CC BY
55
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
10. Voloshchuk, S. I., Voloshchuk, G. D. (2010). Effect of zearalenone treatment of CF and the efficiency of obtaining haplodes in anther culture of soft wheat and triticale. Modern biotechnology and biosafety of crop plants (Plant Genome VI) : VI International Conference, Odessa, 80.
11. Bullock, W. P., Baenziger, P. S., Shaeffer, G. W., Bottino, P. J. (1982). Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) Fi’s and Their reciprocal crosses.
Theoretical and Applied Genetics , 62 (2), 155-159.
doi: 10.1007/bf00293350
12. Tabatabaei, B. E. S., Saeidi, Gh., Sabzalian, M. R. (2007). Genetic analysis of androgenetic traits in wheat (Triticum aestivum L.). Iran. J. of biotechnology, 5(1), 34-41.
Рекомендовано до публікації д-р біол. наук Ігнатова С. О.
Дата надходження рукопису 17.11.2014
Замбріборщ Ірина Сергіївна, старший науковий співробітник, кандидат біологічних наук, Лабораторія культури тканин, Селекційно-генетичний інститут Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення, Овідіопольська дор., 3. м. Одеса, Україна, 65036 E-mail: izambriborsh@gmail.com
Шестопал Оксана Леонідівна, старший науковий співробітник, кандидат біологічних наук, Лабораторія культури тканин, Селекційно-генетичний інститут Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення, Овідіопольська дор., 3. м. Одеса, Україна, 65036 E-mail: oksana shestopal@mail.ru
УДК 579.62
DOI: 10.15587/2313-8416.2014.32023
ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОБІОТИЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ШТАМІВ Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
©В. О. Мілян, М. А. Хархота, О. О. Нечипуренко
Проведено дослідження пробіотичних властивостей, виділенних з навколишнього середовища штамів Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113. Встановлено їх морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки, досліджено та встановлено високу та середню антагоністичну активність щодо музейних та актуальних штамів умовно патогенних мікроорганізмів. Показана стійкість до низьких та високих значень рН та різних концентрацій жовчних кислот
Ключові слова: бацилярні пробіотики, антагоністичні активність бацил, кормові пробіотики, вплив жовчі на бацили, атибіотики
It is conducted the research of probiotic properties discharged from the environment Bacillus sp. 1.1. and B. amyloliquefaciens UKM B-5113 strains. It is determined their morphological and physiological and biochemical characteristics, investigated and found high and average antagonistic activity against actual museum and opportunistic strains of microorganisms. It is shown a resistance to low and high pH values and different concentrations of bile acids
Keywords: bacillus probiotics, bacillus antagonistic activity, feed probiotics, bacillus react to bile, antibiotics
1. Вступ
На сьогоднішній день значного поширення набули шлунково-кишкові розлади дисбактеріозного типу, вони викликають проблеми не лише у людей, а й у сільськогосподарських тварин. За наявності шлунково-кишкових інфекцій в сільськогосподарських тварин погіршується їх самопочуття та зменшується продуктивність, можлива навіть їх загибель, що призводить до негативних наслідків для усього господарства. Часто для лікування шлунково-кишкових захворювань застосовують антибіотичні та пробіотичні препарати.
Принцип дії антибіотичних речовин полягає у їх бактеріостатичній чи бактерицидній дії на чутливі мікроорганізми [1, 2]. Незалежно від спектру дії антибіотика його використання може призводити до загибелі не лише шкідливої, а значної кількості корисної мікрофлори. Зникнення корисної мікро-
флори призводить до ряду негативних наслідків: збільшення ризику повторного інфікування патогенною мікрофлорою, яка надходить разом із їжею; сповільнення природних процесів біодеградації компонентів спожитої їжі, зниження їх енергетичної цінності за рахунок неповного розкладання та всмоктування організмом. Зменшення кількості споживаних речовин призводить до зменшення кількості енергії, яку отримує організм, що призводить до зниження його фізичної та розумової активності.
Аспектом, який відіграє велику роль у використанні антибіотичних речовин є виникнення резистентності у патогенних мікроорганізмів до цих антибіотиків [2], що змушує людей синтезувати нові антибіотики, або циклічно змінювати їх для запобігання неефективного використання антибіотиків до яких розвинулася резистентність.
Використання антибіотичних препаратів у
15
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
сільському господарстві призводить до частого виникнення у сільськогосподарської худоби чи птиці різних дисбіотичних станів та шлунково-кишкових інфекцій, які за відсутності адекватного лікування призводять до загибелі худоби чи птиці, а за відсутності лікування - до випуску біологічно небезпечної продукції.
