CC BY
144
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВ ПАТОГЕНОВ ГРУППЫ ESKAPE
Н. С. Купцов М. А. Корниенко, Р. Б. Городничев, Д. И. Данилов, М. В. Малахова, Т. В. Парфенова, Г. И. Макаренко, Е. А. Шитиков, Е. Н. Ильина Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», Москва, Россия
Ежегодный рост числа случаев выявления бактерий с множественной лекарственной устойчивостью делает актуальной задачу поиска альтернативы применяемым антибиотикам. Такой альтернативой могут быть препараты на основе вирулентных бактериофагов. Целью работы было оценить эффективность коммерческих фаговых препаратов и моноизолятов бактериофагов, выделенных из природных источников, против клинических штаммов Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa. Была собрана коллекция из 147 штаммов, типированных методом МЛСТ. Оценку эффективности бактериофагов проводили методом спот-тестирования. Наиболее эффективными оказались препараты против S. aureus («Бактериофаг стафилококковый», 86%), K. pneumoniae («Пиобактериофаг поливалентный очищенный», 87,8%) и P. aeruginosa («Бактериофаг псевдомонас аеругиноза», 87,5%; «Пиобактериофаг комплексный», 79,5-90%; «Пиобактериофаг поливалентный очищенный», 90-92,5%). Для E. faecium эффективность препарата «Интести-бактериофаг» составила лишь 4,2%. При этом эффективность терапевтических препаратов, активных против S. aureus и K. pneumoniae, была выше эффективности отдельных моноизолятов бактериофагов (фаг S. aureus vB_SauP-436-3w — 60%, фаг K. pneumoniae vB_Kp_M_Seu621 — 5,9%). Таким образом, исследуемые препараты обладают высокой активностью против штаммов P. aeruginosa, K. pneumoniae и S. aureus. В свою очередь препаратов, действующих против остальных членов группы ESKAPE-патогенов (Acinetobacter baumannii и Enterobacter cloacae), а также эффективных против E. faecium, не представлено на рынке, что подчеркивает необходимость поиска новых бактериофагов. Ключевые слова: бактериофаги, бактериофаговая терапия, микробиология, ESKAPE-патогены, бактерии
Финансирование: исследование выполнено за счет средств, предоставленных для выполнения государственного задания «Разработка персонализированного подхода терапии инфекционных процессов с применением вирулентных бактериофагов» (ШИФР: Бактериофаг).
Благодарности: авторы благодарят Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России за секвенирование бактериальных генов для мультилокусного секвенирования-типирования штаммов.
Вклад авторов: Н. С Купцов — план исследований, набор и обработка данных, написание статьи; М. А. Корниенко — план исследований, обработка данных, написание статьи; Р. Б. Городничев, Т. В. Парфенова — набор и обработка данных; Д. И. Данилов, М. В. Малахова — набор данных; Г. И. Макаренко — сбор материала; Е. А. Шитиков — обработка данных, написание статьи; Е. Н. Ильина — написание статьи.
Соблюдение этических стандартов: вся экспериментальная работа выполнена с соблюдением норм Санитарно-эпидемиологических правил «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08; Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2518-09 — «Дополнения и изменения № 1 к санитарно-эпидемиологическим правилам «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08; Санитарно-эпидемиологических правил «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» СанПиН 2.1.7.2790-10, а также Федеральных клинических рекомендаций «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике». [><1 Для корреспонденции: Никита Сергеевич Купцов
ул. Малая Пироговская, д. 1а, г. Москва, 119435; kuptsovns@gmail.com
Статья получена: 06.05.2020 Статья принята к печати: 20.05.2020 Опубликована онлайн: 25.05.2020 DOI: 10.24075/vrgmu.2020.029
EFFICACY OF COMMERCIAL BACTERIOPHAGE PRODUCTS AGAINST ESKAPE PATHOGENS
Kuptsov NS Kornienko MA, Gorodnichev RB, Danilov DI, Malakhova MV, Parfenova TV, Makarenko GI, Shitikov EA, Ilina EN Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia
The ever-rising prevalence of multidrug-resistant bacteria necessitates the search for a therapeutic alternative to antibiotics. Using therapeutic products based on virulent bacteriophages might provide such an alternative. The aim of our study was to evaluate the efficacy of commercial phage products and natural bacteriophage monoisolates recovered from environmental sources against clinical strains of Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa. We compiled a collection of 147 strains that were subsequently genotypes using the MLST method. The efficacy of bacteriophages was evaluated in spot tests. The highest efficacy was demonstrated by "Staphylococcal bacteriophage" (86%, effective against S. aureus), "Purified polyvalent pyobacteriophage" (87.8%, effective against K. pneumoniae), and a group of phage products against P. aeruginosa, including "Pseudomonas aeruginosa bacteriophage" (87.5%), "Complex pyobacteriophage" (79.5-90%) and "Purified polyvalent pyobacteriophage" (90-92.5%). The efficacy of "Intesti bacteriophage", which targets E. faecium, was 4.2%. The efficacy of commercial phage products against S. aureus and K. pneumoniae was higher than the efficacy of individual phage monoisolates (60% for the S. aureus phage vB_SauP-436-3w and 5.9% for the K. pneumoniae phage vB_Kp_M_ Seu621). Thus, all tested commercial phage products were highly effective against P. aeruginosa, K. pneumoniae and S. aureus. There are no commercial phage products on the market against other ESKAPE pathogens, including Acinetobacter baumannii and Enterobacter cloacae. Besides, there are no effective phage products against E. faecium. This dictates the need for new effective bacteriophages against these species. Keywords: bacteriophages, phage therapy, microbiology, ESKAPE pathogens, bacteria
Funding: all study expenses were covered by the funds allocated for the State Assignment on the Development of a personalized approach to the therapy of infections using virulent bacteriophages (Code: Bacteriophage).
