AAVS1 и MYBPC3. В ло-кусе GSH-Ch1 с высокой плотностью нуклеосом события редактирования происходят на очень низком уровне.
Заключение. Показана низкая эффективность нуклеазы AsCpf1 в геномном safe harbor локу-се GSH-Ch1, который характеризуется высокой плотностью нуклеосом. При планировании эксперимента по геномному редактированию с помощью нуклеазы AsCpf1 следует учитывать эпигенетический ландшафт хроматина и плотность нуклеосом, а также использовать вещества, влияющие на структуру хроматина.
Ключевые слова: редактирование геномов, CRISPR-Cas нуклеазы SpCas9 и AsCpf1, направляющая РНК, нуклеосомы, открытый хроматин
Для цитирования: Павлова СВ, Елисафенко ЕА, Шаяхметова ЛШ, Медведев СП. Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpfl (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293. Альманах клинической медицины. 2021 ;49(6):385-395. doi: 10.18786/2072-0505-2021 -49-037.
Поступила 29.06.2021; принята к публикации 28.07.2021; опубликована онлайн 15.09.2021
С появлением эффективных методов редактирования нуклеотидных последовательностей такое направление биомедицины, как исследование функций генов и од-нонуклеотидных полиморфизмов при нормальной жизнедеятельности клетки и при патологиях, получило активное развитие [1, 2]. В 2007 г. у бактерий и архей была открыта система адаптивной защиты от вирусов и чужеродных молекул ДНК [3]. Геномы прокариот содержат элементы, состоящие из коротких прямых повторов ДНК, между которыми закодированы фрагменты бактериофагов или плазмид. Данные элементы были определены как короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR). Повторы CRISPR входят в функциональную единицу бактериального генома и содержат
Рис. 1. Схема строения комплекса SpCas9:sgRNA (А) и AsCpf1:crRNA (Б) в целевом районе ДНК, содержащем протоспейсер и PAM (мотив, смежный с протоспейсером)
Таблица 1. Позиции протоспейсеров целевых районов и векторов для экспрессии нуклеаз sgRNA и CRISPR-Cas
Локус; нуклеаза Позиция протоспейсера, сборка генома GRCh38/hg38 Вектор
AAVS1; Cas9 5'GTCACCAATCCTGTCCCTAGTGG-TGG-3'PAM chr19:55115745-55115764; PX458 Addgene#48138
AAVS1; Cpf1 PAM5'TTTC-GTCACCAATCCTGTCCCTAG3' chr19:55115744-55115764; pAsCpf1(TTTV)-2NLS "Addgene 69982/#89352
GSH-Ch1; Cas9 5'TATTATAATAGAAGTGCCTG-AGG-3' PAM chr1:189847623-189847642; PX458 Addgene#48138
GSH-Ch1; Cpf1 PAM5'-TTTA-TACAGTTGCCTTACAAAGACA3' chr1:189847581-189847601; - pAsCpf1(TTTV)-2NLS "Addgene 69982/#89352
MYBPC3; Cas9 5'ACACCACCTGATCATCAACG-AGG-3' PAM chr11:47342656-47342675 PX458 Addgene#48138
MYBPC3; Cpf1 PAM 5'TTCA-AGAAGGACGGGCAGAGACACC chr11:47342671-47342691; pAsCpf1(TYCV)(BB) Addgene#89352
"Addgene 69982 - прототип плазмиды pAsCpf1(TTTV)-2NLS, куда был добавлен мотив 2NLS из плаз-миды Addgene #89352
гены Cas (CRISPR associated), кодирующие белки, необходимые для разрезания ДНК [4, 5]. При попадании «знакомого» вируса в бактерию происходит синтез РНК (англ. ^RNA, CRISPR RNA) по матрице ДНК из «коллекции» вирусных фрагментов, закодированных в районе CRISPR, и ^RNA адресно (по принципу комплементарности между ^RNA и участком ДНК в геноме вируса) направляет нуклеазы Cas для уничтожения вирусной ДНК. Наличие элементов CRISPR в геномах различных бактерий говорит об эволюционно-кон-сервативном принципе РНК-опосредованной деградации инвазивных ДНК, однако механизмы функционирования иммунитета могут иметь различия. Например, если для деградации инва-зивных ДНК необходимо несколько белков Cas, система CRISPR-Cas относится к 1-му классу (подразделяется на I, III и IV типы), а если эту функцию выполняет один белок - ко 2-му (II, V и VI типы) [6]. Имеются также различия в механизмах формирования направляющих ^RNA для нуклеаз Cas у разных бактерий. В системе CRISPR-Cas9 бактерий Streptococcus pyogenes (класс 2, тип II) специфическая направляющая crRNA взаимодействует с ^оРНК (trans-activating crRNA), а в инвазивном геноме, в месте узнавания (протоспейсер, комплементарный crRNA), должен присутствовать смежный мотив ДНК PAM (Protospacer Adjacent Motif) с консенсусом 5'-NGG-3' [7, 8] (рис. 1А). Именно система CRISPR-Cas9 бактерий S. pyogenes послужила основой для создания в 2012 г. инструментов редактирования геномов эукариот - были добавлены сигналы ядерной локализации в белок SpCas9 (S. pyogenes Cas9), проведена оптимизация кодо-нов гена SpCas9 для экспрессии в эукариотических клетках, а tracrRNA и crRNA для удобства были объединены в одну молекулу РНК - single guide RNA (sgRNA) [1, 2].
