CC BY
41
УДК 636:636.082.12:575.113
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ СОМАТИЧЕСКОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ САМЦОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ*
J1.K. ЭРНСТ, академик РАСХН, вице-президент Россельхозакадемия Е.В. Б ЕЛО ГЛАЗОВА аспирант Е.К. ТОМГОРОВА, аспирант Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
В.А. БАГИРОВ, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондент РАСХН, зам. директора
Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ВНИИ животноводст ка E-mail: [email protected]
Резюме. Выполнена генетическая трансформация сперматогониев кроликов, свиней и кур in vivo с использованием ретровирусных генных конструкций. Показано, что эффективность трансформации таких клеток зависит от используемого типа ретровирусного препарата и периода, прошедшего от момента инъекции до отбора проб. Ключевые слова: ретровирусные векторы, сперматого-нии, кролики, свиньи, куры.
Генетическая модификация животных - актуальнейшая задача современной науки и неотъемлемая часть биотехнологий будущего, необходимых для решения широкого спектра фундаментальных и прикладных задач 11, 2|. Одним из перспективных приемов получения трансгенных сельскохозяйственных животных в последние годы рассматривают использование клеток гонад.
Вместе с тем, использование головых клеток в качестве вектора для получения генномодифицированных животных осложняется нарушениями физиологических функций «трансгенного» спсрмия (уменьшение подвижности, разрушение цитоплазматической мембраны, спонтанная акросомическая реакция, потеря оплодотворяющей способности), а также детекцией и разделением «трансгенных» и нормальных спермиев [3].
Несмотря на то, что для трансформации половых клеток используют различные методы (липофскцию, электропорацию и вирусную трансдукпию) [4...6], на сегодняшний день нет системы, позволяющей эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в клетки сперматогоний.
В этой связи, мы провели эксперименты по оценке эффективности генетической трансформации
Работа выполнена при финансовой поддержке Гоан-та Президента РФ МД-420.2009.4 и РФФИ№08-08-90011Бел_а.
сперматогоний сельскохозяйственных животных, в частности, кроликов, свиней и кур ретровирусными генными конструкциями.
Условия, материалы и методы. В экспериментах использованы генные конструкции, полученные на основе вируса лейкемии мыши, включающие рёпартерные гены GFP и lacZ, а также ген инсулина человека под контролем промотора цитомегаловируеа (pX-Ins).
Трансформацию клеток сперматогеного эпителия in vitm осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и инфицирования вирусным препаратом [7]. Вирусный препарат представлял собой кондиционированную среду клеток-упаковщиц, содержащую рекомбинантные ретровирусные частицы. Сбор культуральной среды осуществляли на стадии, предшествующей формированию слитного монослоя. Для этого клетки-упаковщицы помещали в новую ростовую среду и инкубировали в течение 12-24 часов, после чего собирали ростовую среду и использовали в последующем для трансформации клеток-мишеней.
Введение генных конструкций в семенники in vivo осуществляли методом множественной инъекции (5.. .8 инъекций) в паренхиму этого органа. В качестве источника конструкций использовали как клет-ки-упаковшицы, так и вирусный препарат. Через 7 и 14 дней после инъекции от подопытных животных отбирали пробы тканей семенников для определения наличия трансформированных клеток. Материал отбирали при полостной внутрибрюшинной операции или при односторонней кастрации под обшей и местной анестезией брюшной полости области мошонки и семенника (левого или правого).
Экспрессию рекомбинантного продукта в клетках семешгиков определяли методом иммуногистохимии. Частоту интеграции генных конструкций рассчитывали как отношение числа трансформированных сперматогониев к общему числу сиерматогони-ев в трансформированных семенных канальцах, выраженное и процентах. Общую эффективность трансгенеза рассчитывали как процентное отношение числа трансформированных сперматогониев к общему числу сперматогониев во всех исследованных канальцах. Статистическую обработку результатов осуществляли по стандартным методикам [8|.
Результаты и обсуждения. Эксперименты по трансформации клеток сперматогенного эпителия кроликов, свиней и кур in vitro показали, что частота генетических изменений клеток-мишеней варьировала в зависимости от метода трансфекции. Наибольшее число модифицированных клонов получено при совместном культивировании с клетками-упаковщи-иами (до 25 клонов на 10000 инфицированных клеток). При использовании вирусных препаратов вели-
Таблица. Эффективность трансформации клеток семенников in vivo генной конструкцией pX-Ins
Вид животного Тип препарата Число дней после инъекции Частота интеграции, % Процент трансфориир. канальцев, % Общая эффективность трансгенеза, %
Кролики клетки 7 3.5 0,32 2,3 - 10"J
14 3,5 0,63 4,1 Ю'э
вирусный 7 3,6 0,08 0,7-10'3
препарат 14 3,2 0,22 1.5-10'3
Свиньи клетки 7 2,8 0,22 1,4 * 10*3
14 2.1 0,43 1,6-Ю'3
вирусный 7 2.0 0,15 0,6 ю_3
препарат 14 2,3 0,24 0,8 Ю'3
Куры вирусный
препарат 14 1,8 0,30 1,2 -10
чина этого показателя была ниже более чем в 2 раза. Полученные результаты послужили основой для проведения дальнейших исследований по трансформации сперматогониев in vivo.