Acknowledgements: the authors thank the Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, the Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical Biological Agency for their help with bacterial gene sequencing and for subsequent multilocus sequencing typing.
Author contribution: Kuptsov NS — study plan; data acquisition and analysis; manuscript preparation; Kornienko MA — study plan; data analysis; manuscript preparation; Gorodnichev RB, Parfenova TV — data acquisition and analysis; Danilov DI, Malakhova MV — data acquisition; Makarenko GI — sample collection; Shitikov EA — data analysis; manuscript preparation; Ilina EN — manuscript preparation.
Compliance with ethical standards: the study was carried out in strict compliance with the sanitary norms and epidemiological safety standards specified in the guidelines on the work with microorganisms belonging to hazard groups III-IV and causative agents of parasitic diseases (Guidelines 1.3.2322-08); supplementary guidelines № 1 to the guidelines on the work with microorganisms belonging to hazard groups III-IIV and causative agents of parasitic diseases (Guidelines 1.3.2518-09), sanitary and epidemiologic requirements for the handling of medical waste (Sanitary norms and regulations 2.1.7.2790-10), and Federal clinical recommendations on the rational use of bacteriophages in clinical and epidemiological practice. [>3 Correspondence should be addressed: Nikita S. Kuptsov
Malaya Pirogovskaya, 1a, Moscow, 119435; kuptsovns@gmail.com Received: 06.05.2020 Accepted: 20.05.2020 Published online: 25.05.2020 DOI: 10.24075/brsmu.2020.029
С каждым годом в мире растет доля бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Под определение МЛУ-штаммов попадают штаммы бактерий, обладающие устойчивостью к трем и более антибактериальным препаратам [1]. Бактериальные инфекции, вызываемые МЛУ-штаммами, входят в список самых опасных угроз для мирового общественного здравоохранения. Наибольшее количество случаев устойчивости детектируют среди так называемых ESKAPE-патогенов (от начальных букв Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.). Бактерии этой группы вызывают угрожающие жизни внутрибольничные инфекции, особенно у людей с ослабленным иммунитетом и хроническими заболеваниями [2-4].
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, бактериальные патогены можно отнести к трем уровням приоритета опасности: критический, высокий и средний [1]. Карбапенем-устойчивые A. baumannii, P. aeruginosa и Enterobacteriaceae spp, а также K. pneumoniae относят к критическому уровню опасности. Доля таких изолятов в мировой популяции может достигать 50 и 64% для P. aeruginosa и K. pneumoniae соответственно [5]. Метициллин-устойчивые S. aureus (MRSA — от англ. methicillin resistant Staphylococcus aureus) и ванкомицин-устойчивые E. faecium относят к высокому уровню опасности. Доля MRSA может достигать 43%, а ванкомицин-устойчивых E. faecium — 59,1% [5]. При этом с каждым годом количество устойчивых изолятов только возрастает.
Инфекции, вызванные лекарственно-устойчивыми ESKAPE-патогенами, требуют искать новые подходы к лечению пациентов. Один из таких подходов — применение вирулентных бактериофагов в качестве дополнения или альтернативы антибактериальным препаратам. Попытки применения бактериофагов были сделаны еще в начале ХХ в. В настоящие время бактериофаги зарекомендовали себя как эффективные антибактериальные агенты [6, 7]. Применение вирулентных бактериофагов имеет ряд преимуществ, главное из которых в том, что взаимодействие между бактериофагом и бактерией не зависит от профиля устойчивости к антибактериальным препаратам. Надо также отметить, что бактериофаги постоянно коэволюционируют совместно с бактериями-хозяевами, что позволяет им преодолевать защитные системы последних.
