CC BY
13
УДК 66.091.7
Колесникова И.С., Сатаева А.Р., Серегина Т.С., Филимонова Е.А., Ивановская Е.В., Дятлов В.А.
ДВУХСЛОЙНЫЕ ПОЛИ-2-ЦИАНОАКРИЛАТНЫЕ НАНОКАПСУЛЫ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ ПОЛИНУКЛЕАТИДОВ
Колесникова Ирина Сергеевна - студентка 3-го курса кафедры химической технологии пластических масс; ira.kolesnikova.00@list.ru;
Сатаева Анжелина Ринатовна - студентка 3-го курса кафедры химической технологии пластических масс; Серегина Татьяна Сергеевна - магистрант 1-го курса кафедры биоматериалов;
Филимонова Екатерина Андреевна - магистрант 1-го курса кафедры химической технологии пластических масс;
Ивановская Екатерина Владиславовна - студентка 3-го курса кафедры химической технологии пластических масс;
Дятлов Валерий Александрович - доктор химических наук, профессор кафедры химической технологии пластических масс;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125047, Миусская площадь, дом 9.
К синтезу предложены двухслойные поли-2-цианоакрилатные нанокапсулы, имеющие внутреннюю твердую стенку и внешнюю фосфолипидную мембрану, способствующую проникновению носителя внутрь живой клетки по механизму слияния мембран. Методом динамического светорассеяния определены размеры наноносителей. Разработаны условия инкапсулирования генного материала с использованием в качестве модельного вещества- препарата рыбьего ДНК - "Деринат". Используемые подходы позволяют инкапсулировать более 95% полинуклеотида внутрь бислойных водонаполненных капсул.
Ключевые слова: поли-2-цианоакрилаты, нанокорпускулярные носители лекарств, внутриклеточный транспорт.
DOUBLE-LAYER POLY (2-CIANOACRYLATES) NANOCAPSULES AS A CARRIER FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF POLYNUCLEOTIDES
Kolesnikova I.S., Sataeva A.R., Seregina T. S., Filimonova E.A., Ivanovskaya E.V., Dyatlov V.A. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
Double-layer poly (2-cyanoacrylate) nanocapsules with an inner tough wall and an outer phospholipid membrane, which ^ facilitates carrier infiltration into the living cell by the mechanism of membrane _ fusion, were proposed _ for synthesis. The size of the nanocarriers were determined by dynamic light scattering. The conditions _ for encapsulation of gene materials were developed using "Derinat", a preparation containing _ fish DNA, as a model substance. The approaches used in our research allow encapsulation of more than 95% of the polynucleotide inside bi-layer water-filled capsules.
Key words: poly-2-cianoacrylate, nanocorpuscular carriers, intracellular transport.
Отсутствие удобных носителей, способных доставлять ДНК внутрь клетки, существенно ограничивает возможности генной терапии важнейших заболеваний, включающих
геннообусловленные болезни, а также злокачественные опухоли, образованные клетками с поврежденным механизмом апоптоза.
Существующие в настоящее время носители способны проникать в живую клетку по трем механизмам (рис.1). Мицеллы диаметром 20-50 нм, построенные из амфифильных полимеров способны проникать напрямую, однако, механизм их проникновения недостаточно изучен. Только они способны выступать в качестве внутриклеточных носителей лабильных биологически активных соединений, включая внутриядерную доставку ДНК. Но из-за низкой стабильности мицелл при их разбавлении, а также их способности обмениваться содержимым друг с другом и окружающей средой, их использование в качестве внутриклеточного транспорта в живых организмах затруднено. Их
используют только в экспериментах на культурах клеток. При увеличении размера частиц меняется механизм проникновения водорастворимых полимеров. Самые разнообразные частицы, размером от 200 нм и до нескольких микрон, способны проникать внутрь живой клетки по механизмам пино-и фагоцитоза, который предусматривает образование фагосом с последующей ферментативной атакой носителя высоко агрессивными лизосомальными ферментами. Такой способ проникновения в клетку не позволяет использовать их для транспорта лабильных физиологически активных соединений, включая подавляющее большинство
полинуклеотидов. Третьим механизмом
проникновения в клетку является слияние мембраны носителя и плазмолеммы, с последующей инъекцией содержимого носителя внутрь клетки, минуя механизм фагоцитоза. Для реализации этого подхода требуется создание носителей, имеющих жидкую поверхностную мембрану, близкую по составу к мембране живой клетки [1].
