CC BY
54
УДК 578.76
А.А. Шелемба, С.И. Колесников
ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ БЕЛКА VP24 ВИРУСА ЭБОЛА НА ИНДУКЦИЮ ИНТЕРФЕРОНА
Институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (Иркутск)
Исследована способность рекомбинантного белка vp24 вируса Эбола в вирулентной и авирулентной для. морских свинок и мышей конфигурации, воздействовать на индукцию интерферона in vivo и in vitro. Показана способность обоих вариантов белка подавлять интерфероногенез и отсутствие отличий в этой способности между вариантами белка.
Ключевые слова: вирус Эбола, белок vp24, индукция интерферона
INFLUENCE OF EBOLA VIRUS VP24 PROTEIN RECOMBINANT VERSION ON INDUCTION OF INTERFERON
Ä.A. Shelemba, S.I. Kolesnikov
Institute of clinical immunology SB RAMS, Novosibirsk Scientific Center of Family Health Problems and Human Ecology SB RAMS, Irkutsk
Recombinant protein vp24 of Ebola virus in virulent and avirulent for guinea pigs and mice configuration was investigated, in vivo and in vitro to study their ability to reduce an interferon induction. Ability of both variants of fiber to suppress induction of interferon, and absence of differences in this ability between this two protein versions was shown.
Key words: Ebola virus, vp24 protein, induction of interferon
Вирус Эбола вызывает у человека острую геморрагическую лихорадку с летальностью, достигающей 80 — 90 % [2]. Помимо тяжелых коагуляционных расстройств вирус Эбола вызывает иммуносупрессию [13], которая может иметь важное значение в развитии данного заболевания. Позднее M. Bray [6] продемонстрировал значимость интер-фероновой блокады в инфекции мышей, зараженных адаптированным к ним вирусом Эбола. Была продемонстрирована корреляция между уровнем вирулентности вируса и его способностью подавлять ИФН-зависимый противовирусный ответ [7]. Известно, что интерфероны являются важной составляющей иммунного ответа против вирусных патогенов (как и бактериальных и онкологических угроз организму хозяина).
Ранее было показано [14, 15], что адаптация вируса Эбола к морским свинкам, сопровождающаяся ростом вирулентности для этих животных, коррелирует с появлением единичной замены в геноме белка vp24. Также существуют данные, что белок vp24 является антагонистом ИФН-зависимой системы противовирусной защиты организма хозяина [12]. Сопоставив эти и ранее приведенные данные об интерфероновой природе иммунопатогенеза лихорадки Эбола, мы в данном исследовании сделали попытку оценить влияние рекомбинантного белка vp24 Вируса Эбо-ла в авирулентной и вирулентной конфигурации на интерфероногенез. Для этого in vivo и in vitro исследовали влияние рекомбинантных белков vp24^ и ,ур24-8мс ВЭ на индукцию интерферона ридостином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Рекомбинантные белки vp24^ и vp24-8MC Вируса Эбола.
В работе использовали два рекомбинантных белка vp24 вируса Эбола, сконструированных в летальной (штамм 8 мс) и не летальной (дикий штамм Заир) для морских свинок последовательности нуклеотидов, отличающихся в позиции 186 заменой His в не летальной конфигурации на Tyr в летальной. Дикий и адаптированный геномы белка vp24 вырезаны из кДНК соответствующих штаммов вируса Эбола с использованием ферментов рестрикции Xbal и Bgll, и встроены в плазмиду pQE(30-32) фирмы Qiagen, USA. Плазмиды, в свою очередь встроены в E. coli штамм M15. Наработка и очистка рекомбинантных белков проведены с использованием набора QIA express фирмы Qiagen на хроматографической колонке со смолой Ni-NTA в 8M мочевине. Рекомбинантные белки диализованы против физиологического раствора и получили наименование vp24^ для конфигурации соответствующей дикому штамму и vp24-8мс для адаптированного штамма вируса Эбола. Рекомбинантные конструкции были любезно предоставлены из лаборатории особо опасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».