На фармацевтическом рынке нашей страны представлена линейка препаратов на основе вирулентных бактериофагов (или фагов). Все они представляют собой коктейли из нескольких вирулентных бактериофагов. Использование таких коктейлей обеспечивает расширение спектра действия по отношению к различным штаммам бактерий. В основном коммерческие препараты вирулентных бактериофагов на территории России выходят под торговыми марками АО НПО «Микроген» и НПЦ «Микромир». Надо отметить, что производитель указывает широкий спектр активности препаратов против таких ESKAPE-патогенов, как E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa. К сожалению, на сегодняшний день на рынке не представлены препараты бактериофагов, действующие против A. baumannii и Enterobacter spp., что подчеркивает необходимость их разработки.
Целью работы было оценить эффективность коммерческих фаговых препаратов и моноизолятов
бактериофагов, выделенных из природных источников, против клинических штаммов E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные изоляты
В исследование включены изоляты E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa (n = 147), выделенные от пациентов, проходивших лечение в стационаре Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России в 2018-2019 гг. Культивирование бактерий проводили в течение 18-24 ч на колумбийском агаре (Oxoid; Великобритания) или на соевом бульоне (Oxoid; Великобритания) при температуре 37 °С.
Видовую идентификацию проводили с помощью метода прямого масс-спектрометрического профилирования бактериального лизата по методике, описанной ранее [8]. В качестве матрицы использовали насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (a-cyano-4-hydroxycinnamicacid (Bruker Daltonics; Германия)) в 50%-м ацетонитриле и 2,5%-й трифторуксусной кислоте. Масс-спектры получали на времяпролетном масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics; Германия). Для калибровки использовали бактериальный тест-стандарт (Bruker Daltonics; Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров применяли программное обеспечение flexControl 3.0 и flexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics; Германия). Видовую идентификацию проводили с помощью программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics; Германия).
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
Оценку чувствительности бактериальных штаммов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом по международным лабораторным стандартам (CLSI, the Clinical and Laboratory Standards Institute, 2019) [9]. Для грамотрицательных микроорганизмов (K. pneumoniae и P. aeruginosa) тестировали следующие антибактериальные препараты: цефтриаксон, гентамицин, ципрофлоксацин и меропенем. Для грамположительных микроорганизмов (S. aureus и E. faecium) устанавливали профиль чувствительности к эритромицину, ципрофлоксацину и тетрациклину. S. aureus дополнительно тестировали на устойчивость к оксациллину и гентамицину. Чувствительность E. faecium к ванкомицину оценивали методом серийных разведений в соответствии со стандартами CLSI [9].
Молекулярно-генетическое типирование штаммов коллекции
Типирование штаммов K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. faecium проводили методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) с использованием стандартных схем [10-14]. Для S. aureus использовали метод spa-типирования, основанный на установлении последовательности гена стафилококкового белка А (Staphylococcus protein A), с применением стандартного протокола [15].
Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-экспресс» («Литех»; Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Пробы ДНК хранили при -20 °C. Реакцию амплификации генов, входящих в схемы молекулярно-генетического типирования, проводили на TETRAD DNA ENGINE (MJ Research; США). Амплификацию осуществляли в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl (рН 9), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы («Литех»; Россия) и по 10 пмоль соответствующих праймеров. Продукты амплификации анализировали в 2%-м агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.
Секвенирование по Сэнгеру выполняли на приборе 3730 DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific; Великобритания). Последовательности генов анализировали с помощью программного обеспечения Ridom StaphType TM (Ridom GmbH; Würzburg, Германия), а также комплекса программ Vector NTI Suite 9 (Thermo Fisher Scientific; Великобритания). Для определения аллельных профилей и сиквенс-типов штаммов методом МЛСТ сравнивали полученные нуклеотидные последовательности с аналогичными последовательностями, доступными в международной базе данных PubMLST [11].
Препараты бактериофагов
В исследовании оценивали эффективность 14 коммерческих терапевтических препаратов вирулентных бактериофагов различных серий фирмы АО НПО «Микроген» (табл. 1). Все препараты были приобретены в аптеках г. Москвы и разрешены для клинического применения.
Выделение бактериофагов из природных источников
бактериального штамма и инкубировали на качалке при 37 °С в течение 18 ч. После культивирования бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3500 g, надосадок пропускали через фильтр Millipore с диаметром пор 0,22 мкм (Merck Millipore; США). Моноизоляты получали последовательным (трехкратным) выделением из отдельных негативных колоний. В дальнейшем бактериофаги наращивали в 50 мл бульона LB, содержащего 300 мкл ночной культуры бактериального штамма. Концентрацию бактериофага в фаговом лизате оценивали стандартным методом титрования по Грациа [16].
