CC BY
50
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 1-2, стр 47-56 ©2004, СПбРОРАЛКИ
Оригинальные статьи
ЭФФЕКТ СИНЕРГИЗМА В ИНДУКЦИИ ИНТЕРФЕРОНА И ПРОТИВОВИРУСНОМ ДЕЙСТВИИ САНОГЕНА, БЕГАЛЕЙКИНА И ЦИКЛОФЕРОНА
Гариб Ф.Ю., Ризопулу А.П., Арипова Т.У.*
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад.И.II.Павлова, Россия;
ЧНПП «Иммуномед», Институт иммунологии АНРУз (Ташкент)*, Узбекистан
Резюме. В классической модели изучена активность индукторов IFN на мышах с титрованием сыворотки по подавлению цитопатического действия тест-вируса в культуре. Показано, что Саноген - синтетический трипептидный аналог фракции из фетального тимуса обладает индуктивным действием на синтез IFN в организме интактных мышей. Комбинации Саногена с Беталейкипом или с Циклофероном, или Беталей-кина с Циклофероном индуцируют выраженный интерфероновый ответ, превосходящий ожидаемое аддитивное действие в десятки раз. Этот синергичный эффект оценен количественно по отношению фактического титра IFN к сумме титров для каждого препарата на конкретный срок наблюдения. Так, под влиянием Саногена с Беталейкином через 48 часов после введения активность IFN была выше в 64 раза по сравнению с его индукцией отдельными препаратами. Индекс синергизма разных комбинаций препаратов возрастал от 4 до 32 на 3-5 сутки после введения. Под влиянием комбинаций препаратов увеличивается не только титр IFN, но и продлевается его циркуляция в крови, на несколько суток сохраняя высокую активность. Эффект синергизма подтвержден в другой модели - антивирусного действия комбинаций указанных препаратов по защите смертельно зараженных вирусом мышей.
Ключевые слова: синергизм, индукции интерферона, Саноген, экспериментальный гепатит.
Garib F. Yu., Rizopulu А.P., Aripova T.U.
SANOGEN, BETALEUKIN AND CYCLOFERON SHOW THE SYNERGISM EFFECT
AT THE INTERFERON INDUCTION AND ANTI-VIRAL ACTIVITY
Abstract. The activity of IFN-inductors in the suppression of cytopathy action of test-virus in culture had been investigated using the classical method of scrum titration in mice model. Synthetic trio-peptide analog of fetal thymus extract’s fraction (Sanogen) causes an induction of IFN synthesis of the intact mice. Different combinations of the medicaments (Sanogen&Betaleukin, Sanogen&Cycloferon, and Betaleukin&Cycloferon) initiate the interferon’s respond, which exceed of the expected additive action in several times. This effect had been estimated quantity as the comparison of the factual IFN titer to sum of titers for every medicament (ST) in the concrete time of observation. Combination Sanogen&Betaleukin after 48 hours resulted to the increase of IFN activity in 64 times in comparison to the action of mono-therapy. It had been observed, that synergism index of different combination was enlarged from 4 to 32 in day 3-5 after the injection. These combinations also caused the prolongation of time circulation of active IFN. In the model of mortally infected mice the synergism of anti-virus effect of IFN inductors’ combination had been also observed. (Med.ImmunoL, 2004, vol.6, № 1-2,pp 47-56)
Препараты интерферонового ряда с определенным успехом применяются в медицине. Однако большой клинический опыт показал, что их использование вызывает многочисленные побочные эффекты: от гриппоподобных до развития аутоиммунного синдрома, тромбоцитопении, сахарного диабета, импотенции, патологии щитовидной железы, а также тяжелых психических расстройств, вплоть до суицида [2, 6, И, 16, 20, 22, 41].
Адрес для переписки:
Ризопулу Анна Панаётовна, д.б.н.
НМЦ по молекулярной медицине М3 СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, 197083, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6/8.
Тел.: (812) 234-90-39 (раб.), или тел./факс (812) 557-40-32 (дом.).
E-mail: amarizopulu@inbox.ru или garibfiruz@inbox.ru
Тем не менее, наличие у интерферона (IFN) высокой биологической активности, в частности, противовирусного, антибактериального, противоопухолевого и иммуномодулируюшего действий, привлекают внимание клиницистов [31, 37, 39].
Альтернативным путём, лишенным указанных недостатков, присущих экзогенному IFN, является стимуляция синтеза эндогенных IFN в организме, которая осуществима с помощью интерфероногенов. Интерфероногены - вещества природного или синтетического происхождения, способные индуцировать в организме человека продукцию IFN [5, 7,14]. К сильным а-, и (3-интерфероногенам относят вирусы и нуклеиновые кислоты, двухспиральную РНК, а к индукторам «иммунного» IFNy - митоге-ны Т- и В-клеток, антигены бактериальной и вирусной природы (стафилококковый энтеротоксин А, столбнячный и дифтерийный анатоксины, вакцины) [4, 28]. Аналогичным действием обладают цитоки-ны - координаторы и эффекторы сано- и патогенных реакций, в частности, IL-1 [2, 9]. IFNa продуцируется дендритными и клетками макрофагаль-ного ряда, IFNP - фибробластами. Источником IFNy являются ТЫ клетки и NK лимфоциты [33].