Благодаря относительной простоте устройства и высокой эффективности работы систему CRISPR-SpCas9 активно применяют для редактирования геномов на самых разных модельных объектах - от микроорганизмов до культивируемых клеток человека, включая плюрипотентные стволовые клетки. Основным недостатком данной системы следует признать высокую вероятность ошибочного разрезания ДНК нуклеазой SpCas9 в похожих на протоспейсер участках генома. С этой проблемой исследователи борются разными путями, например, создавая мутантные формы белка SpCas9 или изучая разнообразие бактериальных систем CRISPR-Cas для поиска новых нуклеаз Cas [9]. Так, было обнаружено, что нуклеаза из Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1) (CRISPR-Cas12a, 2-й класс, тип V)
55,092,500 55.095 Mbp 55.097 Mbp 55.1 Mbp 55,102,500 55.105 Mbp 55,107,500 55.11 Mbp 55,112,500
AsCpf1/SpCas9 протоспейсер
55.115 Mbp 55,117,500 55.12 Mbp
Щ MIR7975 precursor RNA-<
III! I
Энхансеры
AsCpfl ( > SpCas9 (
Протоспейсер
Рис. 2. Схема локуса ААУБ1 человека, локализованного на 19-й хромосоме (позиция 19д13.42, идеограмма 19-й хромосомы). Ниже расположена схема района (200 т.п.о.), содержащего сайт интеграции аденоассоциированных вирусов (позиция протоспейсеров для нуклеаз АБСрЛ и БрСа$9). Гены изображены зелеными стрелками, отражающими направление транскрипции (А). Экзон-интронная структура гена РРРШ12С представлена на Б. Позиция протоспейсера в интроне 1 отмечена синим столбиком, экзоны - красные треугольники. Энхансеры обозначены желтыми прямоугольниками, потенциальный промотор -красный прямоугольник. Пример картирования прочтений фрагментов ДНК эксперимента АТАС-Бвд для клеток ИЕК293РТ (БКК9602331, см. раздел «Материал и методы») показан на В. Голубым цветом обозначена плотность прочтений (диапазон представлен числом прочтений, картированных на референсную последовательность локуса ААУБ1, - от 1 до 139). Серые стрелки - позиции протоспейсеров АБСрЛ и БрСа$9, прямоугольники - последовательности ДНК данного района, свободные от белков и выявляемые методом АТАС-Бвд
более точная и имеет более низкий уровень нецелевой активности по сравнению с СаБ9 [10-12]. Нуклеаза АБСрА использует одну короткую направляющую РНК (около 40 нуклеотидов длиной), а также Т-богатый РАМ с консенсусом 5'-ТТТУ-3' (V = А, в или С). Поскольку в геномах большинства организмов данное сочетание нуклеотидов встречается с низкой частотой, были созданы мутантные формы АБСрА, узнающие консенсусы РАМ 5'-ТУС^3' и 5'-ТАТ^3'. Для трех форм АБСрА частота встречаемости возможных мишеней в кодирующей части генома человека составляет 1 сайт на 11 пар нуклеотидов [13]. При гидролизе нуклеазой АБСрА образуются выступающие «липкие» концы ДНК, а сам разрез располагается в отдалении от РАМ (рис. 1Б). В совокупности это делает систему СШ8РЯ-СрА крайне привлекательным инструментом редактирования геномов,
в частности для создания изогенных клеточных моделей наследственных заболеваний.
Для разработки методов генной терапии, создания клеточных моделей заболеваний человека и изучения проявлений патологического фенотипа на молекулярном уровне часто возникает необходимость проведения модификации генома вставками функциональных трансгенов или генетических элементов. Генную терапию на основе ретро- и аденовирусных векторов ранее применяли для лечения некоторых болезней, связанных с метаболическими или гематологическими нарушениями [14-16]. Однако при использовании ретро- и лентивирусных векторов происходит неконтролируемая интеграция вирусов в случайные места генома, что может приводить к инсерцион-ному мутагенезу. Открытие систем редактирования СШЗРЯ-СаБ позволяет использовать определенные
Павлова С.В., Елисафенко Е.А., ШаяхметоваЛ.Ш., Медведев С.П.
Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpf1 (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293
1,400 1,600 1,800 2,000 2,200 2,400 2,600 2,800 3,000 3,200
Repeat region Repeattegion as9 протоспейсер
Рис. 3. Схема локуса СБИ-СЫ человека, локализованного на 1-й хромосоме (позиция 1^31.1, идеограмма 1-й хромосомы). Ниже расположена схема района (200 т.п.о.), позиция протоспейсеров для нуклеаз АБСрП и БрСа$9 отмечена синим столбиком. Зеленой стрелкой обозначен ген длинной некодирующей РНК L¡NC0^70^ (А). Пример картирования прочтений фрагментов ДНК эксперимента АТАС-Бвд для клеток ИЕК293РТ (БКК9602331, см. раздел «Материал и методы») дан на Б. Голубым цветом обозначена плотность прочтений (число прочтений, картированных на референсную последовательность локуса СБИ-СЫ, -от 1 до 4). Серые стрелки - позиции протоспейсеров АБСрП и БрСа$9, прямоугольники - последовательности ДНК данного района, свободные от белков и выявляемые методом АТАС-Бвд. Повторы ДНК представлены желтыми прямоугольниками
Таблица 2. Праймеры для амплификации целевых районов ДНК с целью анализа нуклеазной активности БрСа$9 и АБСрП
Название праймера Структура праймера Температура отжига праймера; размер ПЦР продукта Целевой район амплификации ДНК
AAVS1_WT-F AAVS1_WT-R 5'CTCTGGCTCCATCGTAAGCAA3' 5'CCCAAAGTACCCCGTCTCCC3' 58C 555 п.о. Локус AAVS1
1Chr-SHL-T-F 1Chr-SHL-T-R 5'GGTAGTGCAGAGAGCTAACATG3' 5'GTCTAACTATGACAGTGCTGCC3' 58C 490 п.о. Локус SH-Chr1
MYBPC3-LD-F MYBPC3-R 5'CAAATGGTGAGTTCCAGAAGC3' 5'GAGATGAGAAGGATGAGGTTTAGG3' 58C 405 п.о. Ген MYBPC3
ПЦР - полимеразная цепная реакция
места генома, где взаимное влияние внесенных генетических конструкций и хозяйского генома минимально, - так называемые genome safe harbor (GSH) локусы. Наиболее популярное место для интеграции трансгенов в геном человека - локус AAVS1 (adeno-associated virus integration site 1) на 19-й хромосоме (19q13.42), в первом интроне гена PPP1R12C (protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), который кодирует белок, регулирующий активность фосфатазы 10 [17] (рис. 2А).