Перед введением генных конструкций в семенники взрослых животных и птицы in vivo была изучена динамика развития сперматоген ного эпителия в различные возрастные периоды. Установлено, что оптимальный срок введения ретровирусных генных конструкций в семенники кроликов — период с 10 дней до 9 недель, свиней — с 7 дней до 3 месяцев, петухов — с I до 3 месяцев. В это время клетки сперматогенного эпителия характеризуются высокой пролиферативной активностью и представлены, в основном, сперматогониями. Учитывая это, введение ретровирусных векторов в семенники опытных животных осуществляли в оптимальные сроки.
Иммуногистохимически й анализ сперматогенного эпителия подопытных кроликов, свиней и петухов выявил наличие в семенных канатьцах клеток с характерным окрашиванием практически у всех исследованных животных. При этом их доля варьировала в зависимости от вида животного, типа используемого препарата (клетки-упаковщицы, вирусный препарат) и периода времени, прошедшего после инъекции генных конструкций в семенники (см. табл.). Наиболее результатив-
ным оказалось введение генных конструкций в семенники кроликов. В этом случае частота их интеграции достигала 3,5...3,6% при общей эффективности транс-генеза от 0,7 • 10'3 до 4,1 • Ю'3 (7...41 трансформированных сперматогониев на 10000 исследованных клеток). У хрячков и петухов величины этих показателей были ниже.
Сравнительный анализ показал, что более результативно с точки зрения траисгенеза использование кле-ток-упакопшиц. Общая его эффективность в этом случае достигала 4,1 • 10 3, что было почти в 2,7 раза выше, чем в варианте с применением вирусного препарата. Независимо от используемого для инъекции типа препарата с удлинением продолжительности периода, прошедшего с момента инъекции генной конструкции, количества трансформированных сперматогоний увеличивалось почти в 2 раза.
Выводы. Результаты наших исследований свидетельствуют о возможности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток самцов селькохозяйственн ых животных с целью получении трансгенных животных с заданными свойствами.
При этом эффективность трансформации таких клеток зависит от используемого типа ретровирусного препарата и периода, прошедшего от момента инъекции до отбора проб. Наиболее высокий процент трансформации клеток сперматогенного эпителия наблюдается при использовании в качестве источника генных конструкций суспензии клеток-упаковщиц. С удлинением периода времени, прошедшего с момента шгьекции генной конструкции, отмечается увеличение количества трансформированных сперматогоний.
Литература.
1. Эрнст Л. К. Роль биологии в развитии животноводства в XXIвеке//Достижении науки и техники АПК. — 2008. - №10. - С. 7-8.
2. Некоторые аспекты клеточной инженерии животных./Эр/icm Л.К., Багиров В.А., Томгорова F.K., Сингина Т.Н., Волкова Н А., Зино-
вьева Н А., Чаушев И.Н., Чаушева А. И. //Достижения науки и техники АПК. — 2008 - №12 — С.39-42.
3. Spadaforu С. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioassays. — 1998. — /‘.302-324.
4. Boulo V., Cadoret J.P., Le Marrec F. etal. Transient expression oflucijerarase reporter gene after lipofeciion of oyster (Crassostrea gigas) primary cell cultures//Mot. Marine Biol. Biotech. — 1996. — V.S(3). — p. 167-174.
5. Tsai H.J., Lai CH., Yang H.S. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorstcolor suportexta///Transgenic Res. — 1997. — V.6(l). — P.85-95.
6. Wheeler MB. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review//Reprod. Fertil. Dev. — 1994. — V. 6. — P. 563-568.
7. Новое в клонировании ДНК. Memoilu. / Hod pet). Д. Гловера. - М. : Мир, 1989. -368 с.
8. Меркурьева Е.К., Шангин - Березанский Т.П. Генетики с основами биометрии — М., 1988.
SOME ASPECTS OF SOMATIC GENE TRANSFER INTO THE GENERATIVE CELLS OF AGRICULTURAL
ANIMAL
L.K. Ernst, E.V. Beloglazova, E.K. Tomgorova, N.A. Volkova, V.A.Bagirov, N.A. Zinovieva, L.A. Volkova Summary. The genetic transformation of the rabbit, pig and chicken spermatogonia cells in vivo using the retrovirus gene constructs was performed. It was shown, that the efficiency of the transformation of the spermatogonia cells was dependent of the type of the virus preparation and the period of the injection to the sample collection.
Keywords: retrovirus vectors, spermatogonia cells, rabbit, pig, chicken.