Гены, регулирующие интерфероногеиез - IFNa и (3, расположены в 9 хромосоме, IFNy кодируется генами, локализованными в 10 и 12 хромосомах. Специфическими праймерами обнаружены гены 9 субтипов IFNa у мышей [6,27,29].
Одним из механизмов противовирусного действия IFN является продукция Мх- и DAI- протеинов в неинфицированных клетках, соседствующих с зараженными вирусами. Обладая выраженной гомологией с ферментами, участвующими в синтезе вирусных протеинов - динаминами и VPS1, они блокируют репликацию вирусов [42].
Для большинства интерфероногенов описаны не только противовирусные, но и другие эффекты, поскольку они вызывают продукцию не только IFN, но и других цитокинов, контролирующих гемопоэз, процессы иммуногенеза и воспаления. Так, у многих природных и синтетических индукторов IFN ранее была выявлена способность индуцировать секрецию TNFa, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, колониестимулирующих факторов, компонентов комплемента, а также продуктов МНС [7,11,17,21, 33,34,36].
Среди множества обнаруженных индукторов IFN лишь немногие отвечают требованиям, предъявляемым к клинически пригодным препаратам, т.е. сочетают выраженную интерферониндуцирующую способность и относительную безопасность применения. Опыт местного и системного использования индукторов IFN с лечебной целью свидетельствует о достаточно выраженной их эффективности при вирусных гепатитах, гриппе и др. инфекциях [5,7,9,18].
Учитывая широкий спектр биологических эффектов индукторов IFN и вовлеченность системы
1РН в сано- и патогенез не только вирусных, но и аллергических, аутоиммунных, иммуиодефицит-ных заболеваний, а также перспективу их практического использования, стало очевидным, что поиск новых интерфероногенов, изучение механизмов их действия и обеспечение пролонгации синтеза эндогенного 1РЫ, представляются весьма актуальными.
Цель исследования - оценить эффективность интерфероногенеза и противовирусное действие под влиянием Саногена, Беталейкина, Циклоферона и их сочетаний в эксперименте.
Материалы и методы
Оценка индукции интерферона и антивирусного действия [8]
Использованы белые мыши с массой тела 18-20 г, которым вводили внутрибрюшинно: Саноген (1, 2 или 4 мкг/кг); Беталейкин (10, 20 или 30 нг/кг); Циклоферон (4 мг/кг). Сыворотку получали после декапитации (с учетом требований гуманного отношения к животным) через 4,12,24 ,48,72 и 96 часов после введения препаратов. Для каждой пробы использовано по 5-6 мышей.
Титрование IFN в сыворотке проводили по подавлению цитопатического действия тест-вируса на первично-трипсинизированных клетках фибробла-стов эмбрионов мышей. За титр интерферона принимали то максимальное разведение, которое защищало 50% клеток от цитодеструктивного действия вируса энцефаломиокардита мышей (штамм «Колумбия») и выражали в титрах ИЕ /мл (ед).
Определение антивирусного действия проводили на модели гепатита мышей (штамм «Мшцери-на»). Активность вируса составляла 6,0 ^ ЬО50/>п. Препараты вводили по профилактической (за 24 и 4 часа до заражения) и по терапевтической (через 4 и 24 часа после заражения вирусом) схемам. Контрольной группе мышей вводили только вирусы. Оценивались выживаемость, процент защищенных (опыт-контроль) и средняя продолжительность жизни при наблюдении в течение 14 суток.
Использованные препараты
Циклоферон - классический низкомолекулярный индуктор эндогенного 1РИ, относящийся к классу акридонов. Препарат индуцирует синтез раннего ПТ^а и с успехом применяется в клинической практике для лечения вирусных заболеваний [5,10, 14,18]. В наших исследованиях циклоферон использовался как препарат сравнения.
Препарат Беталейкин является лекарственной формой рекомбинантного интерлейкина-1(3 человека. Благодаря широкому спектру биологической активности, в т.ч. индукции интерфероногенеза, он
служит одним из основных медиаторов развития защитных реакций организма [15].
Разработанный нами лечебный препарат Сано-ген - низкомолекулярный синтетический аналог природного трипептида из фетального тимуса (пр-ва НПП «Иммуномед», Узбекистан). Препарат назначается в качестве гепатопротекториого средства, имеющего также противовоспалительное и иммунокорригирующее действие [4], на основании чего мы предположили, что у него может проявиться и интерфероногенная активность.
