Эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 636:636.082.12:575.113

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ

Н.С. ЛОЦМАНОВА, аспирант

Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией

В.А. БАГИРОВ, член-корреспондент РАСХН, зав. лабораторией

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондент РАСХН, зам. директора

Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ВНИИ животноводства

Л.К. ЭРНСТ, академик РАСХН, вице-президент

Российская академия сельскохозяйственных наук

E-mail: natavolkova@inbox.ru

Резюме. Изучена эффективность переноса экзогенной ДНК в стволовые клетки семенников (СКС) - спер-матогониихряков in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов. Установлено, что частота генетической трансформации клеток-мишеней составляет 4,1 ■ 10-4...1,6 ■ 10-3.

Ключевые слова: ретровирусные векторы, сперматого-нии, свиньи.

Использование клеток гонад животных в биотехнологии рассматривается в качестве перспективного приема получения трансгенных сельскохозяйственных животных [1...4]. При этом среди большой популяции клеток спер-матогенного эпителия наибольший интерес представляет использование стволовых клеток сперматогоний (СКС), которые служат удобной моделью для проведения различных геномных манипуляций у млекопитающих.

Вместе с тем, использование половых клеток в качестве генетического вектора для переноса рекомбинантной ДНК осложняется нарушениями физиологических функций «трансгенного» спермия (уменьшение подвижности, разрушение цитоплазматической мембраны, спонтанная акросомическая реакция, потеря оплодотворяющей способности) [5]. В связи с этим возникает необходимость в разработке эффективных методов генетической трансформации половых клеток животных, направленных на повышение результативности трансгенеза. Один из таких подходов - использование ретровирусных векторов. Благодаря природной способности ретровирусов самостоятельно переносить рекомбинантную ДНК в делящиеся соматические клетки, использование генных конструкций, полученных на их основе, позволяет осуществлять трансформацию отдельных органов и тканей взрослых животных.

Цель наших исследований изучить эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации сперматогоний хряков in vivo.

Условия, материалы и методы. Для трансформации клеток-мишеней использовали ретровирусные векторы pX-RSVhGH и pX-Ins, содержащие соответственно гены гормона роста и инсулина человека.

Достижения науки и техники АПК, №10-2010

Для их упаковки в вирусные частицы использовали линию клеток-упаковщиц GP+envAm12.

Трансформацию клеток семенников хряков in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетка-ми-упаковщицами и инфицирования вирусным препаратом, содержащим рекомбинантный ретровирус. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Введение генной конструкции pX-Ins в паренхиму семенников in vivo осуществляли методом множественной инъекции (5.. .8 на семенник). В качестве источника конструкций использовали суспензию клеток-упаковщиц в среде DMEM с предварительно заблокированным митозом митомицином С с добавлением полибрена из расчета 8 мкг/мл. Клетки-упаковщицы вводили в концентрации 1 млн клеток на семенник.

Исследования, проведенные ранее [6], показали, что оптимальный период для биоинженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия у хряков - возраст от 7 до 80 дней. В это время их семенные канальцы представлены только сперматогониями, для которых характерна наиболее высокая пролиферативная активность. Учитывая это, введение генных конструкций в семенники опытных животных осуществляли в возрасте 2 недель.

Через 14 дней после инъекции от подопытных животных путем кастрации отбирали пробы тканей семенников для анализа интеграции и экспрессии генных конструкций методами ПЦР и иммуногистохимии. В последнем случае было проанализировано не менее 20 гистологических срезов (толщиной 4.5 мкм) с интервалом 50 мкм.

Результаты и обсуждение. Исследования проведенные в культуре in vitro показали эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации клеток семенников свиней (табл. 1). Наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при

Таблица 1. Частота генетической трансформации клеток ^ семенника хряка in vitro__________

Конструк- ция Совместное культивирование

клетки- упаковщицы вирусный препарат вирусный препарат (10х)

pX-Ins 4,1 X 10'4 9,0 X 10'ь -pX-RSVhGH 1,5 X 10-4 2,5 х 10-5 6,3 х 10-5

использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц. В этом случае из 100000 инфицированных клеток было выявлено от 15 до 41 трансформи-

Рисунок. Иммуногистохимическое окрашивание семенников хряков на инсулин чело-' века: 1 - контроль; 2 - опыт. Трансформированные сперматогонии внутри семенного канальца выделены рамкой. Хромоген - ДАБ. Докраска гематоксилином. Увеличение: х400.

39

рованных клона (в зависимости от используемой генной конструкции). При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом величина этого показателя была в 4,5-6 раз меньше.

