CC BY
42
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2011 УДК 616.62-003.7-056.4
ВЛИЯНИЕ ТИРОКСИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Е.Н. Якушева, А.С. Бирюкова, А.В. Щулькин, Л.В. Никифорова
ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Рязань
В исследовании на кроликах изучено влияние Ь-тироксина на активность белка-транспортера гликопротеина-Р (Р§р). Активность Р§р изучали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина. Установлено, что введение Ь-тироксина в течение 14 дней приводит к дозозависимому повышению активности Р§р.
Ключевые слова: гликопротеин Р, МБК1, Ь-тироксин, гипертиреоз, фексофенадин
Гликопротеин-Р (Ряр) - белок-транспортер, обеспечивающий выведение липофильных ксенобиотиков и ряда био-биотиков из клеток и как следствие защиту организма от действия лекарственных и токсических веществ [1].
В эксперименте и клинике исследовано большое количество препаратов как естественного, так и синтетического происхождения, которые оказывают влияние на функциональную активность Pgp, причем как индуцирующее, так и ингибирующее. Подобное воздействие на белок-транспортер приводит в конечном счете к значительным нарушениям фармакокинетики лекарственных веществ и, как следствие, к изменению их фармакологической активности [1].
Влияние тиреоидных гормонов на функциональную активность Рgp остается недостаточно изученным.
Цель настоящего исследования -изучить влияние Ь-тироксина на функциональную активность Рgp у кроликов породы шиншилла.
Материалы и методы Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах породы шиншилла, средней массой 3500±100 г. В исследование включали самок, которые находились в состоянии течки. Ь-тироксин (ВегИи-СИет Ме-
narini) вводили подкожно в течение 14 дней: 6 самкам - в дозе 25 мкг/кг массы (серия низкая доза тироксина) и 6 самкам
- в дозе 100 мкг/кг массы (серия высокая доза тироксина). За сутки до начала эксперимента, через 14 дней введения L-тироксина и на 5 день отмены препарата у животных определяли активность Pgp и уровень ТТГ, Т3 и Т4 в сыворотке крови.
Активность белка-транспортера оценивали по концентрации в плазме крови его маркерного субстрата - фексофенадина (Sa-nofi Aventis). Фексофенадин вводили животным перорально с помощью металлического зонда в дозе 30 мг/кг массы. Через 1,
2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа от момента введения препарата из ушной вены кроликов забирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -290С. Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Beckman Coulter» с ультрафиолетовым детектором и колонке «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. [2] в собственной модификации. Анализ выполняли при длине волны 225 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Использовали подвижную фазу следующего
состава: 133,7 мл бидистиллированной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтила-мина (Chem-Lab), доведенной ортофосфор-ной кислотой до рН 4 и 64 мл ацетонитрила (Chem-Lab). Осуществляли жидкостную экстракцию фексофенадина из плазмы крови. В качестве экстрагентов использовали дихлорметан (ACROS ORGANICS), этил-ацетат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИММЕД). Коэффициент экстракции составил 53%.
Количественное определение фек-софенадина выполняли по методу абсолютной калибровки, с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Представлено уравнение калибровочной зависимости для определения фексофенадина в плазме крови: y = ах + b = -0,0001+9,4089* 10-6*x, где у - высота пика фексофенадина в единицах экстинк-ции, х - содержание фексофенадина в стандартном растворе в нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равнялся 0,9958.
Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими характеристиками: время удерживания - 13,7 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови 90 нг/мл; точность - 4,2%.
Вычисление концентрации фексофе-надина осуществляли с помощью программы Gold. Фармакокинетические параметры (максимальную концентрацию -Cmax, площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время AUC0-M, общий клиренс, объем распределения) рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение Cmax/AUC0-M рассчитывали самостоятельно.
Уровень гормонов определяли радио-иммунным методом с применением стандартных тест-систем производства
IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей обработкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ РязГМУ.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программ Stat-soft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-
Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой серии использовали тест ЛМОУЛ повторных измерений, межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для каждого показателя рассчитывали среднее арифметическое значение и ошибку среднего (М±т).
Результаты и их обсуждение
Введение как низкой дозы (25 мкг/кг массы) так и высокой дозы Ь-тироксина (100 мкг/кг массы) приводило к развитию выраженного гипертиреоза, что проявлялось повышением уровней Т4 на 249,5% (р<0,05) и 245,1% (р<0,05), Т3 на 496,1% (р<0,05) и 450,0% (р<0,05) и снижением содержания ТТГ в сыворотке крови на 36,9% (р<0,05) и 19,4% (р<0,05) соответственно по сравнению с исходными значениями (табл. 2).