Животные
В экспериментах использовано 40 мышей линии Balb/c. Животных получали из вивария Института клинической иммунологии г. Новосибирска и содержались на стандартном рационе. Эксперименты проводили в соответствии «Правилами проведе-
ния работ с использованием экспериментальных животных». Инъекции проводили в заднюю лапу в объеме 0.2 мл. Кровь отбирали капилляром из прокола в бедренной вене.
Оценка индукции интерферона в системе in vivo
Эксперименты проводили согласно методическим подходам, использованным Ф.И. Ершовым и
В.В. Парфеновым [1]. Белым беспородным лабораторным мышам массой 18 — 20 г вводили внутримышечно однократно индуктор интерферона ри-достин и vp24^ либо vp24-8мс в количестве 10 мкг на животное в объеме 0,2 мл физиологического раствора. Сыворотку получали, отбирая кровь капилляром из надреза вены бедра через 4, 24, 48 и 72 ч после введения препаратов. Численность животных в группе составляла по 10 мышей. Всего сформировано три группы: ридостин, ридостин и vp24^, ридостин и vp24-8мс. Титрование сывороток проводили по подавлению цитопатического действия тест-вируса на перевиваемой культуре фибробластов легких эмбрионов мышей L929. Для этого в плоскодонные полистироловые планшеты с монослоем фибробластов вносили по 100 мкл сыворотки, разведенные в безсывороточной среде от 1 : 20 до 1 : 1000. Планшет инкубировали 24 ч (37 °С, 5% СО2) после чего в лунки вносили вирус энцефаломиокардита мышей (штамм «Колумбия») в количестве, вызывающем цитопатогенное действие 100 % фибробластов (ЦПД100). Планшет инкубировали 24 ч (37 °С, 5% СО2). За титр противовирусной активности принимали максимальное разведение сыворотки, которое защищало 100 % фибробластов от цитодеструктивного действия вируса и выражали в интерфероновых единицах (ИЕ) на пробу.
Оценка индукции интерферона в системе in vitro
Кровь интактных беспородных мышей в объеме 200 мкл смешивали с 800 мкл среды RPMI 1640. Затем добавляли ридостин и вносили препараты vp24^ либо vp24-8мс из расчета 1 мкг/мл. Инкуби-
ровали при 37 °С и 5% СО2 отбирая образцы через 24 часа. Надосадочную жидкость титровали на противовирусную активность, как описано выше. Ранее выявлено, что сами препараты в исследуемых концентрациях не оказывают цитопатического действия на клетки.
Индуктор интерферона
В качестве индуктора интерферона использован ридостин (натрия рибонуклеат) производства Вектор-фарм, Новосибирск. Препарат растворяли в воде для инъекций.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе исследовали уровень индукции интерферона ридостином в сыворотке мышей. Для этого вводили мышам ридостин в дозе 10 мкг внутримышечно в заднюю лапу. Срок наблюдения 72 часа после введения. Сыворотки отбирали через 4, 24, 48 и 72 часа после введения ридостина. Отмечен интерфероногенный эффект (рис. 1) с максимальным титром антивирусной активности через 48 часов после введения препарата. Далее препарат вводили одновременно с vp24-д или ур24-8мс по 10 нг на животное.
Как видно из графика (рис. 1) одновременное введение индуктора интерферона ридостина и рекомбинантного белка vp24 как в авирулентной так и в вирулентной конфигурации приводит к подавлению индукции интерферона. При этом не отмечено статистически достоверных отличий влияния авирулентной и вирулентной для морских свинок конфигурации vp24 на подавление интерфероногенной способности ридостина.