Локус AAVS1 был выявлен экспериментально при анализе сайтов интеграции аденоассоцииро-ванных вирусов в ДНК клеток человека in vitro. Примечательно, что нарушение одного или двух
аллелей этого гена не приводит к отклонениям ни на уровне культуры клеток, ни на уровне целого организма, хотя PPP1R12C экспрессируется во всех тканях [17]. Тем не менее следует учитывать, что данный район 19-й хромосомы не может быть безопасным локусом safe harbor, так как обогащен кодирующими генами, в том числе там находится ген PTPRH (protein tyrosine phosphatase receptor type H), мутации в котором ассоциированы с раком печени (см. рис. 2А), и внесение чужеродных генетических элементов в данный локус потенциально может приводить к непредсказуемым событиям. Были сформулированы критерии для «идеальных» GSH-локусов: расстояние > 50 т.п.о.
Таблица 3. Покрытие прочтений ДНК в целевых районах генома клеток НЕК293, выявляемых в экспериментах АТАС^ея, в процентном соотношении от данных референсного гена АСТВ
ATAC-seq SRR6418076 HEK293 SRR8938025 HEK293 SRR9602331 HEK293 SRR10982335 Кардиомиоциты из ИПСК человека SRR12503731 Кардиомиоциты из ИПСК человека Исследуемый район (позиции в геноме, сборка hg38)
Покрытие ACTB, % 100 100 100 100 100 chr7 5,527,748-5,529,657 (1910 п.о.)
Покрытие GSH-Chl, % 8,2 3,9 3,55 56,5 59,6 chr1 189847081-189848101 (1000 п.о.)
Покрытие MYBPC3, % 27,1 6,6 11,9 11,9 50,0 chr11 47342156-47343175 (1000 п.о.)
Покрытие AAVS1, % 68,9 23,3 31,0 33,8 33,3 chr19 55115245-55116264 (1000 п.о.)
ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
от 5'-конца любого гена, более 300 т.п.о. от генов, ассоциированных с раком и любой микроРНК, удаленность от ультраконсервативных регионов генома. Таким идеальным кандидатом, отвечающим всем критериям, считается локус GSH-Ch1 (genomic safe harbor chromosome 1) (позиции 189847581-189847601, район 1q31.1 1-й хромосомы человека) [17, 18] (рис. 3А).
Системы CRISPR-Cas представляют собой «изобретение» бактерий для борьбы с вирусной ДНК, которая не образует регулярные комплексы с белками, тогда как в клетках эукариот ДНК присутствует в составе нуклеосом и других структурных белков хроматина. В экспериментах in vitro показано, что нуклеосомы действительно препятствуют гидролизу ДНК нуклеазами SpCas9 [19] и AsCpf1 (Cas12a) [20]. При этом in vivo SpCas9 справляется с хроматином любой плотности и доступности [21]. Для нуклеазы AsCpf1 этот аспект недостаточно изучен. В данном исследовании мы провели биоинформационный анализ уровня открытости хроматина в safe harbor локусах AAVS1 и GSH-Ch1 и транскрипционно неактивном гене MYBPC3 кардиального миозинсвязывающего белка 3 в клетках линии HEK293FT, а также оценили нуклеазную активность белков SpCas9 и AsCpf1 in vivo.
Материал и методы
Получение генетических конструкций, экспрессирующих компоненты системы CRISPR-Cas Дизайн протоспейсеров для синтеза направляющих РНК нуклеаз SpCas9 и AsCpf1 выполняли с помощью ресурсов Benchling (https://www. benchling.com). Олигонуклеотиды были синтезированы компанией «Биоссет» (Россия) и клонированы в соответствующие плазмиды, кодирующие
sgRNA и нуклеазы SpCas9 (pX458) и AsCpfl (pAsCpf1(TYCV)(BB), p AsCpfl-2NLS) в соответствии с протоколом [22] (табл. 1). Плазмида pAsCpf1(TTTV)-2NLS была сконструирована в лаборатории на основе AsCpfl (TTTV) путем добавления второго сайта ядерной локализации NLS.
Анализ эффективности редактирования CRISPR-Cas на клетках HEK293FT
Доставку плазмидных конструкций в клетки линии HEK293FT (cat. R70007 Thermo Fisher Scientific) проводили с помощью электропора-ции на приборе Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific) согласно рекомендациям производителя. Клетки линии HEK293FT культивировали при 5% CO2, 37 °С, в ростовой среде DMEM/ F12 (Gibco), 10% фетальной бычьей сыворотке (Life Technologies), 2 мМ GlutaMax (Thermo Fisher Scientific), 100 ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина (Life Technologies), 0,1 мМ раствора аминокислот NEAA (Invitrogen). Перед экспериментом клетки диссоциировали реагентом TrypLE, центрифугировали в фосфатном буфере PBS в течение 5 минут (300 g) и ресуспендирова-ли в буфере R (Neon Transfection System 10ul kit, Thermo Fisher Scientific) из расчета конечной концентрации 5 x 107/мл. Реакцию электропора-ции 0,5 мкг плазмиды, кодирующей компоненты CRISPR-Cas, проводили в 10 мкл суспензии клеток в буфере R. После электропорации клетки переносили в подготовленные культуральные планшеты с теплой средой без антибиотика. Через 48 часов после трансфекции из клеток выделяли геномную ДНК и амплифицировали целевой участок, содержащий сайт CRISPR-индуцируемого разрыва, со специфических праймеров (табл. 2). Полученный продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Павлова С.В., Елисафенко Е.А, ШаяхметоваЛ.Ш., Медведев С.П.
Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpfl (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293
Рис. 4. Пример картирования прочтений фрагментов ДНК эксперимента ATAC-seq для клеток HEK293FT (SRR9602331, см. раздел «Материал и методы») на ген MYBPC3. Голубым цветом обозначена плотность прочтений (диапазон представлен числом прочтений, картированных на референсную последовательность гена MYBPC3, - от 1 до 23). Серые стрелки - позиции протоспейсеров AsCpfl и SpCas9, прямоугольники - последовательности ДНК данного района, свободные от белков и выявляемые методом ATAC-seq. Красные стрелки - экзоны гена, желтые - экзоны, кодирующие белок
очищали методом элюции из агарозного геля с помощью набора Cleanup Standard (Евроген). Реакции секвенирования по методу Сэнгера проводили с применением набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific). Продукты реакции секвенирования анализировали в Центре коллективного пользования «Геномика» СО РАН.
Общую эффективность CRISPR-Cas9 оценивали по доле модифицированных последовательностей ДНК, образовавшихся в результате негомологичного сшивания концов, выявляемых при анализе секвенограмм с помощью программного алгоритма TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) (https://tide.nki.nl).
Анализ открытости хроматина в целевых районах генома клеток HEK293FT
Последовательности локусов были экстрагированы из GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore): AP023479.1:55589039-55593668 Homo sapiens DNA, chromosome 19, AL591504.5:14265-18238 Human DNA sequence from clone RP11-445J9 on chromosome 1. Анализ открытости хроматина в клетках HEK293FT проводили на основе данных из базы NCBI SRA (Sequence Read Archive; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), полученных методом ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) [23]. Использовали данные экспериментов ATAC-seq для клеток HEK293FT SRR6418076, SRR8938025, SRR9602331 и для кардиомиоцитов человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) SRR10982335, SRR12503731. Данные экспериментов ATAC-seq картировали относительно референсных последовательностей ДНК с использованием программы HISAT2 [24]. Результирующие файлы в формате SAM визуализировали и проводили первичный анализ
с использованием программного обеспечения Geneious 11.0.2 (http://www.geneious.com) [25]. Участки, содержащие повторы ДНК, исключали из анализа с помощью программы RepeatMasker [26].
Результаты
Для исследования программируемых нукле-аз SpCas9 и AsCpf1 (Cas12a) в safe harbor локу-сах генома клеток линии HEK293 были выбраны протоспейсеры для локуса AAVS1 в районе hg38 chr19:55115745-55115764 (интрон гена PPP1R12C) (см. рис. 1А) [27] и для локуса GSH-Ch1 в позиции hg38 chr 1:189847581-189847601 (см. рис. 2А) [28]. Дополнительно для изучения активности нуклеаз в транскрипционно неактивном хроматине был выбран ген кардиального миозинсвязы-вающего белка cMyBP-C, который не экспресси-руется в клетках HEK293FT (протоспейсер hg38 chr11:47342656-47342675) (рис. 4).
Предварительно проводили оценку степени ассоциации целевых районов с нуклеосомами и другими белками с помощью анализа данных, полученных методом ATAC-seq базы NCBI SRA для хроматина клеток линии HEK293FT и карди-омиоцитов. Метод ATAC-seq выявляет доступные участки ДНК в составе хроматина с помощью гиперактивной мутантной формы транспозазы Tn5, которая интегрирует линкеры ДНК в открытые участки генома. Фрагменты генома, содержащие линкеры, очищают, амплифицируют с помощью ПЦР, после чего определяют последовательность ДНК с помощью секвенирования нового поколения (Illumina). На основании анализа прочтений ДНК можно выявить открытые участки хроматина, сайты связывания транскрипционных факторов, а также позиции нуклеосом. Чем более открыт хроматин, тем больше прочтений ДНК приходится на соответствующий участок генома [29, 30].
А
Редактирование генома с помощью CRISPR-Cas
|ида ^ Cas
QFp ^^J 1. Трансфекция
gRNA \
N -m
А О ^ V
Клетка gRNA
f 2. Транскрипция
Cas-mRNA
^^^^ 3. Трансляция г J + сборка/
Ядро ЛТ
ч Sw
4. ДНК-мишень
Выделение ДНК, анализ ПЦР
Ceквeнированиe по Сэнгеру
«ATAAAÍAAAGCCICllGlCTlT ТА ЩВ .
Д и
Анализ секвенограммы с помощью алгоритма TIDE
total eft. = 51,1 % _ „
15,8 ,р£°
П'8 Ю „
lI.I_.II_.
Kлетки HEK293FT, pX458
■ 5 0 5
^Делеции Инсерции^
Рис. 5. Схема эксперимента. А - плазмиды, кодирующие компоненты систем CRISPR-SpCas9 и CRISPR-AsCpfl, трансфицировали в клетки HEK293FT. In vivo в ядрах клеток происходила транскрипция ДНК плазмиды и синтез направляющей РНК (gRNA), мРНК нуклеаз Cas (Cas-mRNA) и флуоресцентного белка GFP. В цитоплазме происходила трансляция мРНК и сборка комплексов CRISPR-Cas:gRNA, которые перемещались в ядро и вносили двуцепочечные разрывы в ДНК целевых районов (ДНК-мишень). По наличию сигнала белка GFP, закодированного в плазмиде pX458, определяли уровень трансфекции плазмид в клетки линии HEK293FT. Б - выделяли ДНК клеток линии HEK293FT, амплифицировали целевой район методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), определяли последовательность нуклеотидов ДНК по Сэнгеру и анализировали секвенограммы при помощи алгоритма TIDE
В данном исследовании мы оценили количество прочтений ДНК (плотность покрытия) в локусах AAVS1, 08И-СЬ1 и гене МУБРС3 в аннотируемых экспериментах ATAC-seq, проведенных на клетках ИЕК293 (3 варианта) и кардиомиоцитах, полученных из ИПСК (2 варианта). Полученные данные для каждого эксперимента нормировали на
плотность покрытия, выявляемую для хроматина кодирующей области гена домашнего хозяйства АСТВ (Ье1а-аСш). Из данных табл. 3 видно, что в клетках ИЕК293 локус GSH-Ch1, вероятнее всего, относится к закрытому хроматину, поскольку плотность прочтений ДНК составляет в среднем 5% от плотности прочтений, картируемых в гене
5
SpCas9
total eff. = 51.1
"■8 Ю „
..Ll_.lL
^Делеции Инсерции^
AsCpfl
total eff. = 23,4 %
■___h .