Более выраженные изменения показателей у животных, получавших низкую дозу Ь-тироксина, связаны с исходно более низкими показателями уровней Т4, Т3 и более высоким уровнем ТТГ в данной серии опыта (табл. 2). На 5 день отмены низкой дозы Ь-тироксина происходила нормализация гормонального статуса лабораторных животных (р>0,05). В отличие от данных этой серии на 5 день отмены высокой дозы Ь-тироксина содержание Т3 оставалось повышенным на 133,3% (р<0,05), концентрация Т4 снижалась на 39,9% (р<0,05), уровень ТТГ соответствовал норме.
При изучении фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата Рgp на фоне введения тироксина, получены результаты, которые представлены в таблице 1.
Применение кроликам Ь-тироксина в дозе 25 мкг/кг в течение 14 дней вызывало снижение Стах (ключевого показателя оценки функциональной активности Рgp) на 39,4% (р<0,05) по сравнению с исходным значением. Остальные фармакокинетические параметры имели лишь тенденцию к изменению: ЛиС0-м - к уменьшению, а общий клиренс, объем распределе-
ния и отношение Cmax/AUC0-„ - к увеличению. На 5 день отмены L-тироксина изучаемые параметры достоверно от исходных значений не отличались.
При введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы в течение 14 дней наблюдалась схожая динамика показателей, но выраженная в большей степени. С^ снизилась на 54,9% (p<0,05), AUC0-M - на 63,7% (p<0,05), общий клиренс увеличился на 183,3% (p<0,05). Объем распределения и отношение Cmax/AUC0-„ имели тенденцию к увеличению (p>0,05). На 5 день отмены высокой дозы L-тироксина Сщ^ оставалась сниженной на 16,8% (p<0,05), остальные изучаемые фармакокинетические параметры достоверно от исходных значений не отличались (p>0,05).
Снижение Сщ^ и AUC0-M фексофена-дина, более выраженное при введении высокой дозы L-тироксина, свидетельствует о повышении активности белка-
транспортера Рgp. В тоже время увеличение общего клиренса (характеризующего выведение лекарственных веществ из организма) и отсутствии изменений в отношении Cmax/AUC0-M (характеризующего всасывание лекарственных веществ) можно рассматривать как косвенное свидетельство селективного повышения активности Рgp под действием L-тироксина в печени и почках - органах ответственных за выведение фексофенадина (80% препарата активно секретируется Рgp в желчь и 20% в мочу). Данная гипотеза согласуется с результатами полученными ранее в эксперименте на крысах с гипертиреозом, в котором установлено, что экспрессия Pgp существенно повышалась в печени и почках, умеренно в тощей и подвздошной кишке [7]. Более выраженные изменения фармакокинетики фексофенадина при введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы по сравнению с дозой 25 мкг/кг являются следствием дозозависимой индукции Рgp.
Молекулярные механизмы индукции и ингибирования Рgp в настоящий момент активно изучаются. Описано повышение экспрессии гена MDR1, кодирующего Рgp, под действием ЦОГ-2 [8], фактора индуцируемого гипоксией [4], за счет активации
ядерного прегнан-Х-рецептора [5]. Предполагается, что индукция Рgp может быть опосредована через фактор некроза опухоли альфа [3]. Активация Рgp под влиянием тироксина может быть связана со стимуляцией ядерных рецепторов и индукцией экспрессии Рgp, которая опосредована увеличением транскрипции мРНК гена mdr1, что обнаружено в ткани почек у крыс [9].
На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 обнаружено, что T3 выводится из клеток Pgp [6]. Аналогичные данные получены для Pgp в гематоэнцефа-лическом барьере. Показано, что белок -транспортер регулирует проникновение T4 в спинно-мозговую жидкость [10]. Tаким образом, тиреоидные гормоны являются субстратами и тканеспецифичными индукторами Pgp, а дисфункция щитовидной железы способна существенно изменять фармакокинетику лекарственных веществ.
Выводы
1. Введение кроликам L-тироксина подкожно в дозах 25 и 100 мкг/кг массы в течение 14 дней приводит к развитию экспериментального гипертиреоза, который сопровождается повышением уровней T3 и T4 и снижением уровня TTT в сыворотке крови.
2. L-тироксин, назначаемый кроликам в течение 14 дней, вызывает повышение активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, что подтверждается снижением Сщж (дозы 25 и 100 мкг/кг), а также уменьшением AUC0-„ и увеличением общего клиренса (доза 100 мкг/кг).
3. L-тироксин является дозозависимым индуктором гликопротеина-Р.
Литература
1. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализацион-ной медицины: руководство для врачей / В.Г. Кукес [и др.]. - М.: ГЭОTАР-МEДиа, 2008. - 304 с.