Также исследована способность рекомбинантных вариантов белка ур24 подавлять синтез интерферонов клетками крови интактных животных. Исследование выполняли по схеме: в образцы крови, разведенной 1/5 средой ЯРМ1 1640 вносили ридостин и инкубировали при 37 °С и 5% СО2 в течение 24 часов. Через указанное время отбирали надосадки и вносили на сформированный монослой перевиваемой культуры фибробластов
ридостин —□— ридостин+vp24-д —Д— ридостин+vp24-8мс
Рис. 1. Динамика содержания противовирусных интерферонов в сыворотке мышей после введения ридостина, ридости-на+ vp24-д и ридостина+vp24-8мс. На оси абсцисс отмечены сроки после введения препаратов, на оси ординат -противовирусная активность индуцированного интерферона в сыворотке в интерфероновых единицах (ИЕ).
Рис. 2. Противовирусная активность На оси абсцисс отмечены сроки после введения препаратов, на оси ординат - противовирусная активность индуцированного интерферона в сыворотке в интерфероновых единицах (ИЕ).
легких эмбрионов мышей L929 в разведениях от цельного до 1 : 300. Через 24 часа вносили ЦПД100 вируса энцефаломиокардита мышей. Выявив таким образом уровень антивирусной интерферон индуцирующей активности (рис. 2), опыт повторили, введя одновременно две дополнительные группы, где в образцы крови добавляли помимо ридостина по 1 мкг/мл \р24-д или ур24-8мс.
Одновременное введение ридостина и рекомбинантного белка \р24-д или \р24-8мс приводила к полному подавлению антивирусной интерферо-новой активности супернатантов крови. При этом не выявлено достоверного отличия в способности подавлять интерфероногенную активность между рекомбинантными аналогами белков ур24-д и ур24-8мс,
Геном вируса Эбола подавляет продукцию клетками альфа/бэтта интерферонов [5, 8, 9, 10] и блокирует способность клеток реагировать на интерфероны альфа, бэтта и гамма. Белок вируса Эбола с молекулярным весом 35 кДа (vp35) осуществляет механизм противодействия блокируя как продукцию интерферонов а/p, так и клеточный ответ на применение интерферонов а/p и у. Процитированные исследования показали, что инфекция Эбола сопровождается значительным ростом содержания в крови уже через 24 часа многих цитокинов (MCP-1, MIP-1alpha, RANTES, and TNF-alpha). В то же время интерфероны а и Р, интерлейкины 1р и 10, не продуцируются при инфицировании. Более того, с помощью двуспиральной РНК клетки макрофагальной системы подавляют индукцию интерферона альфа. То же показано для эндотелиальных клеток. Было продемонстрировано, что ингибирующее воздействие VP35 осуществляется активацией интерферон регулирующего фактора (interferon regulatory factor 3 (IRF-3) [3, 4, 11]. Показано, что vp35 последовательно блокирует индукцию двуспиральной РНК нейтрализуя вирус индуцированный ответ репортерных генов и наработку промоутеров интерферона. Таким образом, vp35 вирус Эбола подавляет индукцию интерферонов в инфици-
рованных клетках, что видимо, является важным элементом вирулентности вируса Эбола. Однако механизм, посредством которого осуществляется это подавление сигналов рецепторов интерферонов а, р и оставался неясным. S. Reid с соавторами [12] показали, что vp24 вируса Эбола ингибирует сигнальную систему интерферонов. Экспрессия vp24 приводит к подавлению генов экспрессии индуцирующих интерфероны и способность ин-терферонов индуцировать антивирусный статус клетки. Эта способность vp24 подавлять клеточный ответ интерферонов связана со способностью нарушать систему передачи генных сигналов системы интерферона STAT1, ключевой шаг в развитии ответа всех типов интерферона (а/p и у). Задачей нашего исследования было оценить наличие или отсутствие способности белка vp24 блокировать индукцию интерферонового ответа, а также выявить связано ли с этим феноменом отличие в геноме данного белка, коррелирующее с вирулентностью для морских свинок. Как видно из полученных данных белок действительно нейтрализует индукцию интерферона, однако не выявлено влияния отличий в конформации белка на антиинтерфероновую активность. Можно сделать вывод, что белок vp24 опосредует изменение вирулентности не за счет усиления антиинтерфероновых свойств, а за счет других свойств, например изменения продуктивности в клетках нового хозяина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, показано, что рекомбинантные аналоги белков vp24^ и vp24-8мс представляющие белок vp24 вируса Эбола в авирулентной и вирулентной для морских свинок и мышей конфигурации ингибируют интерфероногенез in vivo и in vitro. При этом не выявлено отличий в способности к ингибированию между этими двумя конфигурациями белков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ершов Ф.И., Парфенов В.В. Методические указания по изучению специфической активности
интерферонов и индукторов интерферонов / в кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М. : Ремедиум, 2000. — C. 281 —286.
