CC BY
79
Биомедицина • № 2, 2012, C. 53-60
Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте
Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин, А.С. Бирюкова
Рязанский государственный медицинский университет, Минздравсоцразвития РФ, Рязань Контактная информация: Якушева Елена Николаевна enya.rzn@yandex.ru
В исследовании на кроликах изучено влияние L-тироксина на активность белка-транспортера гликопротеина-Р (Pgp). Активность Pgp изучали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексо-фенадина. Установлено, что введение L-тироксина в течение 14 дней приводит к дозозависимой индукции активности Рgp.
Ключевые слова: гликопротеин-Р, MDR1, L-тироксин, гипертиреоз, фексофенадин.
Суперсемейство ABC-транспортеров (ATР-binding cassette), к которому относятся более ста транспортных белков, обнаруженных как у бактерий, так и у человека, в настоящее время находится под пристальным вниманием исследователей. Белки указанного суперсемейства транспортируют самые разнообразные субстраты — от неорганических ионов до полисахаридов и белков, для них характерна общая доменная организация в клетках и высокая консервативность. Одним из наиболее изученных транспортеров является гликопротеин-Р (от англ. permeability — проницаемость) — крупный трансмембранный белок с молекулярной массой 170 кДа, состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть трансмембранных участков [9].
Гликопротеин-Р (Pgp) — АТФ-зависи-мый насос, локализованный на цитоплазматических мембранах различных клеток и осуществляющий выброс во внеклеточное пространство различных ксенобиотиков, в том числе и лекар-
ственных веществ. Ряд химических соединений как естественного, так и синтетического происхождения оказывают индуцирующее или ингибирующее влияние на функциональную активность Pgp, что приводит, в конечном счете, к значительному изменению фармакокинетики, активности и токсичности лекарственных веществ [4].
Влияние тиреоидных гормонов на функциональную активность Pgp остается недостаточно изученным. Активация белково-синтетических функций и повышение интенсивности энергетических процессов в клетке под действием тироксина гипотетически способны оказать влияние на функциональную активность Pgp.
Цель настоящего исследования: изучить влияние L-тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте.
Материалы и методы
Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах породы шиншилла, средней массой 3500±100 г. В исследование
включали самок, которые находились в состоянии течки. L-тироксин (Berlin-Chemi Menarini) вводили подкожно в течение 14 дней: 6 самкам — в дозе 25 мкг/кг массы (серия с низкой дозой тироксина) и 6 самкам — в дозе 100 мкг/кг массы (серия с высокой дозой тироксина) [1, 2]. За сутки до начала эксперимента, через 14 дней введения L-тироксина и на 5-й день отмены препарата у животных определяли активность Pgp и уровень ТТГ, Т3 и Т4 в сыворотке крови.
Активность белка-транспортера оценивали по концентрации в плазме крови его маркерного субстрата — фексофена-дина. Фексофенадин (Sanofi Aventis) вводили животным перорально с помощью металлического зонда в дозе 30 мг/кг массы [3]. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 ч от момента введения препарата из ушной вены кроликов забирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и хранили до анализа при температуре -29°С. Содержание фексофена-дина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Beckman Coul-ter» с ультрафиолетовым детектором и колонке «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. [5] в собственной модификации. Анализ выполняли при длине волны 225 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Использовали подвижную фазу следующего состава: 133,7 мл бидистил-лированной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтиламина (Chem-Lab), доведенной ортофосфорной кислотой до рН 4 и 64 мл ацетонитрила (Chem-Lab). Осуществляли жидкостную экстракцию фексофенадина из плазмы крови. В каче-
стве экстрагентов использовали дихлор-метан (ACROS ORGANICS), этилаце-тат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИММЕД). Коэффициент экстракции составил 53%.
Количественное определение фексо-фенадина выполняли по методу абсолютной калибровки, с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Представлено уравнение калибровочной зависимости для определения фексофе-надина в плазме крови:
у=ах+Ь=-0,0001+9,4089*10-6*х, где у — высота пика фексофенадина в единицах экстинкции, х — содержание фексофенадина в стандартном растворе в нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равнялся 0,9958.
Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими характеристиками: время удерживания
— 13,7 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови — 90 нг/мл; точность — 4,2%.
Вычисление концентрации фексофе-надина осуществляли с помощью программы Gold. Фармакокинетические параметры (максимальную концентрацию Cmax, площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время AUC0 га, общий клиренс, объем распределения) рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение C /AUC рас-
max 0-“ г
считывали самостоятельно.
Уровень гормонов определяли ра-диоиммунным методом с применением стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей обработкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ РязГМУ.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программ
Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой серии использовали тест ANOVA повторных измерений, межгруп-повые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для оценки статистической значимости различий групп при распределении признака, которое от-
личается от нормального, использовали критерий Фридмана, межгрупповые различия определяли по критерию Ньюме-на-Кейсла. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от уровня гормонов определяли по коэффициенту корреляции Пирсона для выборок с нормальным распределением (г) и по коэффициенту корреляции Спирмена ^8) для выборок с распределением отличным от нормального.
Таблица 1
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тироксина в дозе 25 мкг/кг массы ^±m — при нормальном распределении признаков; медиана, нижний и верхний квартиль — при распределении признака, отличном от нормального)
Изучаемые параметры Исходные значения n=6 Тироксин 14 дней n=6 5-й день отмены тироксина n=6
Стах, нг/мл 385,9±54,7 234,0±22,4*, ** 320,1±24,1
Tmax, ч 4,0 (3,0; 4,0) 4,0 (4,0; 5,0) 4,0 (4,0; 4,0)
T, ч 28,9 (5,4; 29,02) 10,17 (6,07; 14,56) 8,17 (6,47; 20,34)
AUC0-t , нг/чмл 6886,9±1351,5 3795,7±767,7 4841,6±1011,8
AUC0-<» , нг/чмл 4058,4 (3609; 4394,9) 1526 (1449,3; 2148,8)* 2191,8 (2054,1; 3644,8)
Общий клиренс, л 16,1±4,0 30,1±6,5 22,2±3,6
Объем распределения, л 344,3±52,3 446,1±49,2 360,3±25,1
Cmax / AUC 0,072±0,021 0,077±0,017 0,081±0,016
MRT, ч 38,9 (10,0; 41,8) 17,1 (11,1;22,5) 14,8 (11,0; 27,8)
MRTt, ч 10,0 (8,8; 11,9) 6,5 (4,1; 6,7)* 6,0 (5,9; 9,7)*
ТТГ, мМЕ/л 0,7 (0,7; 0,8) 0,5 (0,4; 0,5)*, ** 0,7 (0,6; 0,8)
Т3, нмоль/л 1,2 (1,1; 1,6) 7,7 (7,2; 8,3)*, ** 1,1 (1,0; 1,1)
Т4, нмоль/л 39,8±0,6 139,1±13,0*, ** 60,7±7,5
Примечание: * — достоверные различия с данными у интактных животных, p<0,05; ** — достоверные различия с данными на 5 день отмены тироксина, p<0,05.