Оценка эффективности препаратов бактериофагов и фаголизатов бактериофагов
Оценку эффективности литических бактериофагов (титр более 107) проводили методом спот-тестирования. Для этого 0,1 мл ночной культуры смешивали с полужидким LB-агаром (0,6% агара). Полученную взвесь распределяли по поверхности чашки Петри, содержащей слой LB-агара (1,5% агара). После застывания верхнего слоя с полужидким агаром на поверхность наносили по 5 мкл исследуемых препаратов и инкубировали при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Через сутки на местах нанесения капли наблюдали образование прозрачного пятна лизиса либо отдельных негативных колоний. В таком случае бактериальный штамм считали чувствительным к действию препарата. Если пятно лизиса отсутствовало, бактериальный штамм считали устойчивым. Эффективность действия препарата бактериофагов по отношению к бактериальным штаммам одного вида определяли как процент чувствительных к данному препарату штаммов бактерий этого вида в общем пуле штаммов коллекции соответствующего вида.
Бактериофаги, эффективные в отношении отдельных штаммов K. pneumoniae и S. aureus, выделяли из природных источников (проб воды из различных водоемов) методом накопительных культур. Для этого образец воды в объеме 50 мл пропускали через фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм (Merck Millipore; США). К пробе добавляли двукратный бульон LB (от англ. lysogeny broth) (Oxoid; Великобритания), вносили 300 мкл ночной культуры
Таблица 1. Характеристика препаратов бактериофагов, используемых в ра
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе исследования создана коллекция из 147 бактериальных штаммов: K. pneumoniae (33 штамма; 22,5%), P. aeruginosa (40 штаммов; 27,2%), S. aureus (50 штаммов; 34%) и E. faecium (24 штамма; 16,3%). Для всех штаммов коллекции определен профиль устойчивости к антибактериальным препаратам (рис. 1).
Наименование препарата Спектр антибактериальной активности Серия Место производства
«Бактериофаг стафилококковый» Staphylococcus aureus и ряд других видов коагулазоотрицательных стафилококков H33 г. Нижний Новгород
П332 г. Пермь
«Бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синеп-юйный)» Pseudomonas aeruginosa H7 г. Нижний Новгород
«Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный» Klebsiella pneumoniae П252 г. Пермь
П251
«Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный» Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis У27 г. Уфа
«Пиобактериофаг поливалентный очищенный» Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Proteus spp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli У1 г. Уфа
У25
«Пиобактериофаг комплексный» Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Streptococcus spp, энтеропатогенных Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirahilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca Н74 г. Нижний Новгород
Н45
«Интести-бактериофаг» Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Salmonella spp, Escherichia coli, Proteus spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp, Pseudomonas aeruginosa H101 г. Нижний Новгород
H123
H86
H175
Согласно нашим данным, 9 из 33 штаммов (27,3%) K. pneumoniae были чувствительны ко всем тестируемым антибактериальным препаратам; 4 из 33 (12,1%) были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 17 из 33 (51,5%) были классифицированы как МЛУ. Для штаммов P. aeruginosa чувствительность ко всем тестируемым антибактериальным препаратам была определена для 7 из 40 (17,5%) штаммов; 15 из 40 (37,5%) штаммов были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 6 из 40 (15%) P. aeruginosa были классифицированы как МЛУ.
Среди S. aureus чувствительными ко всем тестируемым антибактериальным препаратам были 19 из 50 (38%) штаммов; 7 из 50 (14%) были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 22 из 50 (44%) классифицированы как МЛУ. Устойчивость к оксациллину проявляли 27 штаммов (54%). Среди E. faecium чувствительных штаммов выявлено не было; 3 из 24 (12,5%) штаммов были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 19 из 24 (19,2%) классифицированы как МЛУ. Доля штаммов E. faecium, устойчивых к ванкомицину, составила 12%.
На основании проведенного молекулярно-генетического типирования методом МЛСТ штаммы K. pneumoniae были отнесены к 15 сиквенс-типам (рис. 2A). Наиболее представленными сиквенс-типами оказались ST395 и ST23, к ним относились 14 из 33 (42,4%) и 5 из 33 (15,2%) штаммов соответственно. Было также обнаружено два уникальных сиквенс-типа (2-1-1-1-9-4-1 и 2-1-1-1 -94-18). По результатам типирования выявлено, что штаммы P. aeruginosa относились к 26 различным сиквенс-типам (рис. 2Б). Сиквенс-тип ST12 был наиболее представленным (5 из 40 штаммов; 12,5%). Кроме того, было выявлено три уникальных сиквенс-типа: 15-5-11-8-4-4-1 (2 штамма), 152-11-3-3-38-3 (2 штамма) и 17-5-12-3-14-4-7 (1 штамм). Штаммы E. faecium характеризовались 12 сиквенс-типами, а большинство из них относились к сиквенс-типам ST18 (4 из 24; 16,7%), ST17 (3 из 24; 12,5%), ST78 (3 из 24; 12,5%) и ST192 (3 из 24; 12,5%) (рис. 2В).
