Научная статья на тему 'Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте'

Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
460
88
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Биомедицина
ВАК
RSCI
Ключевые слова
ГЛИКОПРОТЕИН-Р / L-ТИРОКСИН / ГИПЕРТИРЕОЗ / ФЕКСОФЕНАДИН / Р-GLYCOPROTEIN / MDR1 / L-THYROXINE / HYPERTHYROIDISM / FEXOFENADINE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Якушева Е. Н., Щулькин А. В., Бирюкова А. С.

В исследовании на кроликах изучено влияние L-тироксина на активность белка-транспортера гликопротеина-Р (Pgp). Активность Pgp изучали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина. Установлено, что введение L-тироксина в течение 14 дней приводит к дозозависимой индукции активности Рgp.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Dose-dependent thyroxine influence of P-glycoprotein functional activity in the experiment

In the research on the rabbits influence of L-thyroxine on the activity of the protein-transporter Р-glycoprotein (Pgp) was studied. Activity of the Pgp was studied on the pharmacokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of L-thyroxine within 14 days lead to the dosedependent induction of Рgp activity.

Текст научной работы на тему «Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте»

Биомедицина • № 2, 2012, C. 53-60

Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте

Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин, А.С. Бирюкова

Рязанский государственный медицинский университет, Минздравсоцразвития РФ, Рязань Контактная информация: Якушева Елена Николаевна enya.rzn@yandex.ru

В исследовании на кроликах изучено влияние L-тироксина на активность белка-транспортера гликопротеина-Р (Pgp). Активность Pgp изучали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексо-фенадина. Установлено, что введение L-тироксина в течение 14 дней приводит к дозозависимой индукции активности Рgp.

Ключевые слова: гликопротеин-Р, MDR1, L-тироксин, гипертиреоз, фексофенадин.

Суперсемейство ABC-транспортеров (ATР-binding cassette), к которому относятся более ста транспортных белков, обнаруженных как у бактерий, так и у человека, в настоящее время находится под пристальным вниманием исследователей. Белки указанного суперсемейства транспортируют самые разнообразные субстраты — от неорганических ионов до полисахаридов и белков, для них характерна общая доменная организация в клетках и высокая консервативность. Одним из наиболее изученных транспортеров является гликопротеин-Р (от англ. permeability — проницаемость) — крупный трансмембранный белок с молекулярной массой 170 кДа, состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть трансмембранных участков [9].

Гликопротеин-Р (Pgp) — АТФ-зависи-мый насос, локализованный на цитоплазматических мембранах различных клеток и осуществляющий выброс во внеклеточное пространство различных ксенобиотиков, в том числе и лекар-

ственных веществ. Ряд химических соединений как естественного, так и синтетического происхождения оказывают индуцирующее или ингибирующее влияние на функциональную активность Pgp, что приводит, в конечном счете, к значительному изменению фармакокинетики, активности и токсичности лекарственных веществ [4].

Влияние тиреоидных гормонов на функциональную активность Pgp остается недостаточно изученным. Активация белково-синтетических функций и повышение интенсивности энергетических процессов в клетке под действием тироксина гипотетически способны оказать влияние на функциональную активность Pgp.

Цель настоящего исследования: изучить влияние L-тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте.

Материалы и методы

Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах породы шиншилла, средней массой 3500±100 г. В исследование

включали самок, которые находились в состоянии течки. L-тироксин (Berlin-Chemi Menarini) вводили подкожно в течение 14 дней: 6 самкам — в дозе 25 мкг/кг массы (серия с низкой дозой тироксина) и 6 самкам — в дозе 100 мкг/кг массы (серия с высокой дозой тироксина) [1, 2]. За сутки до начала эксперимента, через 14 дней введения L-тироксина и на 5-й день отмены препарата у животных определяли активность Pgp и уровень ТТГ, Т3 и Т4 в сыворотке крови.