2. Baize S. et al. Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients // Nat. Med. - 1999. - Vol. 5 (4), Apr. - P. 423-426.
3. Basler C.F. et al. The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 97. - P. 12289-12294.
4. Basler C.F. et al. The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3. // J. Virol. - 2003. - Vol. 77. - P. 7945-7956.
5. Basler C.F., Palese P. Modulation of innate immunity by filoviruses / in: Molecular and cellular biology of Marburg and Ebola viruses; eds: H.-D. Klenk, H. Feldmann. - Norfolk, United Kingdom : Horizon Scientific Press, 2004. - P. 305-349.
6. Bray M. The role of the type I interferon response in the resistance of mice to filovirus infection // J. Gen. Virol. - 2001. - Vol. 82. - P. 1365-1373.
7. Ebihara H. et al. Molecular determinants of Ebola virus virulence in mice // PLoS. Pathog. -2006. - Vol. 2 (7). - P. e73.
8. Gupta M., Mahanty S., Ahmed R., Rollin P.E. Monocyte-derived human macrophages and peripheral blood mononuclear cells infected with Ebola virus secrete MIP-1alpha and TNF-alpha and inhibit poly-
IC-induced IFN-alpha in vitro // Virology. — 2001. — Vol. 284. - P. 20-25.
9. Harcourt B.H., Sanchez A., Offermann M.K. Ebola virus inhibits induction of genes by double-stranded RNA in endothelial cells // Virology. — 1998. — Vol. 252. — P. 179—188.
10. Harcourt B.H., Sanchez A., Offermann M.K. Ebola virus selectively inhibits responses to interferons, but not to interleukin-1 ß, in endothelial cells // J. Virol. — 1999. — Vol. 73. — P. 3491 —3496.
11. Reid S.P., Cardenas W.B., Basler C.F. Homooligomerization facilitates the interferon-antagonist activity of the ebolavirus VP35 protein // Virology. — 2005. — Vol. 341. — P. 179—189.
12. Reid S.P. et al. Ebola virus VP24 binds karyo-pherin alpha1 and blocks STAT1 nuclear accumulation // J. Virol. — 2006 Jun. — Vol. 80 (11). — P. 5156 — 5167.
13. Sanchez A. et al. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.). Fields virology. — Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2001. — P. 1279 — 1304.
14. Subbotina E., Dadaeva A., Kachko A., Chep-urnov A. Genetic factors of Ebola virus virulence in guinea pigs // Virus Res. — 2010 Oct. — Vol. 153 (1). — P. 121 — 133.
15. Volchkov V.E. et al. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus // Virology. — 2000. — Vol. 277. — P. 147 — 155.
Сведения об авторах
Шелемба Арсения Александровна - аспирант Института Клинической Иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14; тел.: (383) 222-26-74; e-mail: niiki01@online.nsk.su; arseniya_sh@mail.ru)
Колесников Сергей Иванович - академик РАМН Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16; тел./факс: (3952) 20-76-36; (3952) 20-90-48; e-mail:sikol@sbamsr.irk.ru)