Интеграция и экспрессия генной конструкции pX-Ins в клетках сперматогенного эпителия в условиях in vivo была установлена практически у всех подопытных хрячков. Им-муногистохимический анализ после инъекции клеток-упа-ковщиц выявил наличие трансформированных клеток в 30 из 60 проанализированных срезов семенников. Число транс-

Таблица 2. Эффективность генетической трансформации клеток семенников хрячков in vivo генной конструкцией pX-Ins

Исследовано животных, п 3

Исследовано срезов, п 60

Эффективность трансформации семенных канальцев

Исследовано семенных канальцев, п 558

Число срезов с трансформированными семенными канальцами, п (%) 30 (50)

Число трансформированных канальцев, %:

минимальное на одном трансформированном срезе 0,29+0,°6

максимальное на одном трансформированной срезе 1,42+0,10

в среднем по группе ^ 0,39+0,11

Эффективность трансформации сперматогоний Число трансформированных сперматогоний, п 36

Среднее количество клеток в семенном канальце, п 40

Число семенных канальцев, п 558

Общее количество клеток, п 22320

Общая эффективность трансгенеза (отношение числа трансформированных сперматогоний к их общему числу во всех исследованных канальцах)

формированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 5 (см. рисунок), а общее их количество на одном срезе достигало 8. При этом доля трансформированных канальцев варьировала от 0,29±0,06 до 1,42±0,10 % при общей эффективности трансгенеза 1,610-3 (табл. 2).

Выводы. Проведенные эксперименты показали возможность переноса рекомбинантной ДНК в клетки спер-

суммарные данные по группе (по 60 гистологическим срезам).

матогенного эпителия хряков посредством использования ретровирусных векторов. При использовании генных конструкций pX-RSVhgh и pX-ins осуществлена трансформация этих клеток-мишеней in vitro и in vivo. Наибольшая результативность трансгенеза установлена в варианте с генной конструкцией pX-ins в виде суспензии клеток-упа-ковщиц - от 4,1-10-4 (in vitro) до 1,610-3 (in vivo).

Литература.

1. Эрнст Л.К. Роль биологии в развитии животноводства в XXI веке //Достижения науки и техники АПК. - 2008. - №10. - С. 7-8.

2. Некоторые аспекты клеточной инженерии животных / Эрнст Л.К., Багиров В.А., Томгорова Е.К., Сингина Г.Н., Волкова Н.А., Зиновьева Н.А., Чаушев И.Н., Чаушева А.И. // Достижения науки и техники АПК. - 2008. - №12 - С. 39-42.

3. Генетическая трансформация сперматогониев кроликов in vivo / Новгородова И.П., Мормышев А.Н., Волкова Н.А., Зиновьева Н.А. // Биотехнология. - 2008. - №1. - с.24-28.

4. Культивирование и трансплантация сперматогоний типа А хряков / Савченкова И.П., Коржикова С.В., Костерева Н.В., Эрнст Л.К. // Онтогенез. - 2006. - Т. 37. - № 4. - С. 292-300.

5. Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioassays. - 1998. - Р. 302-324.

6. Коржикова С.В. Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка: Автореф. дис...канд. биол. наук . - ВИЖ, Дубровицы, 2002. - 27 с.

EFFICIENCY OF THE USING THE RETROVIRAL VECTORS FOR OF THE RECOMBINANT DNA TRANSFERINTO THE SPERMATOGONIA OF PIGS N.S. Lozmanova, N.A.Volkova, V.A.Bagirov, N.A.Zinovieva, L.A. Volkova, L.K. Ernst

Summary. The efficiency testicular stem cells in vitro and in vivo using the retroviral vectors was investigated. The genetic transformation frequency of targeting cells was estimated at the level of 4,1 x 10-4 to 1,6 x 10-3.

Key words: retrovirus vectors, spermatogonia cells, pig.

УДК. 591.1:639.215

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНИЗМА КАРПОВЫХ РЫБ ПЕРЕД ЗИМОВКОЙ

В.П. КУЛАЧЕНКО, доктор биологических наук, профессор

И.В. КУЛАЧЕНКО, кандидат биологических наук, доцент Белгородская ГСХА E-mail: bsau@belgtts.ru

Резюме. Изучено физиологическое состояние сеголетков чешуйчатого и зеркального карпов с учетом общей массы, упитанности, химического состава тела

и коэффициента физиологической устойчивости в условиях Белгородской области.

Ключевые слова: рыба, тело, состав, упитанность, устойчивость, зимовка.

Сегодня особое внимание уделяется развитию прудового рыбоводства, которое по принципу организации и средствам производства относится к сельскохозяйственному сектору экономики страны [1,2,3]. Основной вид потребляемой прудовой рыбы - карповые. Наиболее труд__ Достижения науки и техники АПК, №10-2010