Активность белка-транспортера оценивали по концентрации в плазме крови его маркерного субстрата — фексофена-дина. Фексофенадин (Sanofi Aventis) вводили животным перорально с помощью металлического зонда в дозе 30 мг/кг массы [3]. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 ч от момента введения препарата из ушной вены кроликов забирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и хранили до анализа при температуре -29°С. Содержание фексофена-дина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Beckman Coul-ter» с ультрафиолетовым детектором и колонке «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. [5] в собственной модификации. Анализ выполняли при длине волны 225 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Использовали подвижную фазу следующего состава: 133,7 мл бидистил-лированной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтиламина (Chem-Lab), доведенной ортофосфорной кислотой до рН 4 и 64 мл ацетонитрила (Chem-Lab). Осуществляли жидкостную экстракцию фексофенадина из плазмы крови. В каче-

стве экстрагентов использовали дихлор-метан (ACROS ORGANICS), этилаце-тат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИММЕД). Коэффициент экстракции составил 53%.

Количественное определение фексо-фенадина выполняли по методу абсолютной калибровки, с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Представлено уравнение калибровочной зависимости для определения фексофе-надина в плазме крови:

у=ах+Ь=-0,0001+9,4089*10-6*х, где у — высота пика фексофенадина в единицах экстинкции, х — содержание фексофенадина в стандартном растворе в нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равнялся 0,9958.

Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими характеристиками: время удерживания

— 13,7 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови — 90 нг/мл; точность — 4,2%.

Вычисление концентрации фексофе-надина осуществляли с помощью программы Gold. Фармакокинетические параметры (максимальную концентрацию Cmax, площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время AUC0 га, общий клиренс, объем распределения) рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение C /AUC рас-

max 0-“ г

считывали самостоятельно.

Уровень гормонов определяли ра-диоиммунным методом с применением стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей обработкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ РязГМУ.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программ

Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой серии использовали тест ANOVA повторных измерений, межгруп-повые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для оценки статистической значимости различий групп при распределении признака, которое от-

личается от нормального, использовали критерий Фридмана, межгрупповые различия определяли по критерию Ньюме-на-Кейсла. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от уровня гормонов определяли по коэффициенту корреляции Пирсона для выборок с нормальным распределением (г) и по коэффициенту корреляции Спирмена ^8) для выборок с распределением отличным от нормального.

Таблица 1

Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тироксина в дозе 25 мкг/кг массы ^±m — при нормальном распределении признаков; медиана, нижний и верхний квартиль — при распределении признака, отличном от нормального)

Изучаемые параметры Исходные значения n=6 Тироксин 14 дней n=6 5-й день отмены тироксина n=6

Стах, нг/мл 385,9±54,7 234,0±22,4*, ** 320,1±24,1

Tmax, ч 4,0 (3,0; 4,0) 4,0 (4,0; 5,0) 4,0 (4,0; 4,0)

T, ч 28,9 (5,4; 29,02) 10,17 (6,07; 14,56) 8,17 (6,47; 20,34)

AUC0-t , нг/чмл 6886,9±1351,5 3795,7±767,7 4841,6±1011,8

AUC0-<» , нг/чмл 4058,4 (3609; 4394,9) 1526 (1449,3; 2148,8)* 2191,8 (2054,1; 3644,8)

Общий клиренс, л 16,1±4,0 30,1±6,5 22,2±3,6

Объем распределения, л 344,3±52,3 446,1±49,2 360,3±25,1

Cmax / AUC 0,072±0,021 0,077±0,017 0,081±0,016

MRT, ч 38,9 (10,0; 41,8) 17,1 (11,1;22,5) 14,8 (11,0; 27,8)

MRTt, ч 10,0 (8,8; 11,9) 6,5 (4,1; 6,7)* 6,0 (5,9; 9,7)*

ТТГ, мМЕ/л 0,7 (0,7; 0,8) 0,5 (0,4; 0,5)*, ** 0,7 (0,6; 0,8)

Т3, нмоль/л 1,2 (1,1; 1,6) 7,7 (7,2; 8,3)*, ** 1,1 (1,0; 1,1)

Т4, нмоль/л 39,8±0,6 139,1±13,0*, ** 60,7±7,5

Примечание: * — достоверные различия с данными у интактных животных, p<0,05; ** — достоверные различия с данными на 5 день отмены тироксина, p<0,05.

