CC BY
132
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.127-005.8/616-092.9
ДЫХАНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПОСТИНФАРКТНОГО СЕРДЦА КРЫС ПРИ ОКИСЛЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТОВ
М.В. Егорова, Д.С. Кондратьева, С.А. Афанасьев
НИИ кардиологии СО РАМН, Томск E-mail: mwegorova@yandex.ru
THE RESPIRATION OF POSTINFARCTION RAT HEART MITOCHONDRIA DURING THE OXIDATION OF VARIOUS SUBSTRATES
M.V. Egorova, D.S. Kondratieva, S.A. Afanasiev
Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk
Полярографически исследована скорость поглощения кислорода митохондриями (МХ) постинфарктного миокарда крыс при окислении сукцината, малата и глутамата. Показано увеличение свободного дыхания МХ, снижение степени сопряжения окисления и фосфорилирования. При окислении малата и глутамата степень нарушений выражена слабее, чем при окислении сукцината. Обсуждается предположение, что эти изменения обусловлены эндогенными жирными кислотами.
Ключевые слова: митохондрии, постинфарктный миокард, окислительное фосфорилирование, жирные кислоты.
The rate of oxygen intake by mitochondria of (MCh) postinfarction myocardium of rats during the oxidation of succinate, malate and glutamate was polarographically investigated. An increase in free respiration of MCh, reduction of the degree of coupling of oxidation and phosphorylation were displayed. The degree of impairment is less pronounced during the oxidation of malate and glutamate than during the oxidation of succinate. The assumption that these changes are caused by endogenous fatty acids is discussed.
Key words: mitochondria, postinfarction myocardium, oxidative phosphorylation, fatty acids.
Введение
Функциональная активность органов и тканей живого организма, а также согласованное развитие электрофизи-ологических процессов в клетках сопряжены с согласованным развитием многочисленных процессов, протекающих в митохондриях. Многие патологии сердечно-сосудистой системы тоже обусловлены возникновением в сердечной мышце гипоксических зон и недостаточностью продукции АТФ митохондриями [11, 14]. Естественными механизмами защиты клетки от энергетического дефицита являются понижение скорости энергетического метаболизма, замедление утилизации АТФ и развития интра- и экстрацеллюлярного ацидоза [12, 13, 16]. При сужении коронарной артерии уменьшение притока артериальной крови к тканям приводит к недостаточному поступлению кислорода и питательных веществ, что вызывает дефицит энергии вследствие снижения синтеза АТФ в митохондриях [16]. При постинфарктном кардиосклерозе даже в неповрежденных участках сердечной мышцы существенно снижены энергетические ресурсы [17].
Цель исследования: оценить способность к окислительному фосфорилированию изолированных митохондрий сердца крыс при экспериментальном инфаркте.
Материал и методы
Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар, масса 250-300 г. При моделировании постинфарктного кардиосклероза животным под эфирным наркозом вскрывали грудную клетку, пересекая два ребра. Затем осуществляли перикардиотомию и перевязку левой передней нисходящей коронарной артерии, затем рану послойно ушивали, предварительно удалив воздух из грудной полости. Через 40 суток у этих животных формировался постинфарктный кардиосклероз: морфологический контроль изменений структуры ткани миокарда осуществляли с помощью гистологических исследований, как описано ранее [6]. Для эксперимента использовали животных через 6 недель после коронароокклюзии (15 крыс). В качестве контроля использовали митохондрии,
полученные из сердца интактных животных (15 крыс).
Митохондрии сердца получали стандартным методом дифференциального центрифугирования в сахарозной среде [18], содержащей (мМ) 300 сахарозу, 10 ЭДТА, 8 трис, рН 7,4. Митохондрии суспендировали в 250 мМ растворе сахарозы.
Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически, с помощью электрода Кларка. Измерение проводили в среде, содержащей (мМ) 300 сахарозу, 10 КС1, 5 КН2РО4, 5 сукцинат (или 5 малат + 5 глутамат), 1 ЭГТА, 1,2 MgCl2, 5 трис, рН 7.4. Дыхательный контроль (ДК) определяли как отношение скорости дыхания при максимальном синтезе АТФ (т.е. в присутствии АДФ, У+АТФ) к скорости дыхания в отсутствие синтеза АТФ (V-атф) [10].
Измерения проводили в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при температуре 27 °С и постоянном перемешивании при помощи магнитной мешалки. Регистрировали скорость поглощения кислорода без АДФ и в присутствии 100 мкМ АДФ. Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (0,5-1 мг белка). Концентрацию белка в пробе определяли методом Лоури. В работе использовали реактивы фирмы Sigma и ICN. Скорость потребления кислорода приведена в нМ О2 в мин на 1 мг белка.
Анализ данных проводили с использованием методов вариационной статистики. Данные представлены в виде средних значений+стандартная ошибка среднего, уровень статистической значимости различий (p) определяли по t-критерию Стьюдента. Критическим уровнем значимости считали p<0,05.
Результаты и обсуждение
Скорость поглощения кислорода митохондриями на фоне сукцината при постинфарктном кардиосклерозе относительно контроля выше на 30% (p<0,01) При добавлении в ячейку АДФ митохондрии как контрольных, так и опытных животных значительно увеличивали скорость потребления кислорода. Прирост этого показателя в рассматриваемых группах составил около 20 единиц в обеих группах и был практически одинаков (p>0,05). Скорость поглощения кислорода митохондриями интактных крыс по исчерпании АДФ приближалась к исходному уровню. В аналогичных условиях в группе животных с постинфарктным кардиосклерозом окончательного восстановления скорости поглощения кислорода митохондриями до исходных показателей не происходило; она сохранялась повышенной относительно начального уровня.
Известно, что коэффициент дыхательного контроля непосредственно отражает степень сопряжения и фосфорилирования в митохондриях [10]. Расчет этого коэффициента, проведенный в нашем исследовании, показал, что
дыхательный контроль (при окислении сукцината) у интактных крыс был равен в среднем 3,4±0,27, а при постинфарктном кардиосклерозе составлял 2,0±0,03 (р<0,05). Низкое значение дыхательного контроля, полученное для митохондрий крыс с постинфарктным кардиосклерозом, свидетельствует о снижении степени сопряжения окисления и фосфорилирования.
В клетке процесс энергообразования может быть нарушен вследствие самых разных воздействий. Известно, что при ишемических синдромах в крови больных повышается содержание свободных жирных кислот [2, 8]. На фоне высоких концентраций СЖК блокируется поступление глюкозы в клетки, в миоплазме накапливаются токсичные продукты расщепления жирных кислот, которые разрушают клеточную мембрану [2, 15, 16]. Ранее нами было показано, что увеличение скорости поглощения кислорода изолированными кардиомиоцита-ми связано с изменением активности эндогенных фос-фолипаз [3]. По этой причине наиболее вероятным является предположение, что наблюдаемое нами разобщение окислительного фосфорилирования является следствием накопления в клетке при длительной ишемии свободных жирных кислот.
Одним из путей свободного дыхания митохондрий является возвращение протонов в матрикс, вызванное действием свободных жирных кислот [9]. Такое протонофорное разобщающее действие жирных кислот осуществляется при участии как АДФ/АТФ-антипортера, так и другого переносчика - аспартат/глутаматного антипортера [5, 9]. Клетки миокарда практически не используют аминокислоты в качестве источника энергии. Однако некоторые аминокислоты, в том числе и глутамат, играют важную роль в работе малат-аспартатного челночного механизма, который необходим для восстановления пиридиновых нуклеотидов и поддержания энергетического баланса в кардиомиоцитах, в том числе во время ишемии [19]. Было показано, что в присутствии глутама-та разобщающее действие свободных жирных кислот подавляется АДФ [5].