-5 0 5
4-Делеции Инсерции^
А
* SpCas?
g o total eff. = U.2 %
tí — ! „
39,2
P> o.ooi ^ S
■ ■ I I I ■ ■
0 -5 0 5 11
4-Делеции Инсерции^
AsCpfl
total eff. = 7,2%
4-Делеции Инсерции^
Б
SpCas?
total eft. = 57,7%
51,2 37.9 H
I
a 5
^Делеции Инсерции^
AsCpfl
total eff. = 18.2 Я
^Делеции Инсерции^
В
Рис. 6. Результаты анализа секвенограмм целевых районов ДНК локусов AAVS1 (А), GSH-Chl (Б), MYBPC3 (В) клеток линии HEK293FT после внесения плазмид, кодирующих компоненты CRISPR-SpCas9 и CRISPR-AsCpfl, с помощью алгоритма TIDE. На оси абсцисс в нуле показано отсутствие событий редактирования, слева от нуля отложены делеции, справа от нуля - инсерции, цифрами указано, сколько нуклеотидов удалено или вставлено. По оси ординат отложен процент выявленных событий
Павлова С.В., Елисафенко Е.А., ШаяхметоваЛ.Ш., Медведев С.П.
Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpfl (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293
домашнего хозяйства ACTB, хроматин которого мы считаем открытым. Разброс значений покрытия прочтений ДНК для локуса AAVS1 составляет от 23,3 до 68,9% относительно гена ACTB.
Наряду с этим в локусе AAVS1 (интрон 1 гена PPP1R12C) с помощью программы BLAT (http:// genome.ucsc.edu) были выявлены потенциальные сайты регуляторных элементов cCREs (candidate cis-Regulatory Elements), а именно потенциальные энхансеры (см. рис. 2Б). Элементы cCREs выявляются в районах открытого хроматина (свободного от нуклеосом), гиперчувствительных к ДНКазе 1 (см. рис. 2Б, В). Таким образом, можно считать, что район AAVS1, в котором расположен протоспей-сер в клетках HEK293, содержит открытый хроматин, доступный для связывания белков комплекса CRISPR-Cas, а район safe harbor на первой хромосоме GSH-Ch1 - закрытый хроматин, который может быть проблемным для активности AsCpf1. Ген MYBPС3 неактивен в клетках HEK293, однако значения покрытия прочтений ДНК в экспериментах ATAC-seq в этом случае варьируют от 6,6 до 27,1% относительно гена домашнего хозяйства ACTB. Мы оценили плотность прочтений в экспериментах ATAC-seq, проведенных на кардиомиоцитах, полученных из ИПСК, в гене MYBPС3, который экспрессируется в клетках. Анализ данных показывает, что транскрипционно активный ген MYBPC3 действительно приобретает черты открытого хроматина. Интересно, что хроматин локуса GSH-Ch1 в кардиомиоцитах также становится открытым в отличие от HEK293 (см. табл. 3).
Примеры картирования прочтений в исследуемых районах клеток HEK293FT даны на рис. 2В (локус AAVS1), 3Б (локус GSH-Ch1), 4 (ген MYBPC3).
Протоспейсеры для нуклеаз SpCas9 и AsCpf1 были клонированы в соответствующие плазмиды (см. табл. 2), и с помощью электропорации проведена доставка кодирующих конструкций в клетки HEK293FT. Уровень трансфекции оценивали по флуоресценции белка EGFP, который присутствует в плазмиде pX458, кодирующей белок SpCas9 и направляющей sgRNA (доставка конструкции происходила в 70% клеток). Уровень доставки плазмид, кодирующих компоненты CRISPR-AsCpf1, считали таким же. Далее геномную ДНК выделяли спустя 48 часов после трансфекции, целевые районы амплифицировали и секвенировали. Полученные данные секвенограмм были проанализированы с помощью алгоритма TIDE (рис. 5). Программа статистически оценивает вероятность присутствия делеций и инсерций, появившихся в районе протоспейсера после негомологичной репарации разрывов ДНК, и представляет результаты в виде
диаграмм, на которых можно оценить степень активности системы CRISPR-Cas в целевом районе.
Как и ожидалось, в локусе AAVS1 нуклеазы SpCas9 и AsCpf1 эффективно взаимодействовали с хроматином (рис. 6А). По данным программы TIDE, общая эффективность редактирования составляла 51,1% для SpCas9 и 23,6% для AsCpf1. В локусе GSH-Ch1 была активна исключительно SpCas9 (46,2%), в то время как нуклеаза AsCpf1 вносила разрывы в хроматин с очень низкой эффективностью - 7,2% (рис. 6Б). В целевом районе гена MYBPC3 эффективность редактирования для SpCas9 была равна 57,7%, для AsCpf1 - 18,2% (рис. 6В).