Результаты
Количественная оценка индукции ^ Саногеном, Беталейкином и Циклофероном при раздельном и сочетанном введении экспериментальным животным
Для определения оптимальных интерфероногенных доз препараты вводили мышам внутрибрюшин-но однократно: Беталейкин в дозах 10, 20 или 30 нг/кг массы тела; Саноген - 1, 2 или 4 мкг/кг массы тела. Установлено, что Беталейкин в использованных дозах индуцирует продукцию 1РЫ в течение 96 часов (срок наблюдения); максимальный титр отмечен через 12 часов и достигал 512 ед. при дозе 10 нг/кг. Средний титр составил 118±16 ед. (рис.1, 3). Саноген также обладал достаточно выраженными интерфероногенными свойствами -максимальный титр составил 128 ед. через 24 часа
Время после индукции,ч
Рис. 1. Динамика активности сывороточного интерферона умы-шей после однократного раздельного внутрибрюшинного введения Саногена (С), Беталейкина (Б) и Циклоферона (Ц) в эффективных дозах: 2 мкг/кг; 10 нг/кг и 4 мкг/кг соответственно.
со средним значением 47±4 ед. при дозе 2 мкг/кг (рис.1, 3).
Следовательно, эффективными дозами препаратов являются: Беталейкин - 10 нг/кг; Саноген -2 мкг/кг при однократном внутрибрюшинном введении. Препараты в указанных дозах были изучены в сравнительном тестировании, включавшем также их сочетания. При использовании монопрепаратов наболее эффективным был Циклоферон - максимум 1РЫ составил 1024 ед. через 48 часов. Под его влиянием средний титр при 120-часовом наблюдении был 295±35 ед. (рис.З).
Одновременное введение Беталейкина и Саногена резко увеличивало активность сывороточного 1РЫ в среднем до 457±60 ед. (рис.З) Ожидаемый прирост должен был составить в среднем 128 ед. (100 ед. Беталейкин + 28 ед. Саноген), т.е. он оказался выше аддитивного значения в 3,6 раза. Синергизм проявился также в накоплении максимального титра 1РЫ до 2048ед, что в 3,2 раза выше ожидавшегося (512 ед.+128 ед.=640ед.) (рис.2). Произошло также смещение пика продукции 1РЫ на срок 48 часов, поскольку для Беталейкина максимум регистрировался на 12 часов, а для Саногена - на 24 часа. Нужно отметить, что уже через 4 часа после сочетанного введения индукторов активность 1Ш была довольно высокой -64 ед. (рис.2). Несмотря на раннюю индукцию, активность сыворотки оставалась значительной длительное время и даже через 120 часов составляла 128 ед., когда при раздельном введении Беталейкина и Саногена на
Время после индукции, ч
♦— С+Б Б+Ц —Лг— С+Ц
Рис.2. Динамика активности сывороточного интерферона у мышей после однократного сочетанного введения Саногена (С), Беталейкина (Б) и Циклоферона (Ц).
этот срок титры составляли только по 2 ед., т.е. синергический эффект был в 32 раза выше аддитивного.
Следовательно, при одновременном введении Беталейкина и Саногена обнаружен выраженный синергизм интерфероногенного действия, поскольку индуцируется усиленный синтез И-ТС, активность которого регистрируется с 4 до 120 часов с достижением максимума 2048 ед. через 48 часов после инъекций, более чем в 3 раза превосходящий аддитивное действие по монопрепаратам.
Введение Беталейкина с Циклофероном резко увеличивало активность сывороточного IFN в среднем до 1060±80ед. Ожидаемый прирост должен был составить 395 ед. (100 ед. Беталейкин + 295 ед. Цик-лоферон), т.е. он оказался выше аддитивного значения в 2,7 раза. Синергизм проявился также в накоплении максимального титра до 2048 ед., что в 1,3 раза выше ожидавшегося (512 ед.+ 1024 ед.=1536 ед.).
Произошло также смещение пика продукции 1РМ на срок 48 часов. Даже через 4 часа после сочетанного введения индукторов активность ШЫ была высокой и составила 256 ед., причем активность сыворотки оставалась значительной и через 120 часов составляла 512 ед. Синергический эффект на этот срок был в 32 раза выше аддитивного.
Одновременное введение Саногена и Циклофе-рона резко увеличивало активность сывороточного ШЫ в среднем до 805±75 ед., поскольку ожидаемый средний прирост должен был составить 323 ед. (28 ед. Саноген + 295 ед. Циклоферон), то он оказался выше аддитивного значения в 2,5 раза (рис.З). Синергизм проявился также в накоплении максимального титра П-Ы до 2048 ед., что в 1,8 раза выше ожидавшегося (128 ед. + 1024 ед.). Пик продукции регистрировался на срок 48 часов, что соответствовало периоду максимальной активности сыворотки
Титр активности 1РЫ, ед
Рис.З. Средние значения титров сывороточного интерферона за 5 суток после раздельного и сочетанного введения мышам Саногена (С), Беталейкина (Б) и Циклоферона (Ц).
-С+Б
-С+Ц-
-Б+Ц
Рис. 4. Синергическое или антагонистическое интерфероногенное действие Саногена (С), Беталейкина (Б) и Циклоферона (Ц) при однократном одновременном введении (формулы расчетов приведены в тексте).