Альтернативною використання антибіотиків є пробіотики. Пробіотики - лікарські препарати, які містять у своєму складі вегетативні клітини або спори пробіотично-активного мікроорганізму, застосування яких призводить до покращення стану мікрофлори шлунково-кишкового тракту, за умов її дестабілізації [3].
Принцип дії пробіотичних препаратів полягає у відновлені мікрофлори кишківника, яка обумовлена антагоністичною дією до певних видів мікроорганізмів, які спричинюють захворювання шлунково-кишкового тракту. Активність щодо патогенних штамів може бути різною та варіюватись від штаму до штаму, у чому й полягає основна відмінність між різними типами пробіотиків [3].
Більшість пробіотичних препаратів має здатність не лише поліпшувати стан мікрофлори, а й сприяти покращенню процесу засвоювання їжі. Такий ефект досягається за використання штамів пробіотично-активних мікроорганізмів, які мають різну ферментативну активність: протеолітичну,
целюлозолітичну, ксиланолітичну, амілолітичну
тощо. Такі мікроорганізми здатні виділяти ферменти, які розщеплюють білки, целюлозу, крохмаль, ксилани, тобто біологічні сполуки, які містяться у кормі худоби чи птиці.
Крім здатності поліпшувати процес засвоєння поживних речовин з їжі пробіотичні штами можуть продукувати біологічно-активні речовини, зокрема: вітаміни, амінокислоти, тощо. Використання пробіо-тичних штамів, які окрім антагоністичних властивостей мають здатність продукувати біологічно-активні речовини, як компонент корму для сільськогосподарської худоби чи птиці призводить до підвищення швидкості нарощування ваги худоби та птиці, скоротити час їх вирощування, зменшити частоту загибелі та збільшити загальний прибуток.
2. Постановка проблеми
Широке застосування антибіотиків у тваринництві та птахівництві призводить до виникнення у худоби та птиці різник дисбіотичних станів та шлунково кишкових інфекцій. Дане явище пов’язано із невибірковою дією антибіотиків, яка призводить до знищення не тільки патогенної мікрофлори, а й нормальної мікрофлори, що у свою чергу призводить до порушення процесів розщеплення кормів та всмоктування з них поживних речовин.
Для ліквідації спалахів шлукново-кишкових інфекцій антибіотики підходять якнайкраще, тому що швидко знищують шкідливу мікрофлору, проте можливе виникнення побічних ефектів, описаних вище, а також можлива відсутність чи низька ефективність антибіотика в разі наявності
резистентності до нього. Отже, використання
антибіотиків для профілактики та лікування шлунково-кишкових захворювань у худоби/птиці може негативно вплинути на стан готової продукції та на загальний вихід останньої.
Використання пробіотиків для профілактики шлунково-кишкових хвороб є позитивним, при цьому патогенні мікроорганізми не набуватимуть резистентності до антибіотиків, які можуть бути застосовані у крайньому випадку, тварини які споживають пробіотики будуть швидше та у повному обсязі засвоювати корисні речовини з кормів, що призведе до швидшого набору маси.
3. Літературний огляд
Пробіотики - живі мікроорганізми, вживання яких у адекватних кількостях призводить до покращення стану здоров'я пацієнта [4]. Бактерії роду Bacillus використовуються у якості пробіотиків щонайменше 55 років. Першим препаратом на основі бактерій роду Bacillus, який виявляв пробіотичні властивості був італійський препарат Enterogermina®, зареєстрований у 1958 році [4]. Проте, підвищений науковий інтерес до пробіотиків на основі бацил з'явився лише в останні 20 років. В основному цікавість дослідників викликають так види бацил як: B.subtilis, B.clausii, B.cereus, B.coagulans, B.licheniformis [4].
На сьогоднішній день пробіотики на основі бацил займають стійку ланку на ринку пробіотиків, які застосовуються для лікування як людей так і тварин [5].
Особливістю пробіотиків на основі бацил є те, що вони здатні утворювати спори, які є стійкими до агресивних чинників навколишнього середовища [4,
5]. Вони здатні зберігати свою життєздатність у широких діапазонах значень рН та температури [4, 5]. Безліч бактерій роду Bacillus є природними продуцентами різних ферментних препаратів, антибіотиків та інших біологічно-активних речовин
[2], які підвищують їх стійкість по відношенню до інших агресивних мікроорганізмів. Враховуючи те, що бацили - ґрунтові мікроорганізми деякі з них отримали здатність до синтезу меланінів та каротиноїдів, які позитивно вливають на макроорганізми [6].