Таблица 2
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов при введении тироксина в дозе 100 мкг/кг массы (М±m — при распределении признаков; медиана, нижний и верхний квартиль — при распределении признака отличном от нормального)
Изучаемые параметры Исходные значения n=6 Тироксин 14 дней n=6 5-й день отмены тироксина n=6
Cmax, нг/мл 399,8±14,2 180,3±9,8*, ** 332,4±14,3*
Тт„, ч 4,0 (3,0; 4,0) 4,0 (4,0; 5,0) 4,0 (4,0; 4,0)
T , ч 13,5±4,0 7,7±4,4 12,8±1,9
AUC0-t , нг/чмл 3522,4 (3303,0; 3631,3) 1195,0 (1032,1; 1202,4)*, ** 3237,7 (1875,6; 3992,1)
AUC0_m , нг/чмл 5336,4±717,3 1937,1±666,3*, ** 4881,5±763,0
Общий клиренс, л 18,6±2,6 52,7±14,4*, ** 21,3±3,7
Объем распределения, л 329,9±47,5 445,9±72,9 372,5±20,8
Cmax/ AUC 0,084±0,0135 0,144±0,04 0,076±0,01
MRT, ч 20,9±5,1 13,8±6,2 19,7±2,6
MRTt, ч 10,5 (8,3; 10,8) 5,7 (5,1; 6,9)* 10,3 (6,3; 11,1)
ТТГ, мМЕ/л 0,6±0,02 0,5±0,03* 0,6±0,03
Т3, нмоль/л 1,8±0,09 9,9±0,5*, ** 4,2±0,6*
Т4, нмоль/л 70,0±4,3 241,6±12,9*, ** 42,1±1,8*
Примечание: * — достоверные различия с данными у интактных животных, p<0,05; ** — достоверные различия с данными на 5 день отмены тироксина, p<0,05.
Полученные данные представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата в случае нормального распределения признака или в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля — если распределение данных отличалось от нормального.
Результаты и их обсуждение Введение как низкой (25 мкг/кг массы), так и высокой дозы (100 мкг/кг массы) L-тироксина приводило к раз-
витию выраженного гипертиреоза, что проявлялось повышением уровней Т4 на 249,5% (p<0,05) и 245,1% (p<0,05), Т3 на 496,1% (p<0,05) и 450,0% (p<0,05) и снижением содержания ТТГ в сыворотке крови на 36,9% (p<0,05) и 19,4% (p<0,05) соответственно по сравнению с исходными значениями (табл. 1 и 2). Более выраженные изменения показателей у животных, получавших низкую дозу L-тироксина, связаны с исходно более низкими показателями уровней Т4, Т3
Рис. 1. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от гормонального статуса кроликов при введении тироксина в дозе 25 мкг/кг массы (коэффициент корреляции Спирмена). Обозначения: непрерывная линиия — прямопропорциональная связь; пунктирная линия — обратнопропорциональная связь между признаками.
и более высоким уровнем ТТГ в данной серии опыта (табл. 1). На 5-й день отмены низкой дозы L-тироксина происходила нормализация гормонального статуса лабораторных животных. В отличие от данных этой серии, на 5-й день отмены высокой дозы L-тироксина содержание Т3 оставалось повышенным на 133,3% (p<0,05), концентрация Т4 снижалась на 39,9% (p<0,05), уровень ТТГ соответствовал норме.
При изучении фармакокинетики фек-софенадина — маркерного субстрата Pgp на фоне введения тироксина — получены результаты, которые представлены в табл. 1 и 2.
Применение кроликам L-тироксина в дозе 25 мкг/кг в течение 14 дней вызывало снижение С на 39,4% (p<0,05),
max чг i/i
AUC0-t — на 62,4% (p<0,05), MRTt — на 35,0% (p<0,05) по сравнению с исходными значениями. На 5-й день отмены L-тироксина изучаемые параметры возвращались к норме и достоверно от исходных значений не отличались, за исключением MRTt, которое оставалось сниженным на 40,0% (p<0,05).
При введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы в течение 14 дней наблюдалась схожая динамика показателей, но выраженная в большей степени. С снизилась на 54,9% (p<0,05), AUC.
max ’ vr •> /•> д-ад
- на 63,7% (p<0,05), MRTt - на 45,7% (p<0,05), общий клиренс увеличился на 183,3% (p<0,05). На 5-й день отмены высокой дозы L-тироксина С оставалась
max
сниженной на 16,8% (p<0,05), остальные изучаемые фармакокинетические параметры достоверно от исходных значений не отличались (p>0,05).