при введении Циклоферона. Нужно отметить, что уже через 4 часа после сочетанного введения указанных индукторов активность 1РЫ была наиболее высокой - 256 ед. (рис.2). Несмотря на раннюю и весьма выраженную индукцию, активность сыворотки оставалась значительной весь период наблюдения, и даже через 120 часов составляла 256 ед. (рис.2), тогда как при раздельном введении Сано-гена или Циклоферона титры составили только по 2 ед. и 16 ед. (рис.1),т.е. синергический эффект был в 14 раз выше аддитивного (рис.4).
Следовательно, при одновременном введении Саногена и Циклоферона обнаружен выраженный синергизм в индукции эндогенного 1РМ, поскольку отмечен синтез 1Щ высокая активность которого регистрируется в циркулирующей крови с 4 до 120 часов с достижением максимума 2048 ед. через 48 часов после инъекций, в 1,8 раза превосходящую аддитивное действие при их раздельном использовании.
Для количественной оценки активности интер-фероногенеза под влиянием монопрепаратов и их сочетаний, мы рассчитали средние значения по срокам исследования за 5 суток по каждому варианту (рис. 3). Установлено, что из монопрепаратов наиболее активен Циклоферон (295±36 ед.). Все использованные сочетания препаратов оказались более сильными интерфероногенами по сравнению с ним. Под влиянием Саногена с Беталейкином средняя активность интерфероногенеза составила 457±45 ед., Саногена с Циклофероном - 805±56 ед., а Беталейкина с Циклофероном -1060±52 ед.
Согласно результатам, полученным в ходе исследования, интерфероновый ответ организма на сочетанное введение этих препаратов характеризуется продолжительной (до 120 часов) циркуляцией интерферона в кровотоке. В связи с этим для оптимизации схем применения индукторов проведено изучение закономерностей продукции интерферона.
Очевидно, что синергический эффект проявляется не только однонаправленностью действия препаратов, но и кооперативным эффектом, когда конечный показатель превышает сумму результатов при использовании препаратов по отдельности. Используя значения по активности интерферона при раздельном и сочетанном введении препаратов, можно количественно определить индекс синергизма (Ис) по формуле: Ис=А:(Б+В); напротив, индекс антагонизма (Иа) оценивается по формуле : Иа“(Б+В):А, где А - результат действия сочетанного введения препаратов; Б и В - результаты действия при их раздельном введении. Указанным способом были рассчитаны Ис и Иа (рис. 4).
При сочетанном использовании Саногена, Беталейкина в оптимальных дозах, было отмечено, как правило, резкое усиление интерфероновой активности сыворотки подопытных животных на сроки 48, 72, 96 и 120 часов, с максимальным индексом синергизма - 64 через 2 суток и весьма высоким -по 32 на 3, 4 и 5 сутки после воздействия (рис.4). Интересно отметить, что через 12 часов после введения препаратов интерфероновый суммарный ответ был в 8,5 раза ниже ожидаемого при их раздель-
ш
I о5 5
X
0)
3
X
3
и
м
70
60
50
40
30
20
10
0
ЯГ
1 I I
<Ъ'
/
Введение индукторов до или после заражениям
□ Б ■С □Ц В Б + С
Рис. 5. Противовирусное действие Саногена (С), Беталейкина (Б), Циклоферона (Ц) или Саногена с Беталейкином (С+Б) при заражении мышей вирусом; 1 вариант (-4 ч Б и +24 ч С); 2 вариант (-24 ч Б и + 4 ч С).
ном применении. Так, на этот срок под влиянием Беталейкина содержание сывороточного IFN составило 512 ед., Саногена - 32 ед„ а при совместном введении ожидалось аддитивное действие -544 ед. Фактическое содержание IFN на этот срок составило только 64 ед. На сроки 4 и 24 ч синергический или антагонистический эффекты не проявлялись, т.е. фактическая и ожидаемая индукция совпали.
При совместном введении Беталейкина с Цик-лофероном синергический эффект наблюдался почти во все сроки наблюдения (кроме 12 часов), достигал наиболее высоких величин на 3, 4 и 5 сутки, когда индекс синергизма нарастал в геометрической пропорции: 7,15 и 29 соответственно.
Синергическое индуктивное действие Саногена с Циклофероном проявилось уже с 4 часов после введения, когда оно составило 3,6. В последующие три срока показатель изменялся незначительно, но с 3,4 и 5 суток индекс синергизма возрос в геометрической прогрессии: 4, 8 и 14 соответственно.
Сочетание Саноген+Беталейкин имело значительно более высокий средний синергический индекс на все сроки наблюдения - 26,2±2 по сравнению с другими: Беталейкин+Циклоферон - 9± 1,5 и Саноген+Циклоферон - 5±0,4. Различия между группами достоверны (Р<0,001).