Вимоги до пробіотичних штамів мікроорганізмів
Комітет ООН з продовольчих питань і сільського виробництва і Всесвітня організація охорони здоров'я опублікували наступні вимоги до пробіотичних мікроорганізмів [3]:
- штами, що пропонуються для виробництва пробіотиків, мають бути виділені від здорових людей або видів тварин, для яких вони будуть призначені;
- повинні мати чітке фізіолого-біохімічне та генетичне маркування, як для унеможливлювання фальсифікацій, так і для періодичного контролю ідентичності вихідних пробіотичних штамів та виробничих культур у процесі їх культивування;
- мають позитивно впливати на організм хазяїна, що підтверджується лабораторними і клінічними випробуваннями;
16
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
- у разі введення у великих кількостях повинні характеризуватися мінімальною здатністю до транс-локації з просвіту травного тракту у внутрішнє середовище макроорганізму;
- за тривалого використання не повинні викликати побічних ефектів;
- не повинні пригнічувати нормальний мікро-біоценоз;
- мають бути нешкідливими для людей, ураховуючи імунологічну безпеку;
- повинні мати колонізаційний потенціал, тобто бути стійкими до природних інгібіторів трав-ного тракту ( низьких значень рН, жовчних кислот, ферментів травлення, антимікробних субстанцій, синтезованих індигенною мікрофлорою), добре адгезуватися до епітелію відповідних слизових оболонок;
- повинні мати природну стійкість щодо сучасних антибактеріальних препаратів;
- повинні мати стабільні характеристики, як з клінічного погляду, так і з технологічного;
- повинні мати високу швидкість росту та розмноження в умовах, наближених до умов шлунково-кишкового тракту;
- мають потрапляти в організм людини в активній формі, минаючи тривалі етапи реактивації клітин, що дасть їм змогу одразу проявляти свою біологічну активність, успішно конкуруючи з потенційними патогенами.
Оскільки більшість бактерій роду Bacillus не є патогенними, стабільні при зберіганні, не пригнічують життєдіяльність представників нормального мікробіоценозу кишківника, можна свідчити про можливість використання бацил у вигляді пробіотичних штамів.
Ринкова ситуація
На сьогоднішній день на ринку України представлена велика кількість пробіотичних препаратів на основі бацил [7]. До основних відносяться настпні: “Біоспорин”, “Бактерин-СЛ”, “Ендоспорин”, “БіоПлюс”, “Моноспорин”. Усі вони містять у собі суміш бактерій B.subtilis B.lichemiformis [7].
Препарати виявляють анатагоністичну активність відносно бактерій родів Campylobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Escherichia, Staphylococcus, грибів роду Candida. Стимулюють підвищення імунітету макроорганізму шляхом активації макрофагів, посиленню продукції лізоциму та інтерферону. Бацили які входять до складу пробіотиків не впливають на нормальну мікрофлору кишківника [7].
Таким чином на ринку України представлено широкий спектр пробіотичних препаратів бацилярного походження. Проте це не є перешкодою для дослідженнь у цій сфері. Наявні на ринку пробіотики з плином часу можуть втрачати свою ефективність до актуальних патогенних штамів, у зв'язку із мутаціями останніх або мутаціями самих культур бацил.
4. Дослідження пробіотичних властивостей штамів Bacillus. sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
У зв’язку із наявністю вимог до пробіотично-активних мікроорганізмів нами було проведено
біохімічну ідентифікацію досліджуваних штамів Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113.
Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 - грам позитивні аеробні палички, здатні утворювати ендоспори (табл. 1). У мазках 18-24 годинної культури відмічаються поодинокі або розташовані короткими ланцюжками клітини з центральним розташуванням ендоспор, що не роздувають клітини. Біохімічна характеристика штамів Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 наведена у табл. 1.