В нашем исследовании окислительного фосфорили-рования в присутствии малата и глутамата наблюдалось подавление свободного дыхания митохондрий крыс с постинфарктным кардиосклерозом (таблица).
Скорость поглощения кислорода митохондриями опытных крыс на фоне АДФ также была достоверно ниже
Таблица
Дыхание митохондрий сердца крыс при окислении различных субстратов
Группы животных Скорость потребления кислорода (нМ О2 в мин на мг белка)
V исх ^ДТФ ^АТФ
сукцинат мал+глут сукцинат мал+глут сукцинат мал+глут
Интактные 14,6+1,6 15,1+1,5 49,8+1,8# m гч + ,0 0, 5 14,7+1,1 15,0+1,5
ПИКС 25,2±2,0* 19,5+1,8* ,0* ГЧ + Г— 8, 5 49,5+1,9# 29,3+1,8* 19,8+1,7*
Примечание: ПИКС - животные с постинфарктным кардиосклерозом; Vисх и V±ДТФ - скорость свободного дыхания при окислении субстрата и в присутствии (исчерпании) ДДФ; мал+глут - субстрат окисления -малат с глутаматом; * - результаты статистически значимо (р<0,05) отличаются по отношению к контролю (интактные животные); # - результаты статистически значимо отличаются по отношению к Vисх (р<0,05).
(p<0,01). Однако по исчерпании АДФ наблюдалось восстановление уровня исходного дыхания, и дыхательный контроль увеличился до 2,5±0,3, что дает основание говорить о повышении степени сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях крыс при постин-фарктном кардиосклерозе. При этом нужно отметить, что не обнаружено значительного отличия скорости поглощения кислорода митохондриями интактных крыс как в присутствии сукцината, так и малата с глутаматом. Соответственно, дыхательный контроль у интактных крыс при окислении малата с глутаматом составлял 3,3±0,18 и был практически равен таковому показателю при окислении сукцината (p>0,05).
Таким образом, различие показателей дыхательного контроля у интактных крыс и при постинфарктном кардиосклерозе уменьшилось с 41% (при окислении сукцината) до 24% (при окислении малата с глутаматом).
Показанное в наших экспериментах подавление свободного дыхания в присутствии глутамата хорошо согласуется с гипотезой об участии эндогенных жирных кислот в наблюдаемом разобщении окислительного фосфо-рилирования при постинфарктном кардиосклерозе. Однако остается открытым вопрос относительно высокой скорости потребления кислорода при окислении сукци-ната после добавки АДФ в митохондриях при постинфарктном кардиосклерозе. Возможно, что показанное нами нарушение окислительного фосфорилирования связано не столько с протонофорным действием жирных кислот, сколько с накоплением продуктов перекисного окисления липидов, что, как известно, приводит к нарушению мембранных структур митохондрий [4, 15, 16]. Важной особенностью перекисного окисления жирных кислот является свободнорадикальный, цепной характер процесса. Источником свободных радикалов могут быть перекиси, образующиеся при самом процессе окисления жирных кислот, что приводит к ускорению образования новых перекисей, и в результате реакция приобретает са-моускоряющийся, “взрывной” характер [1]. Можно предположить, что стимуляция дыхания при добавлении АДФ способствовала созданию подобной ситуации. Это предположение не противоречит нашим данным о том, что в кардиомиоцитах при хронической ишемии нарушается баланс между перекисным окислением липидов и эндогенными жирорастворимыми антиоксидантами [7]. В его пользу свидетельствуют и литературные данные о значительном повышении уровня жирных кислот в крови и снижении образования макроэргов, а также повышении содержания малонового диальдегида и глутатионперок-сидазы у больных с постинфарктным кардиосклерозом [8].