2. Раменская Г.В. Разработка методики
количественного определения
маркера активности Р-гликопроте-ина фексофенадина в плазме крови /
Таблица 1
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина при введении тироксина (М±т)
Серии эксперимента Изучаемые параметры
Gmx, нг/мл AUC0-C , нг/чхмл Общий клиренс, л/ч Объем распределения, л С™» / AUC0-t
Доза тироксина 25 мкг/кг
Исходные значения 385,9±54,7 6886,9±1351,5 16,1±4,0 344,3±52,3 0,072±0,021
Тироксин 14 дней 234,0±22,4*, ** 3795,7±767,7 30,1±6,5 446,1±49,2 0,077±0,017
5 день отмены 320,1±24,1 4841,6±1011,8 22,2±3,6 360,3±25,1 0,081±0,016
Доза тироксина 100 мкг/кг
Исходные значения 399,8±14,2 5336,4±717,3 18,6±2,6 329,9±47,5 0,084±0,0135
Тироксин 14 дней 180,3±9,8*, ** 1937,1±666,3*,** 52,7±14,4*,** 445,9±72,9 0,144±0,04
5 день отмены 332,4±14,3* 4881,5±763,0 21,3±3,7 372,5±20,8 0,076±0,01
* - р<0,05 - достоверные различия со значениями у интактных животных (исходные значения),
** - р<0,05 - достоверные различия со значениями на 5 день отмены препарата.
Таблица 2
Гормональный статус кроликов при введении тироксина (М±т)
Серии эксперимента Изучаемые параметры
TTr, мМЕ/л Т3, нмоль/л Т4, нмоль/л
Доза тироксина 25 мкг/кг
Исходные значения 0,73±0,03 1,3±0,1 39,8±0,6
Тироксин 14 дней 0,46±0,02*, ** 7,8±0,3*, ** 139,1±13,0*, **
5 день отмены 0,70±0,03 1,1±0,03 60,7±7,5
Доза тироксина 100 мкг/кг
Исходные значения 0,62±0,02 1,8±0,09 70,0±4,3
Тироксин 14 дней 0,50±0,03* 9,9±0,5*, ** 241,6±12,9*, **
5 день отмены 0,59±0,03 4,2±0,6* 42,1± 1,8 *
* - р<0,05 - достоверные различия со значениями у интактных животных,
** - р<0,05 - достоверные различия со значениями на 5 день отмены препарата.
Г.В. Раменская, Е.А. Скуридина, Л.М. Красных // Хим.-фармац. журн.
- 2006. - Т. 40, №12. - С. 47-50.
3. Bauer B. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-gly coprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier / B. Bauer, A.M. Hartz, D.S. Miller // Mol. Pharmacol. -2007. - Vol. 71. - P. 667-675.
4. Digoxin and ouabain induce P-glycoprotein by activating calmodulin kinase II and hypoxia-inducible factor-1alpha in human colon cancer cells / C. Riganti [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, №3. - P. 385-392.
5. Geick A. Nuclear receptor response elements mediate induction of intestinal MDR1 by rifampin / A. Geick, M. Ei-chelbaum, O. Burk // J. Biol. Chem. -2001. - Vol. 276. - P. 14581-14587.
6. Mitchell A. Thyroid hormone export
from cells: contribution of P-
glycoprotein / A. Mitchell, M. Tom,
R. Mortimer // Endocrinol. - 2005. -Vol. 185, № 1. - P. 93-98.
7. Modulation of P-glycoprotein expression in hyperthyroid rat tissues / N. Ni-shio [et al.] // Journal of endocrinology.
- 2005. - Vol. 185. - P. 93-98.
8. Patel V.A. Regulation of MDR-1 (P-glycoprotein) by cyclooxygenase-2 / V.A. Patel, M.J. Dunn, A. Sorokin // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. -P. 38915-38920.
9. The molecular biology of thyroid hormone action / R.C.J. Reibeiro [et al.] // Ann NY Acad Sci. - 1995. - Vol. 758.
- P. 366-389.
10. Thyroxine (T4) transfer from CSF to choroid plexus and ventricular brain regions in rabbit: contributory role of P-glycoprotein and organic anion transporting polypeptides / N. Kassem [et al.] // Brain Res. - 2007. -Vol. 1181. - P. 44-50.
INFLUENCE OF THE THYROXINE ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE F-GLYCOPROTEIN IN THE EXPERIMENT
E.N. Yakusheva, A.S. Byryukova, A.V. Shchulkin, L.V. Nikiforova
In the research on the rabbits influence of a L-thyroxine on the activity of the protein- transporter F-glycoprotein (Pgp) was studied. Activity of the Pgp was investigated on the pharmacokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of a L-thyroxine within 14 days lead to dose-dependent rising of Fgp activity.
Key words: Р-glycoprotein, MDR1, L-thyroxine, hyperthyroidism, fexofenadine.
Елена Николаевна Якушева - доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой фармакологии с курсом фармакотерапии ФПДО.