Таблица 2

Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тироксина в дозе 100 мкг/кг массы (М±m — при распределении признаков; медиана, нижний и верхний квартиль — при распределении признака отличном от нормального)

Изучаемые параметры Исходные значения n=6 Тироксин 14 дней n=6 5-й день отмены тироксина n=6

Cmax, нг/мл 399,8±14,2 180,3±9,8*, ** 332,4±14,3*

Тт„, ч 4,0 (3,0; 4,0) 4,0 (4,0; 5,0) 4,0 (4,0; 4,0)

T , ч 13,5±4,0 7,7±4,4 12,8±1,9

AUC0-t , нг/чмл 3522,4 (3303,0; 3631,3) 1195,0 (1032,1; 1202,4)*, ** 3237,7 (1875,6; 3992,1)

AUC0_m , нг/чмл 5336,4±717,3 1937,1±666,3*, ** 4881,5±763,0

Общий клиренс, л 18,6±2,6 52,7±14,4*, ** 21,3±3,7

Объем распределения, л 329,9±47,5 445,9±72,9 372,5±20,8

Cmax/ AUC 0,084±0,0135 0,144±0,04 0,076±0,01

MRT, ч 20,9±5,1 13,8±6,2 19,7±2,6

MRTt, ч 10,5 (8,3; 10,8) 5,7 (5,1; 6,9)* 10,3 (6,3; 11,1)

ТТГ, мМЕ/л 0,6±0,02 0,5±0,03* 0,6±0,03

Т3, нмоль/л 1,8±0,09 9,9±0,5*, ** 4,2±0,6*

Т4, нмоль/л 70,0±4,3 241,6±12,9*, ** 42,1±1,8*

Примечание: * — достоверные различия с данными у интактных животных, p<0,05; ** — достоверные различия с данными на 5 день отмены тироксина, p<0,05.

Полученные данные представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата в случае нормального распределения признака или в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля — если распределение данных отличалось от нормального.

Результаты и их обсуждение Введение как низкой (25 мкг/кг массы), так и высокой дозы (100 мкг/кг массы) L-тироксина приводило к раз-

витию выраженного гипертиреоза, что проявлялось повышением уровней Т4 на 249,5% (p<0,05) и 245,1% (p<0,05), Т3 на 496,1% (p<0,05) и 450,0% (p<0,05) и снижением содержания ТТГ в сыворотке крови на 36,9% (p<0,05) и 19,4% (p<0,05) соответственно по сравнению с исходными значениями (табл. 1 и 2). Более выраженные изменения показателей у животных, получавших низкую дозу L-тироксина, связаны с исходно более низкими показателями уровней Т4, Т3

Рис. 1. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от гормонального статуса кроликов при введении тироксина в дозе 25 мкг/кг массы (коэффициент корреляции Спирмена). Обозначения: непрерывная линиия — прямопропорциональная связь; пунктирная линия — обратнопропорциональная связь между признаками.

и более высоким уровнем ТТГ в данной серии опыта (табл. 1). На 5-й день отмены низкой дозы L-тироксина происходила нормализация гормонального статуса лабораторных животных. В отличие от данных этой серии, на 5-й день отмены высокой дозы L-тироксина содержание Т3 оставалось повышенным на 133,3% (p<0,05), концентрация Т4 снижалась на 39,9% (p<0,05), уровень ТТГ соответствовал норме.

При изучении фармакокинетики фек-софенадина — маркерного субстрата Pgp на фоне введения тироксина — получены результаты, которые представлены в табл. 1 и 2.

Применение кроликам L-тироксина в дозе 25 мкг/кг в течение 14 дней вызывало снижение С на 39,4% (p<0,05),

max чг i/i

AUC0-t — на 62,4% (p<0,05), MRTt — на 35,0% (p<0,05) по сравнению с исходными значениями. На 5-й день отмены L-тироксина изучаемые параметры возвращались к норме и достоверно от исходных значений не отличались, за исключением MRTt, которое оставалось сниженным на 40,0% (p<0,05).

При введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы в течение 14 дней наблюдалась схожая динамика показателей, но выраженная в большей степени. С снизилась на 54,9% (p<0,05), AUC.

max ’ vr •> /•> д-ад

- на 63,7% (p<0,05), MRTt - на 45,7% (p<0,05), общий клиренс увеличился на 183,3% (p<0,05). На 5-й день отмены высокой дозы L-тироксина С оставалась

max

сниженной на 16,8% (p<0,05), остальные изучаемые фармакокинетические параметры достоверно от исходных значений не отличались (p>0,05).

Оценка зависимости фармакокинетических параметров от гормонального статуса показала (рис. 1), что у животных, получавших L-тироксин в низкой дозе, имелась прямая пропорциональная связь между уровнем ТТГ — Cmax фек-софенадина (R=0,65, p=0,005) и AUC0t (R=0,5, p=0,042); уровнем Т3 и объемом распределения (R=0,53, p=0,03); содержанием Т4 и T (R=0,51; p=0,04) и об-

max

ратно пропорциональная связь между уровнем Т3 и Cmax (R=-0,6; p=0,01); содержанием Т4 — Cmax (R=-0,56; p=0,019) и AUC0-t (R=-0,67; p=0,003).

Рис. 2. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от гормонального статуса кроликов при введении высокой дозы тироксина в дозе 100 мкг/кг массы (коэффициент корреляции Спирмена). Обозначения: непрерывная линиия — прямопропорциональная связь; пунктирная линия — обратнопропорциональная связь между признаками.

У животных, получавших L-тироксин в высокой дозе, наблюдалась (рис. 2) прямая пропорциональная связь между уровнем ТТГ и AUC0 (R=0,48; p=0,049); содержанием Т3 — Tmax (R=0,6; p=0,01), общим клиренсом (R=0,73; p=0,0012); концентрацией Т4 — Tmax (R=0,5; p=0,038), общим клиренсом (R=0,54; p=0,029). Обратно пропорциональная связь отмечалась между концентрацией Т3 — С (R=-0,857; p=0,0001), AUC ,

max 4 ’ ’ L ’ ' ’ 0-t’

(R=-0,77; p=0,0003), AUC0-ra (R=-0,77; p=0,0002) и MRTt (R=-0,72; p=0,001); уровнем Т4 — AUC0t (R=-0,6; p=0,01), AUC0-ra (R=-0,6; p=0,01) и MRTt (R=-0,55; p=0,023).

Pgp — белок-транспортер, обладающий широкой субстратной специфичностью. В научной литературе описан ряд лекарственных средств, влияющих на функциональную активность гликопротеина-Р, повышающих ее (индукторы) или снижающих (ингибиторы) [2].

В настоящем исследовании изучено влияние L-тироксина на функциональную активность Pgp на уровне целого ор-

ганизма, что позволяет прогнозировать фармакокинетику субстратов белка-транспортера. Показано, что на фоне введения L-тироксина происходит снижение Cmax, AUC0 га, AUC01, MRTt и одновременно повышение общего клиренса фексо-фенадина, что свидетельствует о повышении активности белка-транспортера Pgp. В то же время увеличение общего клиренса (характеризующего выведение лекарственных веществ из организма) и отсутствие изменений в отношении Cmax/AUCQra (характеризующего всасывание лекарственных веществ) можно рассматривать как селективное повышение активности Pgp под действием L-тироксина в печени и почках — органах, ответственных за выведение фексофена-дина. Полученные данные косвенно свидетельствуют о тканеспецифичной индукции Pgp. Более выраженные изменения фармакокинетики фексофенадина при введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы по сравнению с дозой 25 мкг/кг являются следствием дозозависимой стимуляции активности Pgp.

Результаты исследования сопоставимы с данными по изучению экспрессии Pgp у крыс с гипертиреозом. Авторы выявили существенное повышение экспрессии Pgp в печени и почках, умеренное — в тощей и подвздошной кишке, что позволило им сделать вывод о тканеспецифичной индукции экспрессии белка-транспортера [7]. Активация Pgp под влиянием тироксина может быть связана со стимуляцией ядерных рецепторов и индукцией экспрессии Pgp, которая опосредована увеличением транскрипции мРНК, кодируемой геном mdr1a/b , что обнаружено в ткани почек у крыс [7, 10].

