CC BY
71
УДК 615.45
Лусс А.Л., Куликов П.П., Кусков АН., Штильман М.И.
АМФИФИЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ГЕННОГО ТРАНСПОРТА НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА
Лусс Анна Леонидовна, аспирант учебно-научного центра "Биоматериалы", e-mail: al.luss@vandex.ru:
Куликов Павел Павлович, аспирант учебно-научного центра "Биоматериалы":
Кусков Андрей Николаевич, к.х.н., доцент учебно-научного центра "Биоматериалы";
Штильман Михаил Исаакович, д.х.н., профессор, руководитель учебно-научного центра "Биоматериалы»,
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
125047, Москва, Миусская пл., д. 9
Синтезированы амфифильные полимеры на основе поли^-винилпирролидона, терминированные длинноцепочечными меркаптанами. Их строение и молекулярно-массовые характеристики исследованы с использованием H, 13C ЯМР и ИК спектроскопии и MASS MALDI спектрометрии. Определены критические концентрации мицеллообразования и ее зависимость от молекулярной массы диблоксополимеров и длины гидрофобного радикала. Сополимеры использованы для получения нанокорпускулярных носителей лекарственных средств.
Ключевые слова: амфифильный полимер, сополимеры N-винилпирролидона, мицелла, полимерная наночастица, внутриклеточный генный транспорт, полимерные сурфактанты.
AMPHYPHILIC POLYMERIC NANOPARTICLES FOR GENE TRANSPORT BASED ON N-VINYLPYRROLIDONE COPOLYMERS
Luss A.L., Kulikov P.P., Kuskov A.N., Shtilman M.I.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
Amphiphilic polymers based on poly-N-vinylpyrrolidone terminated with long-chain mercaptans have been synthesized. The structure and molecular weight characteristics have been studied by 1H, 13C NMR and IR spectroscopy and MASS MALDI spectrometry. Critical micelle formation concentrations and its dependence on the molecular weight of diblock copolymers and the length of hydrophobic radical have been determined. The copolymers have been used as nanocarpuscular drug carriers.
Keywords: amphiphilic polymer, copolymers of N-vinylpyrrolidone, micelle, polymeric nanoparticle, intracellular gene transport, polymeric surfactants.
Развитие фармакологии последних лет убедительно обозначило генно-инженерные методы в качестве одного из приоритетных направлений развития медицины будущего [1,2]. Постепенный переход от классических Галеновых методов лечения к генной терапии требует развития универсальных систем доставки лекарственных препаратов и генного материала внутрь ядра живой клетки. Несмотря на обилие разработанных методов независимой одновременной доставки разных по природе лекарств внутрь живых тканей, в настоящее время отсутствует удобные универсальные системы доставки генного материала [3]. Использование для этих целей полимерных препаратов, снабженных векторами целевого транспорта, требует весьма сложных химических методов и ограничивается в основном созданием противораковых лекарств [4,5]. В последние годы широкие исследования в этой области привели к общему выводу о том, что наиболее подходящими для генного транспорта являются не классические водорастворимые полимерные носители, а корпускулярные гетерогенные системы [6]. К ним относятся как полимеросомы с непрерывной по глубине полимерной стенкой, так и самоорганизующиеся носители мицеллярного типа. Хорошо известным типом полимеросом являются цианакрилатные
наноносители, получаемые анионной
полимеризацией эфиров 2-цианакриловой кислоты [7]. Препараты на основе мицеллярных носителей ДНК хорошо работают в случае клеточных культур и широко применяются в генной инженерии. Широкое распространение получили мицеллы из полианионов, способные связывать нуклеиновые кислоты в интерполимерные комплекс, что повышает эффективность доставки [8]. Однако, полианионные мицеллярные транспортные средства весьма ограничено применимы для генной терапии внутри живого организма. Далеко не все гены способны отщепится от интерполимерного комплекса в работоспособном состоянии, а кроме того неприятным свойством мицелл является их способность обмениваться содержимым с окружающими тканями и другими мицеллами. Они способны захватывать посторонние гены из межклеточной жидкости, а затем доставлять их внутрь клеток ткани, что небезопасно. Требования, предъявляемые к корпускулярным носителям для генной терапии, предусматривают отсутствие способности образовывать прочные
интерполимерные комплексы с нуклеиновыми кислотами или с олигонуклеотидами, а также стабильность в растворе и невозможность обмена
содержимым с другими мицеллами и тканями до момента доставки внутрь клетки.