Оценка зависимости фармакокинетических параметров от гормонального статуса показала (рис. 1), что у животных, получавших L-тироксин в низкой дозе, имелась прямая пропорциональная связь между уровнем ТТГ — Cmax фек-софенадина (R=0,65, p=0,005) и AUC0t (R=0,5, p=0,042); уровнем Т3 и объемом распределения (R=0,53, p=0,03); содержанием Т4 и T (R=0,51; p=0,04) и об-
max
ратно пропорциональная связь между уровнем Т3 и Cmax (R=-0,6; p=0,01); содержанием Т4 — Cmax (R=-0,56; p=0,019) и AUC0-t (R=-0,67; p=0,003).
Рис. 2. Зависимость изучаемых фармакокинетических параметров от гормонального статуса кроликов при введении высокой дозы тироксина в дозе 100 мкг/кг массы (коэффициент корреляции Спирмена). Обозначения: непрерывная линиия — прямопропорциональная связь; пунктирная линия — обратнопропорциональная связь между признаками.
У животных, получавших L-тироксин в высокой дозе, наблюдалась (рис. 2) прямая пропорциональная связь между уровнем ТТГ и AUC0 (R=0,48; p=0,049); содержанием Т3 — Tmax (R=0,6; p=0,01), общим клиренсом (R=0,73; p=0,0012); концентрацией Т4 — Tmax (R=0,5; p=0,038), общим клиренсом (R=0,54; p=0,029). Обратно пропорциональная связь отмечалась между концентрацией Т3 — С (R=-0,857; p=0,0001), AUC ,
max 4 ’ ’ L ’ ' ’ 0-t’
(R=-0,77; p=0,0003), AUC0-ra (R=-0,77; p=0,0002) и MRTt (R=-0,72; p=0,001); уровнем Т4 — AUC0t (R=-0,6; p=0,01), AUC0-ra (R=-0,6; p=0,01) и MRTt (R=-0,55; p=0,023).
Pgp — белок-транспортер, обладающий широкой субстратной специфичностью. В научной литературе описан ряд лекарственных средств, влияющих на функциональную активность гликопротеина-Р, повышающих ее (индукторы) или снижающих (ингибиторы) [2].
В настоящем исследовании изучено влияние L-тироксина на функциональную активность Pgp на уровне целого ор-
ганизма, что позволяет прогнозировать фармакокинетику субстратов белка-транспортера. Показано, что на фоне введения L-тироксина происходит снижение Cmax, AUC0 га, AUC01, MRTt и одновременно повышение общего клиренса фексо-фенадина, что свидетельствует о повышении активности белка-транспортера Pgp. В то же время увеличение общего клиренса (характеризующего выведение лекарственных веществ из организма) и отсутствие изменений в отношении Cmax/AUCQra (характеризующего всасывание лекарственных веществ) можно рассматривать как селективное повышение активности Pgp под действием L-тироксина в печени и почках — органах, ответственных за выведение фексофена-дина. Полученные данные косвенно свидетельствуют о тканеспецифичной индукции Pgp. Более выраженные изменения фармакокинетики фексофенадина при введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы по сравнению с дозой 25 мкг/кг являются следствием дозозависимой стимуляции активности Pgp.
Результаты исследования сопоставимы с данными по изучению экспрессии Pgp у крыс с гипертиреозом. Авторы выявили существенное повышение экспрессии Pgp в печени и почках, умеренное — в тощей и подвздошной кишке, что позволило им сделать вывод о тканеспецифичной индукции экспрессии белка-транспортера [7]. Активация Pgp под влиянием тироксина может быть связана со стимуляцией ядерных рецепторов и индукцией экспрессии Pgp, которая опосредована увеличением транскрипции мРНК, кодируемой геном mdr1a/b , что обнаружено в ткани почек у крыс [7, 10].
На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 обнаружено, что Т3 выводится из клеток Pgp [6]. Аналогичные данные получены для Pgp в гемато-энцефалическом барьере. Показано, что белок-транспортер регулирует проникновение Т4 в спинно-мозговую жидкость [11].