А
100
75
50
25
0 ^
В
CTR
GEN
CIP
MRP
100
75
50
25
OXA
CIP
ERY
GEN
TET
Методом spa-типирования установлено разнообразие штаммов S. aureus (рис. 2Г). Для штаммов коллекции было характерно 18 spa-типов, среди которых доминировали spa-типы t008 (20 из 50; 40%) и t308 (6 из 50; 12%).
Созданную коллекцию охарактеризованных штаммов ESKAPE-патогенов использовали для оценки эффективности 14 препаратов бактериофагов, включенных в исследование (см. табл. 1; рис. 3). Наиболее эффективным препаратом против K. pneumoniae был «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» серии У1 (29 из 33; 87,9%) (рис. 3А). В отношении штаммов P. aeruginosa эффективность препаратов варьировала от 76,9 до 92,5% (рис. 3Б). Эффективность препарата «Бактериофаг стафилококковый» против штаммов S. aureus составила 43 из 50 (86%) штаммов (рис. 3В). Единственный доступный препарат «Интести-бактериофаг» П86, действующий против E. faecium, показал эффективность на одном из 24 (4,2%) штаммов.
Для сравнения эффективности коммерческих препаратов с эффективностью отдельных бактериофагов были выделены моноизоляты бактериофагов из природных источников (vB_Kp_M_Seu621 и vB_SauP-436-3w), активные в отношении штаммов видов K. pneumoniae и S. aureus соответственно. Их титр составил 1012 БОЕ/мл (для vB_Kp_M_Seu621) и 1011 БОЕ/мл (для vB_SauP-436-3w). Эффективность моноизолятов vB_Kp_M_Seu621 и vB_SauP-436-3w, установленная на штаммах коллекции, составила 5,9 и 60% соответственно (см. рис. 3А и 3В).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
По результатам исследования эффективность поливидовых препаратов вирулентных бактериофагов по отношению к виду K. pneumoniae варьировала в широком диапазоне от 42,4 до 87,9%, для монопрепаратов этот диапазон составил 33,3-78,1% (см. рис. 3А). Последнее показывает неоднородность состава препаратов и говорит о необходимости обновления и периодического тестирования препаратов против коллекций актуальных бактериальных штаммов. Эффективность бактериофага
Б
100
75
50
25
0
CTR
GEN
CIP
MRP
100
75
50
25
CIP
TET
ERY
VAN
Рис. 1. Устойчивость к антибактериальным препаратам штаммов K. pneumoniae (A), P. aeruginosa (Б), S. aureus (В) и E. faecium (Г). Красным цветом показан процент устойчивых штаммов. CIP — ципрофлоксацин, TET — тетрациклин, ERY — эритромицин, MRP — меропенем, VAN — ванкомицин, OXA — оксациллин, CTR — цефтриаксон, GEN — гентамицин
Г
0
0
vB_Kp_M_Seu621 (5,9%), выделенного из природного источника, была значительно ниже, чем эффективность коммерческих препаратов бактериофагов, что может быть связано с разнообразием видов капсулы у K. pneumoniae. Капсула может служить рецептором для бактериофагов и определять эффективность взаимодействия бактериофага с хозяином [17].
В целом нужно отметить, что практически все штаммы K. pneumoniae (32 из 33; 97,9%) были чувствительны к какому-либо тестируемому препарату бактериофагов. При этом не было достоверных различий в эффективности лизиса МЛУ-штаммов и штаммов, чувствительных к действию антибактериальных препаратов. Наибольшее количество МЛУ-штаммов относилось к сиквенс-типу ST395. Штаммы, входящие в этот сиквенс-тип, наиболее распространены среди внутрибольничных и ассоциированы с распространением гена blaOXA-48, ответственного за устойчивость к ß-лактамным антибиотикам [18]. Для МЛУ-штаммов этого сиквенс-типа показана высокая эффективность препарата «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» серии У1 (9 из 11; 81,8%). Данный препарат вызывал лизис и остальных МЛУ-штаммов K. pneumoniae, относящихся к сиквенс-типам ST15, ST23, ST268.