Обсуждение и заключение
Открытие программированных нуклеаз CRISPR-Cas и создание на их основе инструментов редактирования генома эукариот позволяют эффективно изучать мутации и создавать модели для изучения наследственных заболеваний. Для безопасного и эффективного трансгенеза в геноме человека выявлены специальные GSH-локусы. С целью уменьшения вероятности ошибок редактирования подбирают более точные нукле-азы Cas, оценивают разные аспекты - частоту встречаемости PAM, эффективность нуклеазной активности в различных районах хроматина. Система редактирования CRISPR-Cas была создана на основе механизмов иммунитета бактерий, основанного на специфическом узнавании и расщеплении ДНК вирусов и не была адаптирована для расщепления ДНК в составе нуклеосом, которые служат структурной единицей хроматина эукариот. Участки ДНК, свободные от нуклеосом эукариот (так называемый открытый хроматин), встречаются в промоторах и энхансерах генов -сайтах связывания транскрипционных факторов или регуляторных белков. Открытый хроматин также присутствует в экзонах и интронах активно транскрибируемых генов [31]. Участки ДНК, свободные от нуклеосом, в активных генах образуются в результате динамического процесса взаимодействия ДНК и белков нуклеосом (октамера гистонов 2хН2А, 2хН2В, 2хН3 и 2хН4), так называемого дыхания нуклеосом за счет привлечения белков ремоделирования хроматина. Данные белки узнают активные модификации гистонов и способствуют уменьшению сродства между ДНК и гистонами, за счет чего ДНК чаще остается свободной от нуклеосом. Эпигенетические модификации гистонов активного хроматина (например, ацетилированный лизин гисто-на H3 (H3K9ac, H3K27ac) в положении 9 или 27,
ди- и триметилированный лизин гистона H3 (H3K4me2-me3) в положении 4 и др.) считаются маркерами открытого хроматина [31, 32].
Современным, доступным и чувствительным методом полногеномного анализа участков ДНК, свободных от нуклеосом, считается анализ ATAC-seq. Данные, полученные ранее с помощью других методов исследования структуры хроматина, -DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing -анализ гиперчувствительных к расщеплению ДНКазой районов генома), MNase-seq (Micrococcal Nuclease digestion with deep sequencing - анализ участков, чувствительных к микрококковой ну-клеазе), ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing - анализ ДНК-белковых взаимодействий, основанный на иммунопреципитации хроматина для анализа распределения модифицированных гистонов) - полностью согласуются с результатами ATAC-seq. С помощью метода ATAC-seq можно выявлять области открытого хроматина, уточнять позиции нуклеосом или сайтов связывания регуляторных элементов с высокой точностью [23, 30, 33].
Мы исследовали нуклеазную активность SpCas9 и AsCpf1 в клетках HEK293FT в safe harbor локусах на 19-й хромосоме (AAVS1) и на 1-й хромосоме (GSH-Ch1). Изучение данных экспериментов ATAC-seq для клеток HEK293FT показало, что локус AAVS1 можно отнести к открытому хроматину, а локус GSH-Ch1 - к закрытому. Ген кардиального белка MyBPc3 в клетках HEK293FT имеет промежуточные характеристики хроматина. Проведенное исследование эффективности
внесения разрывов в исследуемые локусы хроматина клеток HEK293FT нуклеазами позволило обнаружить, что SpCas9 справляется с хроматином любой плотности, тогда как AsCpfl эффективно вносит разрывы в ДНК только в локусах с открытым хроматином - AAVS1 и MYBPC3. В локусе с закрытым хроматином GSH-Chl события редактирования в данном случае происходят на очень низком уровне.
Как было показано нами в данной работе, а также другими исследователями, на нуклеазную активность SpCas9 in vivo структура хроматина не оказывает влияния [21]. Обнаруженная низкая активность AsCpfl в GSH-Chl может быть свидетельством того, что плотный хроматин данного локуса в клетках HEK293FT препятствует внесению разрывов в ДНК данной нуклеазой in vivo. Существует специфический паттерн распределения нуклеосом в целевых районах в разных типах клеток. Анализируя эксперименты ATAC-seq, проведенные на кардиомиоцитах, дифференцированных из ИПСК, мы обнаружили, что MYBPC3 хроматина становится более открытым не только в транскрипционном активном гене, но и в локусе GSH-Chl.
Таким образом, чтобы использовать для редактирования более точную программируемую ну-клеазу AsCpfl, следует тщательно выбирать район протоспейсера, учитывая эпигенетический ландшафт хроматина и степень его открытости в разных типах клеток, либо применять в эксперименте вещества и условия культивирования клеток, влияющие на структуру хроматина. <$>
Дополнительная информация
Финансирование
Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц. Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Участие авторов
С.В. Павлова - дизайн и проведение экспериментальной части исследования, интерпретация результатов, написание текста; Е.А. Елисафенко - проведение биоинформатического анализа данных, анализ результатов исследования, редактирование текста
статьи; Л.Ш. Шаяхметова - проведение экспериментальной части исследования, редактирование рукописи; С.П. Медведев - концепция и дизайн исследования, интерпретация результатов, написание текста, утверждение итогового варианта текста рукописи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы. Благодарности
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований и Новосибирской областью, номер проекта 19-44-540002 р_а. Бюджетный проект 0259-2021-0011.
Литература / References
1. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, Di-Carlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121 ):823-826. doi: 10.1126/ science.1232033.
2. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121): 819-823. doi: 10.1126/science.1231143.
3. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315(5819):1709-1712. doi: 10.1126/science.1138140.
Павлова С.В., Елисафенко Е.А, ШаяхметоваЛ.Ш., Медведев С.П.
Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpf1 (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293
4. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol Microbiol. 2000;36( 1 ):244-246. doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x.
5. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 2005;60(2): 174-182. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3.