На культуре клеток кишечника человека Сасо-2 выявлено, что Т3 регулирует экспрессию и функции Pgp. Установлено, что накопление дигоксина в клетках Сасо-2 существенно снижалось при использовании Т3. [8]. Таким образом, ти-реоидные гормоны являются субстратами и тканеспецифичными индукторами Pgp, а дисфункция щитовидной железы способна существенно изменять фармакокинетику лекарственных веществ.
Выводы
1. Введение кроликам L-тироксина подкожно в дозах 25 и 100 мкг/кг массы в течение 14 дней приводит к развитию экспериментального гипертиреоза, который характеризуется повышением уровней Т3 и Т4 и снижением уровня ТТГ в сыворотке крови.
2. L-тироксин, назначаемый кроли-
кам в течение 14 дней, вызывает до-зозасисимую индукцию активности гликопротеина-Р, определяемую по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, что подтверждается снижением С , AUC , MRTt (дозы 25 и
max’ 0-t’
100 мкг/кг) и увеличением общего клиренса (доза 100 мкг/кг).
3. Выявляется обратная корреляция между уровнем Т3 и Cmax фексофенадина при назначении L-тироксина в низкой и высокой дозах.
Список литературы
1. Айвазова А.С., Колхир В.К. Па-
тент 2357296 Рос. Федерация. МПК 609823/28 Способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба. Всероссийский научно-исследова-
тельский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР); № 2007143562/14; заявл. 27.11.2007; опубл. 27.06.2009.
2. Годовалов А.П. Адренергическая регуляция фагоцитарной активности нейтрофилов при экспериментальном тиреотоксикозе // Вестник уральской медицинской академической науки. 2010. № 2/1 (29). 112 с.
3. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук: 14.00.25 / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. ИМ. Сеченова. М. 2007. 21 с.
4. Кукес В.Г, Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализационной медицины: руководство для врачей — М.: ГЭО-ТАР-МЕДиа. 2008. 304 с.
5. Раменская Г.В., Скуридина Е.В., Красных Л.М. Разработка методики количественного определения маркера активности Р-гликопротеина фексофенадина в плазме крови // Хим. фарм. журн. 2006. том 40. № 12. С. 47-50.
6. Kassem N. et al. Thyroxine (T4) transfer from CSF to choroid plexus and ventricular brain regions in rabbit: contributory role of P-glycoprotein and organic anion transporting polypeptides // Brain Res. 2007. Vol. 1181.P. 44-50.
7. Mitchell A. Thyroid hormone export from cells: contribution of P-glycopro-tein / A. Mitchell, M.Tom, R. Mortimer // Endocrinol. 2005. Vol. 185. № 1. P. 93-98.
8. Nishio N. Modulation of P-glycopro-tein expression in hyperthyroid rat tissues / [et al.] // Journal of endocrinology. 2005. Vol. 185. P. 93-98.
9. Nishio N., Katsura T., Inui K. Thyroid hormone regulates the expression and function of P-glycoprotein in Caco-2 cells // Pharm. Res. 2008. Vol. 25(5). P. 1037-1042.
10. Reibeiro R.C.J. et al. The molecular biology of thyroid hormone action // Ann NY Acad Sci. 1995. Vol.758. P.366-389.
11. Sarkadi B, Homolya L., Szakocs G. et al. Human Multidrug Resistance ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoimmunity Defense System // Physiol. Rev. 2006. Vol. 86. P. 1179-1236.
Dose-dependent thyroxine influence of P-glycoprotein functional activity in the experiment
E.N. Yakusheva, A.V. Shchulkin, A.S. Byryukova
In the research on the rabbits influence of L-thyroxine on the activity of the protein-transporter P-glycoprotein (Pgp) was studied. Activity of the Pgp was studied on the pharmacokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of L-thyroxine within 14 days lead to the dose-dependent induction of Pgp activity.
Key words: P-glycoprotein, MDR1, L-thyroxine, hyperthyroidism, fexofenadine.