Изучение противовирусного действия препаратов
Противовирусное действие препаратов Беталей-кин и Саноген в системе in vivo изучали на модели экспериментального гепатита мышей. Контрольной группе мышей вводили только вирусы. Оценивались выживаемость, процент защищенных (опыт-контроль) и средняя продолжительность жизни при наблюдении в течение 14 суток.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что в контрольной группе выжило 10% мышей. Это означает правильный выбор заражающей дозы вируса. При использовании монопрепаратов наиболее выраженный защитный эффект наблюдался при введении Беталейкина за 24 часа до заражения мышей вирусом гепатита. В этом случае наблюдалась защита 40% животных, что не отличалось от Циклоферона (рис. 5).
Однако эффективность защиты во многом зависела от срока инъекции Беталейкина по отношению к введению вируса: за 4 ч и через 4 ч защита резко снижалась, а через 24 ч составила всего 10%. Аналогичная зависимость отмечена у Циклоферона, когда его действие было выраженным только при введении за 24 ч и после 24 ч.
Максимальная противовирусная активность Саногена составила 30% над показателями контроля, причем она была достаточно стабильной и прояв-
лялась как за 24 ч, так и через 4 ч и 24 ч после вирусной инвазии, причем, на срок 4 ч его защитное действие превосходило Беталейкин и Циклоферон.
Усиление защитного противовирусного действия было достигнуто при сочетанном введении препаратов - до 60%. Оптимальной оказалась следующая схема: Беталейкин был введен за 24 ч и Саноген - через 4 ч. При оценке противовирусной активности изучаемых препаратов нужно учесть, что при защите более 30% мышей препараты считаются активными [8].
Другим классическим количественным методом оценки противовирусного действия препаратов является регистрация продолжительности жизни мышей, зараженных патогенным штаммом вируса. В нашем эксперименте проводилось изучение средней продолжительности жизни одновременно с противовирусной защитой. Эффект действия препарата выявлялся по разнице Опыт - Контроль. Наибольшее удлинение продолжительности жизни было при введении Циклоферона, Беталейкина или Саногена за 24 ч до заражения: 7,1±0,6; 7,0±0,6 и 6,4±0,5 суток соответственно, что достоверно не отличимо между группами, но достоверно различимо с контролем - 5,2±0,5 (Р<0,01). Другие схемы использования монопрепаратов ненамного удлиняли продолжительность жизни зараженных животных. Такой результат представляется интересным в том плане, что изучаемые препараты не проявляли токсичности у смертельно больных мышей.
Как было отмечено ранее, сочетанное применение препаратов повышало число защищенных животных до 60% при использовании варианта 2 (рис.5). На основании этого можно полагать, что указанный вариант сочетанного введения мышам Саногена с Беталейкином проявился в удлинении их жизни. Действительно, в этом случае показатель составил в среднем 7,3±0,7 суток, что на 2,1 суток дольше, чем в контроле - 5,2±0,5 (Р<0,001).
На основе полученных результатов можно заключить, что при комбинации препаратов Саногена, Беталейкина и Циклоферона удается достичь выраженного противовирусного терапевтического эффекта, что хорошо согласуется с результатами, которые получены при изучении интерферониндуци-рующей активности исследуемых соединений при аналогичной их комбинации.
Обсуждение
По данным литературы, при оценке индукторов интерфероногенеза в опытах на животных, активными считают препараты, под влиянием которых продуцируется 32-100 ед., а высокоактивными - более 100 ед. 1РЫ [8]. В связи с чем, изученные нами препараты, включая Саноген, можно отнести к высокоактивным индукторам 1РЫ. Если для Беталей-
кина и Циклоферона мы подтвердили известный эффект интерфероногенеза, то для Саногена он обнаружен впервые.
С научной точки зрения представляет интерес, что синтетический аналог трипепта фетального тимуса Саноген обладает индукторными свойствами. Известно, что пептиды тимуса обладают выраженным плейотропным действием - иммуномодулиру-ющим, гемопоэтическим, нейроэндокринным, дифференцирующим, детоксицирующим (усиление мо-нооксигеназной системы), регенераторным, интер-фероииндуцирующим и др. [1, 3,12, 28], регуляторное действие тимусных пептидов реализуется через специфические клеточные рецепторы [40]. Не исключено, что одним из претендентов на роль тимусного индуктора интерфероногенеза может стать Саноген.
Нужно признать, что при изучении биологической целесообразности конкретного пептидного регулятора возникли проблемы из-за его способности взаимодействовать с разными по структуре рецепторами, локализованными на многих клеточных популяциях. Это зависит не только от его первичной структуры, но и от стереохимичес-кой конфигурации и объемного рисунка распределения электрических зарядов [12, 30]. Кроме того, на примере индукции интерфероногенеза наблюдаются центробежные механизмы разнонаправленного синтеза не только 1РЫ, но и других цитокинов (Н--1, И-4, 1Ь-8, ТЫБа и др.), самодостаточных для развития цепных реакций продукции эффекторных и/или регуляторных молекул с широким и непредсказуемым спектром действия [9, 15, 19, 23, 24, 35, 38].