6. Koonin EV, Makarova KS, Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr Opin Microbiol. 2017;37:67-78. doi: 10.1016/j.mib.2017.05.008.
7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doud-na JA, Charpentier E. A programmable du-al-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096): 816-821. doi: 10.1126/science.1225829.
8. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213): 1258096. doi: 10.1126/science.1258096.
9. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleas-es in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9): 822-826. doi: 10.1038/nbt.2623.
10. Kleinstiver BP, Tsai SQ, Prew MS, Nguyen NT, Welch MM, Lopez JM, McCaw ZR, Aryee MJ, Joung JK. Genome-wide specificities of CRIS-PR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8):869-874. doi: 10.1038/ nbt.3620.
11. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletz-bichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRIS-PR-Cas system. Cell. 2015;163(3):759-771. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038.
12. Kim D, Kim J, Hur JK, Been KW, Yoon SH, Kim JS. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8):863-868. doi: 10.1038/ nbt.3609.
13. Gao L, Cox DBT, Yan WX, Manteiga JC, Schneider MW, Yamano T, Nishimasu H, Nureki O, Crosetto N, Zhang F. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities. Nat Biotechnol. 2017;35(8):789-792. doi: 10.1038/nbt.3900.
14. Rivière I, Dunbar CE, Sadelain M. Hematopoi-etic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 2012;119(5):1107-1116. doi: 10.1182/ blood-2011-09-349993.
15. Gaspar HB, Cooray S, Gilmour KC, Parsley KL, Zhang F, Adams S, Bjorkegren E, Bayford J, Brown L, Davies EG, Veys P, Fairbanks L, Bordon V, Petropoulou T, Kinnon C, Thrasher AJ.
Hematopoietic stem cell gene therapy for adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency leads to long-term immunological recovery and metabolic correction. Sci Transl Med. 2011;3(97):97ra80. doi: 10.1126/scitranslmed.3002716.
16. Cartier N, Hacein-Bey-Abina S, Bartholo-mae CC, Veres G, Schmidt M, Kutschera I, Vidaud M, Abel U, Dal-Cortivo L, Caccavel-li L, Mahlaoui N, Kiermer V, Mittelstaedt D, Bellesme C, Lahlou N, Lefrere F, Blanche S, Audit M, Payen E, Leboulch P, l'Homme B, Bougneres P, Von Kalle C, Fischer A, Cavazza-na-Calvo M, Aubourg P. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 2009;326(5954):818-823. doi: 10.1126/sci-ence.1171242.
17. Sadelain M, Papapetrou EP, Bushman FD. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nat Rev Cancer. 2011 ;12( 1): 51-58. doi: 10.1038/nrc3179.
18. Pellenz S, Phelps M, Tang W, Hovde BT, Sinit RB, Fu W, Li H, Chen E, Monnat RJ Jr. New Human Chromosomal Sites with "Safe Harbor" Potential for Targeted Transgene Insertion. Hum Gene Ther. 2019;30(7):814-828. doi: 10.1089/ hum.2018.169.
19. Horlbeck MA, Witkowsky LB, Guglielmi B, Replogle JM, Gilbert LA, Villalta JE, Torigoe SE, Tjian R, Weissman JS. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. Elife. 2016;5:e12677. doi: 10.7554/eLife.12677.
20. Strohkendl I, Saifuddin FA, Gibson BA, Rosen MK, Russell R, Finkelstein IJ. Inhibition of CRISPR-Cas12a DNA targeting by nucleosomes and chromatin. Sci Adv. 2021;7(11):eabd6030. doi: 10.1126/sciadv.abd6030.
21. Barkal AA, Srinivasan S, Hashimoto T, Gifford DK, Sherwood RI. Cas9 Functionally Opens Chromatin. PLoS One. 2016;11(3):e0152683. doi: 10.1371/journal.pone.0152683.
22. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRIS-PR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11):2281-2308. doi: 10.1038/nprot.2013.143.
23. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chro-matin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 2013;10(12):1213-1218. doi: 10.1038/ nmeth.2688.
24. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 2015;12(4):357-360. doi: 10.1038/nmeth.3317.
25. Kearse M, Moir R, Wilson A, Stones-Havas S, Cheung M, Sturrock S, Buxton S, Cooper A, Markowitz S, Duran C, Thierer T, Ashton B, Meintjes P, Drummond A. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics. 2012;28(12): 1647-1649. doi: 10.1093/bioinformatics/ bts199.
26. Smit AFA, Hubley R, Green P. RepeatMasker 0pen-4.0. 2013-2015. Available from: http:// www.repeatmasker.org.
27. Ustyantseva EI, Medvedev SP, Vetchinova AS, Minina JM, Illarioshkin SN, Zakian SM. A Platform for Studying Neurodegeneration Mechanisms Using Genetically Encoded Biosensors. Biochemistry (Mosc). 2019;84(3):299-309. doi: 10.1134/S000629791903012X.
28. Kimura Y, Shofuda T, Higuchi Y, Nagamori I, Oda M, Nakamori M, Onodera M, Kanemat-su D, Yamamoto A, Katsuma A, Suemizu H, Nakano T, Kanemura Y, Mochizuki H. Human Genomic Safe Harbors and the Suicide Gene-Based Safeguard System for iPSC-Based Cell Therapy. Stem Cells Transl Med. 2019;8(7): 627-638. doi: 10.1002/sctm.18-0039.
29. Schep AN, Buenrostro JD, Denny SK, Schwartz K, Sherlock G, Greenleaf WJ. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Res. 2015;25(11 ):1757-1770. doi: 10.1101/ gr.192294.115.
30. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: A Method for Assaying Chroma-tin Accessibility Genome-Wide. Curr Pro-toc Mol Biol. 2015;109:21.29.1-21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109.