Предметом настоящего исследования явилось изучение подходов к синтезу исходных поверхностно-активных полимеров пригодных для получения нанокорпускуллярных носителей лекарственных средств. Для этой цели синтезировали диблоксополимеры на основе поли-К-винил-2-пирролидона, терминированного
длинноцепочечными меркаптанами с
алифатическими радикалами различной длины.
Выбор поливинилпирролидона для синтеза амфифильных блоксополимеров связан с уникальным набором его свойств, к которым можно отнести биологическую инертность, отсутствие токсических свойств и способность образовывать лабильные комплексы с полинуклеотидами за счет взаимодействия остатков фосфорных кислот со слабой нуклеофильной пирролидоновой
группировкой [9].
Основные характеристики нанокорпускулярных носителей, а именно их размер и тип стенки, которая может быть как и непрерывной по глубине, так и сформированной в виде мицеллярного монослоя, зависят от критической концентрации мицеллообразования, молекулярной массы и соотношения длины блоков в диблоксополимере, из которого они построены. Эти свойства регулировали, изменяя количество молей введенных терминальных заместителей и длину алифатического радикала (рис.1).
Н2С=СН + I
N
ЗН-И
ДАК
ди океан
I
N -"п
О
О
Рис. 1. Схема получения амфифильных полимеров на основе М-винил-2-пирролидона в присутствии передатчика цепи В качестве передатчиков цепи в работе использовали 3 длинноцепочечных тиола: децил-, гексадецил- и октадецилмеркаптан. С увеличением мольной доли меркаптана, введенного в реакцию, молекулярная масса образующегося полимера падает. При этом содержание тиольных групп в продукте реакции пропорционально возрастает. Это позволяет регулировать молекулярную массу в широких пределах от 30000 до 1000 Да. Кроме того, при низких концентрациях передатчика в реакции снижение Mw зависит от длины алифатического радикала в терминирующей группе. Введение в реакцию относительно длинного
октадецилмеркаптана в количестве 0,01 мольн. % позволяет получать высокомолекулярный сополимер с Mw=30 кДа, в то время как эквивалентное мольное количество децилмеркаптана приводит к снижению молекулярной массы до 16 кДа. Гексадецилмекраптан занимает промежуточное положение и позволяет получать полимер с Mw=20 кДа (рис.2). При увеличении содержания агента передачи цепи выше 1 мольн. % указанный выше
эффект нивелируется. Существенные различия в эффективности агентов в зависимости от длины алифатического радикала при низких концентрациях в реакционной среде можно объяснить усилением гидрофобных взаимодействий амфифильного терминированного поливинилпирролидона с тиолом с увеличением длины алифатического радикала последнего. Эффект исчезает при насыщении реакционной среды меркаптаном и исчерпанием сайтов для гидрофобного связывания.
0,5
1,5
2,5
С,№ПЬН.%
Рис. 2. Зависимость молекулярной массы полимера от количества введенного: (1) - октадецилмеркаптана, (2) -гексадецилмеркаптана, (3)- децилмеркаптана
Рис. 3.Зависимость ККМ амфифильных полимеров от их среднечисловой молекулярной массы
Критическую концентрацию
мицеллообразования (ККМ) определяли
спектрофотометрическим методом по возрастанию интенсивности флуоресценции дифенилгексатриена (ДФГТ) в качестве индикатора мицеллообразования при Х= 433 нм и длине волны возбуждающего излучения Х=366 нм. ККМ полученных амфифльных полимеров зависит как от длины
введенного терминального радикала, так и от среднечисловой молекулярной массы
поливинилпирролидонового фрагмента молекулы. Введение гидрофобных заместителей возрастающей длины в полимеры с одинаковой молекулярной массой приводит к закономерному уменьшению ККМ. Так, введение октадецилмеркаптана в полимер с Mw=3,5 кДа позволяет получать поверхностно-активный сополимер с ККМ = 0,054 ммоль/л, в то время как аналогичный продукт с децильным терминальным заместителем имеет ККМ в 20 раза более высокий (1 ммоль/л), а с гексильным- в 40 раз выше (2 ммоль/л).