Наибольшую эффективность препараты вирулентных бактериофагов показали в отношении штаммов P. aeruginosa. Для поливидовых препаратов эффективность составила 76,2-90%, а для моновидового препарата — 87,5% (см. рис. 3Б). Полученные результаты коррелируют с опубликованными данными. Согласно исследованию
А
ST395
■ ST86
■ ST299
■ ST1456
■ ST2555 1ST11
■ ST65
Уникальный 2
i ST23 ST268
■ ST307 1ST 1655
■ ST15 I ST268
■ Уникальный 1
В
STI8 . ST78 I ST64 IST60 I ST323 I ST640 . ST806
■ ST17
■ ST192
■ ST56
■ ST202
■ ST359
■ ST804
■ ST808
турецких коллег, проведенному на небольшой выборке штаммов P. aeruginosa (10 штаммов), эффективность препаратов «Пиобактериофаг комплексный» и «Интести-бактериофаг» составила 90 и 80% соответственно [19].
Как и в случае со штаммами K. pneumoniae, тестируемые препараты вызывали лизис практически всех штаммов P. aeruginosa коллекции (39 из 40; 97,5%). Что касается МЛУ-штаммов, относящихся к сиквенс-типам ST235, ST357 и ST654, то их лизис вызывало большинство тестируемых препаратов.
В отношении штаммов S. aureus моновидовые препараты вирулентных бактериофагов показали эффективность 86% для обеих серий препарата «Бактериофаг стафилококковый» (см. рис. 3В). Высокая эффективность препарата продемонстрирована в работах и других исследователей. К примеру, эффективность бактериофага vB_SauM-fRuSau02, выделенного из данного препарата, была оценена на 135 штаммах стафилококков, в том числе 30 штаммах коагулазоотрицательных видов [20]. Надо отметить, что штаммы S. aureus отличались своим происхождением: 51 штамм был получен от людей, а 54 штамма выделены от свиней. Для S. aureus, выделенных от людей, эффективность бактериофага vB_SauM-fRuSau02 была крайне высока (96%). В свою очередь для штаммов коагулазоотрицательных видов и штаммов S. aureus, выделенных от животных, эффективность была ниже и составила 50 и 33% соответственно [20]. Кроме того, проведена оценка эффективности другого коммерческого препарата, активного против S. aureus — «Stafal phage» (Bohemia Pharmaceuticals; Чешская республика).
Б _
■ ST12 ■ ST244 ■ ST654
■ STI98 ■ ST207 ■ ST499
■ Уникальный тип 1 Уникальный тип 2 ■ ST17
■ Уникальный тип 3 ■ ST186 ■ ST233
■ ST235 и ST266 ■ ST357
- ST395 ■ ST483 ■ ST498
■ ST508 ■ ST569 ■ ST589
■ ST1094 ■ ST1292 ■ ST1527
ш ST2427 ST2690
Г Üfe%
t008 t002
■ t267
■ t024 lt331
t015
4308 It233 ■t3625 lt030 11460 ■ 1021
■ tl27
■ t236I
■ 13X5
■ tl023 - tI90
t435
Рис. 2. Результаты молекулярно-генетического типирования для видов K. pneumoniae (А), P. aeruginosa (Б), E. faecium (В) и S. aureus (Г)
А
100
75 : 50 25
60,6 57,6 42,4
0
У1
У25
H74
H45
П252
П251
У27 vB_Kp_M_Seu621
Б
В
100
75
^ 50
25
0
100
75
50
25
У1 У25 H101 H123 П86 H175 H74 H45 H7
П332
H33
vB_Saup-436-3w
Рис. 3. Эффективность коммерческих препаратов бактериофагов против бактерий видов K. pneumoniae (А), P. aeruginosa (Б) и S. aureus (В). Зеленым показан процент чувствительных к фаговым препаратам штаммов. На рисунке обозначены серии препаратов: «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» (У1, У25); «Пиобактериофаг комплексный» (Н74, Н45); «Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный» (П252, П251); «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный» (У27); «Бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный)» (Н7); «Бактериофаг стафилококковый» (П332, Н33)
Бактериофаги, выделенные из этого препарата, были активны против 83% MRSA и 99% MSSA (от англ. methicillin susceptible Staphylococcus aureus) [21].
По данным нашего исследования, все MRSA-штаммы (а также МЛУ-штаммы) были чувствительны к препарату «Бактериофаг стафилококковый» серии Н33. К серии П332 этого же препарата был устойчив один MRSA-штамм, который также относился к МЛУ-штаммам. Данный штамм представлял spa-тип t127.
Эффективность моноизолята бактериофага vB_SauP-436-3w на штаммах коллекции (30 из 50; 60%) была ниже эффективности коммерческого препарата «Бактериофаг стафилококковый» (43 из 50; 86%), однако значительно выше, чем аналогичная величина для бактериофага vB_Kp_M_Seu621, активного против K. pneumoniae. Данный факт связан с тем, что в качестве рецепторов для бактериофагов стафилококков выступают тейхоевые кислоты бактериальных клеток [22], вариабельность которых значительно ниже, чем вариабельность капсул грамотрицательных бактерий.