31. Boyle AP, Davis S, Shulha HP, Meltzer P, Mar-gulies EH, Weng Z, Furey TS, Crawford GE. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 2008;132(2):311-322. doi: 10.1016/j. cell.2007.12.014.
32. Igolkina AA, Zinkevich A, Karandasheva KO, Popov AA, Selifanova MV, Nikolaeva D, Tk-achev V, Penzar D, Nikitin DM, Buzdin A. H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac, H3K27me3 and H3K9me3 Histone Tags Suggest Distinct Regulatory Evolution of Open and Condensed Chromatin Landmarks. Cells. 2019;8(9): 1034. doi: 10.3390/cells8091034.
33. Voong LN, Xi L, Wang JP, Wang X. Genome-wide Mapping of the Nucleosome Landscape by Micrococcal Nuclease and Chemical Mapping. Trends Genet. 2017;33(8):495-507. doi: 10.1016/j.tig.2017.05.007.
Efficiency of SpCas9 and AsCpf1 (Cas12a) programmable nucleases at genomic safe harbor loci in HEK293 cells
S.V. Pavlova1 • E.A. Elisaphenko1 • L.Sh. Shayakhmetova1' 2 • S.P. Medvedev1
Rationale: The development of eukaryote genome engineering tools based on CRISPR-Cas programmable bacterial nucleases systems opens wide horizons for gene therapies, human disease cell modeling, as well as investigation into manifestation of disease phenotypes and visualization of cellular processes. The safety and approximation of experiments both at the cellular and organismal levels depend on the accuracy of introducing double-stranded breaks into the target DNA regions. The search for new variants of more accurate CRISPR-Cas nucleases and evaluation of their ability to hydrolyze nucleosome DNA in vivo is considered a critical task for the development of the genome engineering technologies. Aim: To analyze the activity of the programmable nuclease AsCpfl (Cas12a), with low level of off-target activity, in the human genome loci that are safe for the introduction of transgenic constructs ("safe harbor") and to compare its efficiency with that of the widely used SpCas9 nuclease in HEK293 cells.
Materials and methods: We performed the bi-oinformatics analysis of the association between target regions with nucleosomes and other proteins in the safe harbor loci AAVS1 and GSH-Ch1 and the transcriptionally inactive gene MYBPC3 (cardiac myosin binding protein 3) based on ATAC-seq data for the HEK293FT cells obtained from the NCBI SRA database. Plasmids encoding SpCas9 and AsCpfl nucleases and guide RNA to the target regions were constructed and transfected into the HEK293FT cells. Events in the target regions of the HEK293FT cell genome were studied in the seque-nograms with the TIDE algorithm.
Results: The results of the ATAC-seq experiments for HEK293FT cells have shown that the AAVS1 locus can be referred as open chromatin with a low nucleosome density, while the GSH-Ch1 locus can be attributed to closed chromatin. In HEK293FT cells, the cardiac MYBPC3 gene has intermediate chromatin density. Assessment of the efficiency of introducing breaks into the studied HEK293FT cell chromatin loci by nucleases has shown that SpCas9 is able to cope with chromatin of any nucleosome density, while AsCpfl can effectively introduce DNA breaks only at loci with open chromatin, such as AAVS1 and MYBPC3. Editing events occur at a very low rate at the GSH-Ch1 locus with a high nucleosome density. Conclusion: We have found low efficiency of the AsCpfl nuclease in the genomic safe harbor locus GSH-Ch1, which is characterized by a high nucleosome density. When planning an experiment on AsCpf1 nuclease genome editing, the epigenetic chromatin landscape and the nucleosome density should be considered, as well as chromatin opening substances should be used.
Key words: gene editing, CRISPR-Cas nuclease SpCas9 and AsCpfl, guide RNA, nucleosomes, open chromatin
For citation: Pavlova SV, Elisaphenko EA, Shayakhmetova LSh, Medvedev SP. Efficiency of SpCas9 and AsCpfl (Cas12a) programmable nucleases at genomic safe harbor loci in HEK293 cells. Almanac of Clinical Medicine. 2021;49(6):385-395. doi: 10.18786/2072-0505-2021-49-037.
Received 29 June 2021; accepted 28 July 2021; published online 15 September 2021
Sophia V. Pavlova - PhD (in Biol.), Research Fellow,
Laboratory of Developmental Epigenetics1; ORCID:
https://orcid.org/0000-0003-1095-3692
* 1-16 Mal'tseva ul., Novosibirsk, 630090, Russian
Federation. Tel.: +7 (913) 903 13 62.
E-mail: sonpavlova@gmail.com
Evgeny A. Elisaphenko - PhD (in Biol.), Senior
Research Fellow, Laboratory of Developmental
Epigenetics1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-
3204-8178. E-mail: antares@bionet.nsc.ru
Lilia Sh. Shayakhmetova - Laboratory Assistant1;
Bachelor2
Sergey P. Medvedev - PhD (in Biol.), Leading Research Fellow, Laboratory of Developmental Epigenetics1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1520-5549
Conflict of interests
The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this article. Authors' contributions
S.V. Pavlova, the study design and its experimental part, interpretation of the results, text writing; E.A. Elisaphenko, bioinformatics data analysis, analysis of the study results, editing of the manuscript; L.Sh. Shayakhmetova, conduction of the experiments, editing of the manuscript; S.P. Medvedev, the study concept and design, interpretation of the results, text writing, approval of the final version of the manuscript. All the authors have read and approved the final version of the manuscript before submission, agreed to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work have been appropriately investigated and resolved.
Acknowledgements
The study was supported by the Russian Foundation for Fundamental Research and by the Novosibirsk Oblast, project # 19-44-540002 p_a., budget project 0259-2021-0011.
1 Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; 10 Akademika Lavrent'yeva prospekt, Novosibirsk, 630090, Russian Federation
2 Novosibirsk State University; 1 Pirogova ul., Novosibirsk, 630090, Russian Federation