Нами получены новые данные о возможности усиления и пролонгации индукторных свойств Циклоферона, Беталейкина и Саногена при комбинированном применении. При их раздельном введении сроки максимального содержания в сыворотке 1РИ составили 48, 24 и 12 часов. Это свидетельствует о разных механизмах их индуктивного действия, что представляется немаловажным в свете разработки новых подходов к повышению эффективности клинического применения индукторов 1РЫ с целью преодоления рефрактерности к конкретным интерфе-роногенам.
Известно, что синтез 1РИ обеспечивается многочисленными популяциями клеток, которые получают через рецептор сигнал, транслируемый в ядро и активирующий конкретные гены [26, 29,32, 43]. Интересно, что 1РМ, в свою очередь, является индуктором 1РК Благодаря вовлечению новых клеточных популяций в синтез происходит увеличение его концентрации в циркуляции. Обратная регуляция процесса обеспечена накоплением в крови репрессоров трансляции, которые инактивируют и-РНК и снижают скорость синтеза 1РЫ. Насту-
пает фаза рефрактерности, когда повторное введение того же индуктора не усиливает продукцию IFN, пока не завершится фаза гипореактивности [6,
7, 18]. По наблюдениям клиницистов, применение IFN пролонгированного действия, повышает его эффективность. Очевидно, что для оптимизации применения индукторов IFN необходимы новые подходы для преодоления гипореактивности. Результаты нашего исследования показали, что комбинированное попарное введение Циклоферона, Беталейкина и Саногена позволяет не только преодолеть фазу рефрактерности, ио и усилить синтез и пролонгировать циркуляцию IFN в высоких титрах. Уже через 4 ч после введения индукторов активность эндогенного IFN в крови была высокой и составила 64 ед„ нарастала в геометрической прогрессии и через 48 ч достигла пикового значения в 2024 ед., затем заметно снижалась, но и через 5 суток (срок наблюдения) была весьма высокой. Указанная динамика отмечена нами впервые в сочетаниях: (Саноген+Циклоферон) и (Беталейкин+ Циклоферон). Важно отметить, что при комбинированном применении препаратов отмечен кооперативный эффект в продукции IFN, который количественно оценен нами как индекс синергизма: отношение титров IFN при комбинации препаратов по сравнению с суммарной (ожидаемой) активностью IFN при их раздельном введении. Максимальный индекс синергизма - 64 (!) был зарегистрирован в комбинации Беталейкин+Циклоферон на срок 48 часов. Только в таком сочетании после инъекции проявилось антагонистическое взаимодействие, когда фактический титр IFN оказался в 8 раз ниже ожидавшегося на срок 12 часов. Антагонизм индукторов IFN возможно проявляется вначале на уровне продукции различных цитокинов, обладающих противоположным действием [24, 33, 36].
При использовании другого показателя - расчета средних титров за период наблюдения эффект синергизма действия индукторов IFN проявился также четко. С учетом данных о тканеспе-цифичности индукторов [7] можно полагать, что синергизм индукторов с разными механизмами действия связан с синтезом IFN в нескольких тканях одновременно, что приводит к накоплению IFN в циркуляции и регистрируется длительное время.
В наших предыдущих исследованиях была обнаружена костимулирующая активность Иммуно-модулина (в состав которого входит трипептид, синтетический аналог которого назван Саноге-ном) на модели лимфобластогенеза в системе in vitro, когда существенно усиливался ответ лимфоцитов человека на ФГА в субоптимальной дозе. Причем, монопрепарат достоверно не стимулировал включение 3Н-тимидина в ДНК, а его дей-
ствие проявилось только в присутствии индуктора бластогенеза [13]. Аналогичная ситуация наблюдается по влиянию Саногена на интсрфероно-генез - мононрепарат индуцирует относительно невысокий ответ, но в комбинации усиливает действие Циклоферона в 4-14 раз в зависимости от сроков наблюдения.
С позиций перспективности изучения комбинации индукторов для клинического использования мы исследовали их противовирусное действие на классической модели, рекомендованной для оценки новых лекарственных средств [8]. Циклоферон, Беталейкин и Саноген, введенные раздельно, обладали сравнимым выраженным противовирусным действием, что проявилось в увеличении выживаемости, защищенности и сроков продолжительности жизни зараженных вирусом мышей относительно контроля. Указанные препараты, включая Саноген, можно считать активными, т.е. они защищают более 30% смертельно зараженных вирусами мышей [8].
Максимальный защитный эффект проявился в сочетании Саноген+Беталейкин, когда из числа смертельно зараженных мышей выжило в опыте на 60% больше, чем в контроле. Следовательно, синергизм действия изучаемых комбинаций индукторов IFN проявляется также на уровне защиты организма от вирусной инфекции, что, очевидно, связано с их повышенной способностью запускать синтез IFN в разных тканях, который предотвращает репликацию вирусов в иезаражениых клетках, стимулирует активность натуральных киллеров, ТЫ и цитотоксических CD8 лимфоцитов, вызывает цепные реакции в продукции цитокинов. С фармакологической точки зрения следует учесть, что взаимодействие указанных лекарственных средств не вызывает побочных эффектов.