Крайне низкая эффективность была выявлена для коммерческих препаратов, активных в отношении E. faecium (1 из 24; 4,2%). Чувствительный к действию препарата бактериофагов штамм относился к ST-17. Надо отметить, что бактериофаги, активные против этого вида, входили в состав препаратов с широким спектром действия.
Моновидовых препаратов вирулентных бактериофагов для E. faecium не представлено на российском рынке.
Для клинической медицины интересны данные о наличии корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и их устойчивостью к антибактериальным препаратам, а также корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и принадлежностью бактерий к определенному клональному комплексу. Поиск таких корреляций был осуществлен в рамках данной работы. Было установлено, что препараты бактериофагов вызывают лизис штаммов как чувствительных к антибактериальным препаратам, так и устойчивых, что является ключевым моментом в применении бактериофагов в медицине в качестве альтернативы антимикробным веществам. Корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и их устойчивостью к антибактериальным препаратам обнаружено не было (p > 0,05). Что касается корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и принадлежностью бактерий к определенному клональному комплексу, то штаммы одного МЛСТ сиквенс-типа могут быть как чувствительными, так и устойчивыми к воздействию бактериофага. Это справедливо для всех исследуемых бактериальных видов. Таким образом, нет четкой корреляции между типом взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и ее МЛСТ сиквенс-типом (р > 0,05).
0
ВЫВОДЫ
Результаты данного исследования показывают, что штаммы собранной коллекции относятся к различным генетическим группам и обладают повышенной устойчивостью к антибактериальным препаратам, что делает их пригодными для оценки эффективности коммерческих терапевтических препаратов. Существующие на рынке препараты бактериофагов обладают высокой
эффективностью против таких представителей ESKAPE-патогенов, как P. aeruginosa и S. aureus. Однако не все испытываемые препараты одинаково эффективны против штаммов K. pneumoniae. Следует также подчеркнуть, что для терапевтических целей предпочтительно использование коктейлей бактериофагов, особенно при терапии инфекционных процессов, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, в частности K. pneumoniae.
Литература
1. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014. World Heal Organ. 2014: 1-257.
2. Rice LB. Progress and Challenges in Implementing the Research on ESKAPE Pathogens. Infect Control Hosp Epidemiol. Cambridge University Press (CUP). 2010; 31 (S1): S7-S10.
3. Земко В. Ю., Окулич В. К., Дзядзько А. М. Мониторинг антибиотикорезистентности микроорганизмов в отделении реанимации и интенсивной терапии многопрофильного стационара. Трансплантология. 2018; 10 (4): 284-97.
4. Склеенова Е. Ю. и др. Pseudomonas aeruginosa в РФ: история одного из наиболее успешных нозокомиальных патогенов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018; 3: 164-71.
5. European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance of antimicrobial resistance in Europe 2018. Stockholm: ECDC, 2019.
6. Jennes S, et al. Use of bacteriophages in the treatment of colistin-only-sensitive Pseudomonas aeruginosa septicaemia in a patient with acute kidney injury-a case report. Critical Care. 2017; 21 (1).
7. Breederveld RS. Phage therapy 2.0: where do we stand? The Lancet Infectious Diseases. 2019; 19 (1): 2-3.
8. Корниенко М. А., Ильина Е. Н., Боровская А. Д., Эдельштейн M. В., Сухорукова M. В., Кострцева М. и др. Штаммовая классификация staphylococcus aureus посредством прямого масс-спектрометрического профилирования. Биомедицинская химия. 2012; 58 (5): 501-13.
9. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing An informational supplement for global application developed through the Clinical and Laboratory Standards Institute consensus process. 29th Edition. January 2019.
10. Institut Pasteur MLST databases and software. Klebsiella pneumonia: Доступно по ссылке: https://bigsdb.pasteur.fr/ klebsiella/klebsiella.html.
11. Pubmlst: Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. Доступно по ссылке: https://pubmlst.org/
databases/.
12. Diancourt L, et al. Multllocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol. 2005; 43 (8): 4178-82.
13. Jolley KA, Bray JE, Maiden MCJ. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome open Res. 2018; 3: 124.
14. Pubmlst: Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. Enterococcus faecium. Доступно по ссылке: https://pubmlst.org/efaecium/.
15. Harmsen D, et al. Typing of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in a University Hospital Setting by Using Novel Software for spa Repeat Determination and Database Management. J Clin Microbiol. 2003; 41 (12): 5442-8.
16. Mazzocco A, et al. Enumeration of bacteriophages using the small drop plaque assay system. Methods Mol Biol. 2009; 501: 81-85.
17. Lin T-L, et al. Isolation of a bacteriophage and its depolymerase specific for K1 capsule of Klebsiella pneumoniae: implication in typing and treatment. J Infect Dis. 2014; 210 (11): 1734-44.