Сайт, отвечающий за выделение активного вещества
Фосфолипидный (синтетический в случае ниосом) бислой мембраны
Фафолипидныи
СЛОЙ
Оболочка к1 з
этил-2-
цианокрллзга
Рис. 1. Типы внутриклеточных носителей: липосома/ниосома (слева), нанокапсула (справа)
Настоящая работа посвящена изучению подходов и способов синтеза полых, водонаполненных капсул, имеющих твердую цианоакрилатную стенку, покрытую снаружи слоем жидкого фосфолипида. Кроме этого, на примере модельного полинуклеотида, выделенного из осетровых рыб (Деринат), изучена возможность инкапсулирования ДНК внутрь синтезированных капсул.
На первом этапе создавали полимеризационную среду, свободную от поверхностно-активных веществ. В качестве полимера-стабилизатора использовали клинический кровезаменитель "Полиглюкин" -раствор биоразлагаемого полисахарида декстрана с молекулярной массой 60±5кДа. Затем на его основе готовили двухфазную водную систему из
несмешивающихся друг с другом водорастворимых полимеров. В качестве дискретной фазы использовали три типа высокомолекулярных соединений: поликатион хитозан, полианион карбоксиметилцеллюлозу, а также нейтральные полимеры: полиэтиленгликоль (ПЭГ),
гидроксиэтилкрахмал, оксиэтилцеллюлозу (рис.2). Известно, что полинуклеотиды образуют устойчивые интерполимерные комплексы с нуклеофилами, однако, это не совсем подходит для целей внутриклеточного транспорта ДНК, который предусматривает отщепление плазмиды из интерполимерного комплекса перед синтезом белка в рибосоме.
мн3
Поликатион хитозан
он
Полианион
Е^о!
Полиэтиленгликоль
ка р б о кси м ети л це л л ю лоз ы
Гидроксиэтилкрахмал
Рис. 2. Полимеры дискретной фазы
он
О кс и эти л цел л ю лоз а
Хитозан образует с полинуклеотидами наиболее устойчивый трудноразрушаемый комплекс с увеличением аминогруппы глюкозоаминного цикла. Более слабые комплексы образуются при взаимодействии нуклеотидов с нейтральными полисахаридами за счет водородными связей между карбоксильными и фосфатными группами и самое слабое конкурентное связывание возможно с органическими поликислотами, которыми является карбоксиметилцеллюлозная и гиалуроновая кислота. В работе исследована полнота инкапсулирования
модельного полинуклеотида дерината в зависимости от природы водорастворимого полимера дискретной фазы. Все использованные полимеры являются биоразлагаемыми, что снижает потенциальный риск их накопления в почках и связанных с этих осложнений при клиническом использовании. Как известно, все что введено в организм извне должно быть выведено в разумные сроки. В качестве материалов стенки использовался полиэтил-2-цианокрилат, выбор объясняется уникальной способностью исходного мономера этил-2-
цианокрилата образовывать полимер по механизму анионной полимеризации, инициируемой следами слабых нуклеофилов. [2,3] В водной среде скорость его полимеризации легко контролируется при изменении pH. Кроме этого, образующийся полимер является биодеградирующим, причем его разложение в организме возможно, как ферментативным, так и неферментативным путем. Это единственный биодеградируемый из известных акриловых полимеров. В качестве материала жидкой стенки использовали два фосфолипида близких по строению к плазмолемме (рис.3). Стенку дополнительно структурировали холестерином.
о 1
-о-В-к' Г2 «WV!
q- снз но
Фосфатидипхопин Общая ормупа сфинголипида, где: R1- остаток моно- или олмгосакарид, R2- алкенил. R3- ал кил.