Предположительно, найденные нами комбинации индукторов IFN с выраженным синергизмом действия, который проявился в резком повышении титров и удлинении сроков циркуляции IFN в кровотоке, а также в выраженном противовирусном эффекте могут иметь клиническое применение, но при условии, что их главное преимущество - более выраженный интерфероногенез и антивирусная активность будут доказаны в процессе клинических испытаний и окажутся безопасными для больного. Такая перспектива весьма заманчива, поскольку до клинического применения дошли только несколько индукторов IFN [7]: природные полимеры двуспиральной РНК (Ларифан, Ридо-стин); низкомолекулярные природные растительные полифенолы - производные госсипола (Каго-цел, Рагосин, Гозалидон, Саврац, Мегасин); синтетические низкомолекулярные: флуореолы (Амиксин), акридоны (Камедон, Циклоферон, Неовир).
Полученные нами данные о достаточно выраженных интерферониндуцирующих свойствах, разработанного нами Саногена и его комбинаций с известными индукторами - Циклофероном и Беталейки-ном, могут иметь практическое применение при лечении инфекционной патологии, в особенности вирусных гепатитов, когда сочетание гепатопротектор-ного, противовоспалительного, противовирусного, иммуномодулирующего и дезинтоксикационного механизмов действия, при отсутствии токсичности и побочных эффектов, обеспечат развитие саноге-нетических процессов в организме больного.
Список литературы
1. Арион В.Я. Иммунологически активные факторы тимуса//Иммунология/ВИНИТИ. М., 1981.-Т.9. С. 10-50.
2. Виноградова Е.Н. Вирусные гепатиты В и С (проблемы диагностики и терапии): Автореф. диа-д-ра мед. наук. - СПб. - 1997. - 15 с.
3. Гариб Ф.Ю., Гариб В.Ф. Иммуиомодулин. Ташкент, Из-во мед. литературы им. Абу Али ибн Сино. 2000, 240 с.
4. Гариб Ф.Ю., Ризопулу А.П., Петрова Т.А., Каххаров Б.А., Вас1атсЫап М. Оценка иммуностимулирующий эффективности синтетической фракции иммуномодулина // Медицинская иммунология. - Материалы 6 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2002.-т.4. №2. С. 356.
5. Горячева Л.Г., Ботвиньева В.В., Романцов М.Г. Применение циклоферона в педиатрии.- Москва-Санкт-Петербург, 2004. - 109 с.
6. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. - Москва: Медицина, 1995,- 240 с.
7. Ершов Ф.И., Тазулахова Э.Б. Индукторы интерферона - новое поколение иммуномодуляторов/ /Тегга Medica.-1998.-2.- с. 2-7.
8. Ершов Ф.И.,Парфенов В.В. Методические указания по изучению специфической активности ин-терферонов и индукторов интерферона. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Ремедиум . - 2000, С. 281-286.
9. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. - СПб: Гиппократ, 1992,- 256 с.
10. Коваленко А.Л., Романцов М.Г., Ершов Ф.И. Акридонуксусная кислота: фармакологические свойства и результаты клинического применения //Журнал микробиологии, эпидемиологии и имму-1юлогии.-2000.-5.-с. 103-108.
11. Латаш В.Г., Кузнецов С.И. Система интерферона у больных хроническим вирусным гепатитом С при интерферонотерапии Реафероном. Медицинская иммунология.- 2003,- №5-6. - с.577-582.
12. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики,- СПб.- Наука,- 2000,-158 с.
13. Ризопулу А.П., Гариб Ф.Ю., Кахаров Б.А Влияние иммуномодулина (пептидов из фетального тимуса) на пролиферативный ответ Т- лимфоцитов и цитотоксическую активность натуральных киллеров в системе in vitro.-Медицинская иммунология.-2004.- (принята в печать).
14. Романцов М.Г. Интерфероногены: перспективы клинического применения.- СП6.-1998.
15. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1: от эксперимента в клинику // Медицинская иммунология, 2001.-Т.З, №3, С.431-438.
16. Соколова Е.С., Тотолян Н.А., Клименко В.М. Терапия интерфероном бета изменяет психоэмоциональное состояние пациентов с рассеянным склерозом. Цитокины и воспаление. 2003., Т-2„ №3, с.57-58.
17. Тазулахова Е.Б., Сорокин А.М. - Взаимосвязь и взаимоотношение между системами интерферона и иммунитета - В кн: Система интерферона в норме и при патологии. - М., Медицина, 1996, С. 88-115.
18. Тимченко В.Н., Романцов М.Г. Применение циклоферона в практике врача-педиатра. Методические рекомендации для врачей-педиатров и студентов медицинских ВУЗов,- Санкт-Петербург,-2000.
19. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: Руководство для врачей,- СПб., 1998.-113 с.
20. Эттингер О.А., Никитин И. Г., Сторожаков Г.И. Аутоиммунные поражения щитовидной железы как осложнения терапии интерферонами хронических вирусных гепатитов.// Терапевтический архив. - 1999. - 71,12. - с.69-72.