18. Cubero M, et al. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae clones causing bacteraemia in adults in a teaching hospital in Barcelona, Spain (2007-2013). Clin Microbiol Infect. 2016; 22 (2): 154-60.
19. Ozkan I, et al. Lytic Activity of Various Phage Cocktails on Multidrug-Resistant Bacteria. Clin Invest Med. 2016; 39 (6): 27504.
20. Leskinen K, et al. Characterization of vB_SauM-fRuSau02, a twort-like bacteriophage isolated from a therapeutic phage cocktail. Viruses. 2017; 9 (9): Е258.
21. Dvorâckovâ M, et al. Antimicrobial effect of commercial phage preparation Stafal® on biofilm and planktonic forms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Folia Microbiol. 2019; 64 (1): 121-26.
22. Xia G, et al. Wall teichoic acid-dependent adsorption of staphylococcal siphovirus and myovirus. J Bacteriol. 2011; 193 (5): 4006-9.
References
1. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014. World Heal Organ. 2014: 1-257.
2. Rice LB. Progress and Challenges in Implementing the Research on ESKAPE Pathogens. Infect Control Hosp Epidemiol. Cambridge University Press (CUP). 2010; 31 (S1): S7-S10.
3. Zemko VY, Okulich VK, Dzyadzko AM. Monitoring the antibiotic resistance in the intensive care unit of a multidisciplinary hospital. Transplantologiya. The Russian Journal of Transplantation. 2018; 10 (4): 284-97.
4. Skleenova EYu, Azizov IS, Shek EA, Edelstein MV, Kozlov RS, Dekhnich AV. Pseudomonas aeruginosa: the history of one of the most successful nosocomial pathogens in Russian hospitals. Clin Microbiol Antimicrob Chemother. 2018; 3: 164-71.
5. European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance of antimicrobial resistance in Europe 2018. Stockholm: ECDC, 2019.
6. Jennes S, et al. Use of bacteriophages in the treatment of colistin-only-sensitive Pseudomonas aeruginosa septicaemia in a patient
with acute kidney injury-a case report. Critical Care. 2017; 21 (1).
7. Breederveld RS. Phage therapy 2.0: where do we stand? The Lancet Infectious Diseases. 2019; 19 (1): 2-3.
8. Kornienko MA, Ilina EN, Borovskaya AD, Edelstein MV, Sukhorukova MV, Kostrzewa M, et al. Strain differentiation of staphylococcus aureus by means of direct maldi tof mass spectrometry profiling. Biomeditsinskaya Khimiya. 2012; 58 (5): 501-13. Russian.
9. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing An informational supplement for global application developed through the Clinical and Laboratory Standards Institute consensus process. 29th Edition. January 2019.
10. Institut Pasteur MLST databases and software. Klebsiella pneumonia: Available from: https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/ klebsiella.html.
11. Pubmlst: Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. Available from: https://pubmlst.org/databases/.
12. Diancourt L, et al. Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol. 2005; 43 (8): 4178-82.
13. Jolley KA, Bray JE, Maiden MCJ. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome open Res. 2018; 3: 124.
14. Pubmlst: Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. Enterococcus faecium. Available from: https:// pubmlst.org/efaecium/.
15. Harmsen D, et al. Typing of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in a University Hospital Setting by Using Novel Software for spa Repeat Determination and Database Management. J Clin Microbiol. 2003; 41 (12): 5442-8.
16. Mazzocco A, et al. Enumeration of bacteriophages using the small drop plaque assay system. Methods Mol Biol. 2009; 501: 81-85.
17. Lin T-L, et al. Isolation of a bacteriophage and its depolymerase specific for K1 capsule of Klebsiella pneumoniae: implication in
typing and treatment. J Infect Dis. 2014; 210 (11): 1734-44.
18. Cubero M, et al. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae clones causing bacteraemia in adults in a teaching hospital in Barcelona, Spain (2007-2013). Clin Microbiol Infect. 2016; 22 (2): 154-60.
19. Ozkan I, et al. Lytic Activity of Various Phage Cocktails on Multidrug-Resistant Bacteria. Clin Invest Med. 2016; 39 (6): 27504.
20. Leskinen K, et al. Characterization of vB_SauM-fRuSau02, a twort-like bacteriophage isolated from a therapeutic phage cocktail. Viruses. 2017; 9 (9): E258.
21. Dvoräckovä M, et al. Antimicrobial effect of commercial phage preparation Stafal® on biofilm and planktonic forms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Folia Microbiol. 2019; 64 (1): 121-26.
22. Xia G, et al. Wall teichoic acid-dependent adsorption of staphylococcal siphovirus and myovirus. J Bacteriol. 2011; 193 (5): 4006-9.