Заключение
Таким образом, совокупность собственных и литературных данных подтверждает предположение, что наблюдаемое нами нарушение процессов окислительного фос-форилирования в митохондриях постинфарктного миокарда крыс связано с разобщающим действием свободных жирных кислот. Однако, поскольку процессы в изолированных митохондриях могут значительно отличать-
ся от таковых в клетке, для ответа на вопрос, по какому же из путей развивается нарушение окислительного фосфорилирования, требуются дополнительные исследования.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М. : Наука, 1972. -215 с.
2. Гринберг А. Роль липидов в метаболизме сердечной мышцы // Медикография. - 1999. - Т. 21, № 2. - С. 29-38.
3. Егорова М.В., Афанасьев С.А., Попов С.В. Роль фосфолипа-зы А2 в активации дыхания изолированных кардиомиоци-тов при постинфарктном кардиосклерозе // Бюл. экспер. биол. мед. - 2008. - Т. 146, № 12. - C. 631-633.
4. Капелько В.И. Эволюция концепций и метаболическая основа дисфункции миокарда // Кардиология. - 2005. - Т. 9.
- С. 55-61.
5. Кожина О.В., Каратецкова М.П., Самарцев В.Н. Ресопрягающее действие АДФ при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени // Биол. мембраны. - 2006. - Т. 23, № 3. - С. 213-218.
6. Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П. и др. Инот-ропная реакция миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом на экстрасистолические воздействия // Бюл. экспер. биол. мед. - 2005. - Т. 6. - С. 613-616.
7. Лебедев А.В., Афанасьев С.А., Алексеева ЕД. Влияние возраста и ишемии на липопероксиды и липидорастворимые антиоксиданты сердца человека // Бюл. экспер. биол. мед. -1995. - Т. 6. - С. 584-586.
8. Молчанов С.Н., Люсов С.А., Говорин А.В. и др. Сывороточные липиды при различных стадиях и морфофункциональных типах сердечной недостаточности у больных, перенесших инфаркт миокарда // Рос. кардиол. журнал. - 2005. -Т. 2. - С. 10-17.
9. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот // Биохимия. - 2005. - Т. 70, № 2. -С. 197-202.
10. Николс Д.Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. - М. : Мир, 1985. - 190 с.
11. Опи Л.Х. Особенности метаболизма миокарда при ишемической болезни сердца // Медикография. - 1999. - Т. 21, № 2. - С. 2-4.
12. Писаренко О.И. Ишемическое прекондиционирование: от теории к практике // Кардиология. - 2005. - Т. 9. - С. 6272.
13. Таминова И.Ф., Гарганеева Н.П., Ворожцова И.Н. Оценка аэробного энергообразования и уровня физической работоспособности по результатам велоэргометрии у высококвалифицированных спортсменов с разной направленностью тренировочного процесса // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2008. - № 2. - С. 66-69.
14. Ferrari R. The role of mitochondria in ischemic heart disease // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1996. - Vol. 28. - P. S1-S10.
15. Finck B.N., Han X., Courtois M. A critical role for ppara-mediated lipotoxicity in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy: modulation by dietary fat content // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
- 2003. - Vol. 100, No. 3. - P. 1226-1231.
16. Huss J.M., Kelly D.R. Mitochondrial energy metabolism in heart failure: a question of balance. // Clin. Invest. - 2005. - Vol. 115, No. 3. - P. 547-555.
17. Neubauer S., Horn M., Naumann A. Impairtment of energy metabolism in intact residual myocardium of rat hearts with chronic myocardial infarction. // J. Clin. Invest. - 1995. -
Vol. 92. - P. 1092-1100.
18. Pallotti F., Lenaz G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines // Methods Cell Biol. - 2001. - Vol. 65. - P. 1-35.
19. Svedjeholm R., Huljebrant I., Hakanson E., Vanhanen I. Glutamate
and high-dose glucose-insulin-potassium in the treatment of severe cardiac failure after cardiac operations // Ann. Thorac. Surg. - 1995. - Vol. 59. - P. S23-S30.
Поступила 22.04.2010