Рис. 3. Фосфолипиды близкие по строению к плазмолемме
Нанокорпоскулярные носители получают в три стадии: на первой стадии готовят полимеризационную среду, стабилизированную цитратным буфером и раствором декстрана, на второй стадии прибавляют полимер, формирующий дискретную фазу и раствор полинуклеотида. Для получения нужного размера капель систему озвучивают ультразвуковым дезинтегратором с формированием двухфазной полимеризационной среды. На последней стадии в полученной среде проводят полимеризацию этил-2-цианокрилата. При обработке ультразвуковым генератором образуются водонаполненные капсулы, на которых в дальнейшем формируется фосфолипидная оболочка.
Размер образовавшихся нанокапсул определяли методом динамического светорассеяния "Фотокор-комплекс". Показано, что наибольшее влияние на размер капсул показывает режим озвучивания и температура реакции. С понижением температуры и увеличением интенсивности теплоотвода возрастает время, необходимое для полной полимеризации этилцианокрилата, и уменьшается размер синтезированных частиц. Тем не менее, снизить размер капсул ниже 100 нм не удается. Вторым важным параметром является природа полимера, использованного для образования дискретной фазы. Наилучшие результаты получены для нейтральных (незаряженных) полимеров полиэтиленгликоля и оксиэтилкрахмала. Третьим важным параметром является кислотность полимеризационной среды. Скорость полимеризации снижается с увеличением кислотности. Однако, лабильность используемых соединений не позволяет вводить в раствор сильные
кислоты, являющиеся регуляторами скорости полимеризации. В дальнейшем использовались биосовместимые цитратные буферные растворы со слабокислым значением pH.
Степень инкапсулирования полинуклеотида определяли методом электронной спектроскопии. Деринат и препараты на его основе имеют высокую инстинкцию в области, в которой слабо поглощают другие компоненты полимеризационной среды. В работе показано, что использование хитозана позволяет практически полностью инкапсулировать ДНК, также близкие показатели получены для систем на основе неионных полимеров:
гидроксиэтилкрахмала и полиэтиленгликоля. Определение степени инкапсулирования в кислотных средах, на основе гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы несколько осложнены остаточным поглощением этих веществ в аналитической области, что снижает точность проводимых измерений, однако, не менее 90% полинуклеатидов удалось инкапсулировать и в этих средах. Введение второй оболочки фосфолипидного характера потребовало дополнительных
исследований присутствия в среде мицелл, не связанных с полицианокриалатными капсулами. Исследование проводили с использованием "Фотокор-комплекс", который позволяет
анализировать полимодальные дисперсные системы. Сфинголипидные мицеллы имеют значительно меньший размер по сравнению с полицианокрилатными капсулами, их диаметр находится в интервале от 2 до 10 нм. Частиц такого размера в системе не обнаружено. Для предотвращения их образования, при разбавлении суспензии дополнительно добавляли холестерол, который является агентом, упрочняющим липидный слой, а также образующим обратимые физические сшивки. Этот процесс хорошо известен и описан для билипидных плазмолемм. Таким образом, изучена эффективность возможных подходов при синтезе многослойных полицианокрилатных капсул среднего диаметра.
Список литературы
1. Dyatlov V.A., Katz G.A. Small diameter nanocapsules, process for their preparation and application thereof. Int. Application No PCT/IE 94/000001, Int. Publication No W094/015590, 1994.
2. Dyatlov V.A., Maleev V.I. Intermediates for the preparation of poly (2-cyanoacrylates) and application of the poly (2-cyanoacrylates) so prepared. Int. Application No PCT/IE 94/000018, 1994, Int. Publication No W095/026371, 1995.
3. Rustamov I.R., Dyatlov V.A., Grebeneva T.A., Dyatlov A.V., Zaitsev V.V., Maleev V.I. Polycyanoacrylate porous material for bone tissue substitution // Journal of Material Chemistry B. 2014. -I.2. - P. 4310-4317.