21. Akahane Y., Miyazaki Y.,Naiton S.,Takeda К., Tsuda F., Okamoto H., Itoh K., Miyakawa Y., Mayumi M. Cold activation of complement for monitoring the response to interferon in patients with chronic hepatitis С // Am. J. Gastroenterol. - 1996, № 2. -P.319-327.
22. Baron S. The interferons: mechanism of action and clinical applications. JAMA, 1991, 266: 1375.
23. Bernabei P, Allione A, Rigamonti L, et al. Regulation of interferon-gammareceptor (IFN-GammaR) chains: a peculiar way to rule the life and death of human lymphocytes. Eur. Cytokine Netw 2001; 12:6-14.
24. Debets R., Savelkoul, Cytokine antagonists and their potential therapeutic use. Immunol. Today, 1994, 15:455.
25. Delcayre A.X., Lotz М., Lernhardt W. Inhibition of Epstein-Barr virus-mediated capping of CD21/CR2 by alpha (IFN-alpha): immediate
antiviral activity of interferon alpha during the early phase of interferon // J. Virol.-1993,-Vol. 67, N 5.-P. 2918-2921.
26. Durantel D, Carrouee-Durantel S, Branza-NichitaN, Dwek RA, Zitzmann N. Expression of IFN~ gamma and its receptor alpha in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Chin MedJ (Engl). 2004 Jan; 117(1): 79-82. Antimicrob Agents Chemother. 2004 Feb; 48(2): 497-504.
27. Fung MC, Sia SF, Leung KN, Mak NK Detection of differential expression of mouse interferon-alpha subtypes by polymerase chain reaction using specific primers.: J Immunol Methods. 2004 Jan; 284(1-2): 177-86.
28. Goldstein A.L., Low T.L.K., Rossio J.L. Recent developments in chemistry and biology of thymosin// Immune modulation and control of neoplasia by adjuvant therapy/Ed. M.A.Chirigos. New York: Raven press, 1978. P.281-291.
29. Hwang S.Y., Hertzog P.J., Holland L.A. A null mutation in the gene encoding a type I interferon receptor component eliminates antiproliferative and antiviral responses to interferons and alters macrophage responses, Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:11284-11288.
30. Karelin A.A., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation// FEBS Lett. 1998.-Vol.-428.N l-2.p. 7-12.
31. Kasztelan-Szczerbinska B, Slomka M, Celinski K, Szczerbinski M. Impact of interferon-alpha therapy on the serum level of alpha-fetoprotein in patients with chronic viral hepatitis. Rocz Akad Med Bialymst. 2003; 48: 74-7.
32. Kishimoto T., Tada T„ Akira S. Cytokine signal transduction. Cell, 1994, 76 : 253.
33. Kuby T. Immunology. Freeman a. Company, New York, 1997, 664 p.
34. Lappin D.F., Birnie G.D., Whaley K. Modulation by interferon of the expression of monocyte complement gene // Biochem. J. - 1990. -Vol.268, N2,- P. 387-392.
35. Lappin D.F., Guc D., Hill A., McShane T., Whaley K. Effect of interferon-gamma on complement gene expression in different cell types // Biochem. J. -1992. - Vol. 281. - P. 437-442.
36. Minagar A., Long A., MaT., Jackson T.H., Kelley R.E., Ostanin D.V., Sasaki, Warren A.C., Jawahar A., Cappell B., Alexander J.S. Interferon (IFN)-betala and IFN-betalb Block IFN-gamma-Induced Disintegration of Endothelial Junction Integrity and Barrier Endothelium. 2003; 10(6): 299-307.
37. Muller U., Steinhoff U., Reis L.F. Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense. Science 1994; 264: 1918-1921.
38. Powrie F., R. L. Coffman. Cytokine regulation of T-cell function: potential for therapeutic intervention. Immunol. Today 1993,14: 270-279.
39. Reichel R. P., Fitz R„ Neumann R. Clinical study with recombinant interferon-gamma versus interferon-a 2c in patients with condyloma acuminata. Int. J. STD AIDS 1992; 3 (5): 350-354.
40. Rinaldi G. C., RosariaT.M., Jezzi T. Receptors for thymosin alfa-1 on mouse thymocytes// Cell. Immunol. 1985.- Vol. 91.P.289-293.
41. Saruk M. Comparison of interferon a2B monotherapy with the combination of thymosin al and interferon a2B in the treatment of anti-HBe-positive
chronichepatitis В in Turkey. Abstract№1949. Digestive Disease Week 2001. May 20-23,2001. Atlanta, GA.
42. Staeheli P., Pitossi F., Pavlovic J. Mx proteins: GTPases with antiviral activity. Trends Cell Biol. 1993 Aug; 3(8): 268-72.
43. Zhang P., Chen Z., Chen F., Li M.W., Fan J., Zhou H.M., Liu J.H., Huang Z. Expression of IFN-gamma and its receptor alpha in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Chin Med J 2004; 117(l):79-82.
поступила в редакцию 15.03.2004 принята к печати 25.03.2004