На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 обнаружено, что Т3 выводится из клеток Pgp [6]. Аналогичные данные получены для Pgp в гемато-энцефалическом барьере. Показано, что белок-транспортер регулирует проникновение Т4 в спинно-мозговую жидкость [11].

На культуре клеток кишечника человека Сасо-2 выявлено, что Т3 регулирует экспрессию и функции Pgp. Установлено, что накопление дигоксина в клетках Сасо-2 существенно снижалось при использовании Т3. [8]. Таким образом, ти-реоидные гормоны являются субстратами и тканеспецифичными индукторами Pgp, а дисфункция щитовидной железы способна существенно изменять фармакокинетику лекарственных веществ.

Выводы

1. Введение кроликам L-тироксина подкожно в дозах 25 и 100 мкг/кг массы в течение 14 дней приводит к развитию экспериментального гипертиреоза, который характеризуется повышением уровней Т3 и Т4 и снижением уровня ТТГ в сыворотке крови.

2. L-тироксин, назначаемый кроли-

кам в течение 14 дней, вызывает до-зозасисимую индукцию активности гликопротеина-Р, определяемую по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, что подтверждается снижением С , AUC , MRTt (дозы 25 и

max’ 0-t’

100 мкг/кг) и увеличением общего клиренса (доза 100 мкг/кг).

3. Выявляется обратная корреляция между уровнем Т3 и Cmax фексофенадина при назначении L-тироксина в низкой и высокой дозах.

Список литературы

1. Айвазова А.С., Колхир В.К. Па-

тент 2357296 Рос. Федерация. МПК 609823/28 Способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба. Всероссийский научно-исследова-

тельский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР); № 2007143562/14; заявл. 27.11.2007; опубл. 27.06.2009.

2. Годовалов А.П. Адренергическая регуляция фагоцитарной активности нейтрофилов при экспериментальном тиреотоксикозе // Вестник уральской медицинской академической науки. 2010. № 2/1 (29). 112 с.

3. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук: 14.00.25 / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. ИМ. Сеченова. М. 2007. 21 с.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4. Кукес В.Г, Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализационной медицины: руководство для врачей — М.: ГЭО-ТАР-МЕДиа. 2008. 304 с.

5. Раменская Г.В., Скуридина Е.В., Красных Л.М. Разработка методики количественного определения маркера активности Р-гликопротеина фексофенадина в плазме крови // Хим. фарм. журн. 2006. том 40. № 12. С. 47-50.

6. Kassem N. et al. Thyroxine (T4) transfer from CSF to choroid plexus and ventricular brain regions in rabbit: contributory role of P-glycoprotein and organic anion transporting polypeptides // Brain Res. 2007. Vol. 1181.P. 44-50.

7. Mitchell A. Thyroid hormone export from cells: contribution of P-glycopro-tein / A. Mitchell, M.Tom, R. Mortimer // Endocrinol. 2005. Vol. 185. № 1. P. 93-98.

8. Nishio N. Modulation of P-glycopro-tein expression in hyperthyroid rat tissues / [et al.] // Journal of endocrinology. 2005. Vol. 185. P. 93-98.

9. Nishio N., Katsura T., Inui K. Thyroid hormone regulates the expression and function of P-glycoprotein in Caco-2 cells // Pharm. Res. 2008. Vol. 25(5). P. 1037-1042.

10. Reibeiro R.C.J. et al. The molecular biology of thyroid hormone action // Ann NY Acad Sci. 1995. Vol.758. P.366-389.

11. Sarkadi B, Homolya L., Szakocs G. et al. Human Multidrug Resistance ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoimmunity Defense System // Physiol. Rev. 2006. Vol. 86. P. 1179-1236.

Dose-dependent thyroxine influence of P-glycoprotein functional activity in the experiment

E.N. Yakusheva, A.V. Shchulkin, A.S. Byryukova

In the research on the rabbits influence of L-thyroxine on the activity of the protein-transporter P-glycoprotein (Pgp) was studied. Activity of the Pgp was studied on the pharmacokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of L-thyroxine within 14 days lead to the dose-dependent induction of Pgp activity.

Key words: P-glycoprotein, MDR1, L-thyroxine, hyperthyroidism, fexofenadine.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.