Зависимость ККМ от молекулярной массы сополимера носит значительно более сложный характер. У всех исследованных полимеров независимо от длины алифатического терминального радикала ККМ возрастает с увеличением Mw. Зависимость носит линейный характер вплоть до Mw=12 кДа, однако, дальнейшее увеличение Mw выше указанного значения приводит к резкому возрастанию ККМ, при этом на графике зависимости ККМ от Mw (рис.3) наблюдается резкий перегиб. Такой характер зависимости описан для полисахаридов, содержащих гидрофобные заместители в боковой цепи. Явление объясняется изменением характера межмолекулярного взаимодействия при увеличении молекулярной массы гидрофильной части полимера выше длины кинетического сегмента, экранирования
гидрофобных групп и затруднённому вследствие этого формированию мицелл [10].
Предложен способ получения амфифильных поверхностно-активных полимеров ПВП,
содержащих жирные терминальные заместители, радикальной полимеризацией мономера в присутствии агента передачи цепи тиольного типа.
Изменяя содержание и длину алифатического тиола получены амфифильные сополимеры с молекулярной массой от 1 до 40 кДа. Обнаружено закономерное уменьшение молекулярной массы с уменьшением длины радикала в молекуле передатчика цепи.
Изучена зависимость критической концентрации мицелообрзования от содержания терминальных заместителей и молекулярной массы полимера. Значения ККМ находятся в микромолярном диапазоне.
Гидрофильно-гидрофобный баланс
амфифильных терминированных сополимеров пливинилпирролидона регулировали, имея целью разработку способов получения
нанокорпускулярных носителей с контролируемой гидрофобностью. Это требуется для эффективного управления коэффициентом распределения
инкапсулируемого физиологически активного вещества между дискретной фазой и дисперсионной средой. Предложенный подход позволяет
контролировать гидрофобность амфифильного полимера стенки капсулы, изменяя мольное соотношение звеньев ПВП и терминальных углеводородных радикалов. Использование низкомолекулярного сополимера и длинноцепного меркаптана позволяет получать наиболее гидрофобные материалы для конструирования капсул мицеллярного типа.
Список литературы
1. Goonoo N., Jeetah R., Bhaw-Luximon A. и Jhurry D., Polydioxanone-based bio-materials for tissue engineering and drug/gene delivery applications. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. -2015.VoL 97. № B. - P. 371-391.
2. B. C.J., Kozielski K.L., Green J.J., Exploring the role of polymer structure on intracellular nucleic acid delivery via polymeric nanoparticles. // Journal of Controlled Release.-2015. VoL 219 .- P. 488-489.
3. Rustamov I.R., Dyatlov V.A., Grebeneva T.A., Dyatlov A.V., Zaitsev V.V. and Maleev V.I. Polycyanoacrylate porous material for bone tissue substitution // Journal of Material Chemistry. B. -2014. VoL 2 .- P. 4310-4317.
4. Yang S., Li N., Liu Z., Sha W., Chen D., Xu Q., Lu J., Amphiphilic copolymer coated upconversion nanoparticles for near-infrared light-triggered dual anticancer treatment// Nanoscale.-2014. VoL 6. № 24.-P. 14903-14910.
5. Dyatlov V., Kruppa I., Grebeneva T., Kireyev V., Sokolskaya I. Characteristics of covalent linkage of gossypol to dialdehyde dextran // Chemistry of Natural Compounds.-2016. VoL 4.- P. 542.
6. Dyatlov V.A., Katz G.A. Small diameter nanocapsules, process for their preparation and application thereof. Int. Application No PCT/IE 94/000001, Int. Publication No W094/015590, 1994.
7. Dyatlov V.A., Rustamov I.R., Grebeneva T.A., Maleev V.I., Gololobov Yu.G., Kireev V.V. Synthesis of 2-cyanoacryloyl chloride and its interaction with O-and S- nucleophiles // Mendeleev Communications.-2013. VoL 23. №. 6. -P. 356.
8. Kargov S.I., Zhiryakova M.V., Zezin A.B., Kabanov V.A. Competitive reactions in solutions of DNA and water-soluble interpolyelectrolyte complexes // Biopolymers.-1995 VoL 35.- P. 523-531.
9. Kuskov A.N., Shtilman M.I., Goryachaya A.V., Tashmuhamedov R.I., Yaroslavov A.A., Torchilin V.P., Tsatsakis A.M., Rizos A.K. Self-assembling nanoscaled drug delivery systems composed of amphiphilic polyvinylpyrrolidones // Journal of Non-Crystalline Solids .2007. VoL 353.-P. 3969-3975.