Таблиця 1
Біохімічні властивості штамів Bacillus sp. 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113___________
Ознака Результат, + - наявність, - відсутність
Bacillus sp. 1.1 B. amylo-liquefaciens УКМ В-5113
Довжина клітин > 3 мкм - -
Позитивне фарбування за Грамом + +
Спори овальні + +
Спори розташовані центрально + +
Роздування клітини - -
Гідроліз ескуліну + +
Гідроліз казеїну + +
Гідроліз крохмалю + +
Наявність уреази - -
Стійкість до хлорамфеніколу - -
Стійкість до налідиксивої кислоти - -
Стійкість до поліміксину + +
Стійкість до стрептоміцину - -
Утворення кислоти з:
Целобіози + -
Фруктози + +
Галактози - -
Лактози - -
Маннози + +
Рафінози - -
Саліцину + -
Ксилози + +
Утилізація цитрату - -
Утилізація сукцинату + +
Ріст при 50 °С - -
Ріст в присутності 10 % NaCl - -
Анаеробний ріст - -
Редукція нітратів - -
Наявність оксидази + +
Тест Вогер-Проскауера + +
17
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
Для встановлення штамової приналежності досліджуваних мікроорганізмів згідно біохімічних властивостей нами було використано програмне забезпечення Identax 1.2. Ідентифікувати штам з точністю до 95,00 % нам не вдалося. Найбільш близьким таксоном до досліджуваного штаму Bacillus sp. 1.1 з 66,17 % подібності є B. subtilis ssp. subtilis. Встановлена 21,75 % подібність з B. Amy-loliquefaciens, 7,74 % - B. pumilis та 3,60 % B. cereus. Незважаючи на близькість штаму Bacillus sp. 1. 1 до B. subtilis ssp. subtilis, відмічено, що він володіє кількома атиповими біохімічними ознаками: при культивуванні з рафінозою штам Bacillus sp. 1.1 не продукує кислоту, а 99 % штамів B. subtilis ssp. subtilis продукують; штам Bacillus sp. 1.1 не здатен утилізувати цитрат та не росте при 50 °С, а 87,00 %
штамів даного виду здатні до росту за вказаної температури і утилізації цитрату.
Проте необхідно враховувати, що штами B. subtilis володіють широкою та різноманітною біохімічною активністю. Варто зазначити, що до останнього часу види B. subtilis та B. Amylo-liquefaciens відносилися до виду B. subtilis, а різниця між ними на фізіолого-біохімічному та навіть молекулярно-генетичному рівнях є незначною. Антагоністична активність Висока антагоністична активність - одна з головних вимог до пробіотичних штамів, тому нами було визначено дану характеристику досліджуваних штамів бацил щодо колекційних штамів умовно патогенних та патогенних мікроорганізмів (рис. 1).
30
25-
;20
V/A B. subtilis 1.1
Ї15
10
5
0
Рис. 1. Антагоністична активність досліджуваних штамів B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо музейних штамів тест-культур
Встановлено, що B. subtilis 1.1. характеризується високою антагоністичною активністю щодо Shigella flexnery ДІСК 36/59, Proteus vulgaris УКМ B-905, P. vulgaris УКМ U-8 та Staphylococcus aureus УКМ В-918 зони затримки росту яких становили 16,7, 20,0, 15,3 та 22,3 мм. Середній рівень антагонізму штам проявляв щодо Salonella thyphimurium УКМ В-928, S. abony УКМ B-921 та Escherichia coli УКМ В-906, пригнічуючи ріст останніх на 10-12 мм. Визначено, що B. subtilis 1.1. володів низьким рівнем антагоністичної активності щодо S. enterica УКМ В-920, S. derby ДІСК 1519 та Pseudomonas aeruginosa УКМ В-329.
У той час B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 характеризувався високою антагоністичною активністю лише щодо S. aureus УКМ В-918, зони затримки росту якого становили 17,3 мм. Ріст інших досліджуваних тест-культур був пригнічений менше ніж на 10 мм.
Таким чином нами було досліджено антагоністичну активність досліджуваних штамів B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо музейних штамів умовно-патогенних мікроорганізмів (УПМ). Проте відомо, що мікроорганізми за тривалого зберігання можуть змінювати свої біоло-гічні властивості, зокрема втрачати фактори патоген-ності.
Тому нами було досліджено антагоністичну активність штамів B. subtilis 1.1. та B. Amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо широкого спектру актуальних штамів УПМ, які були виділені з домашніх птахів та тварин хворих на шлунково-кишкові інфекції. Роль виділених ізолятів в патогенезі захворювань була підтверджена шляхом біопроби на лабораторних мишах. У зв’язку з тим, що кількість виділених ізолятів певного виду УПМ були значними, а антагоністична активність бацил може бути штамоспецифічною нами для візуалізації
18
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
отриманих результатів було використано метод статистичного розподілу антагоністичної активності за величиною зон затримки росту (рис. 2, 3).
Отримані дані свідчать, що антагоністична активність штаму B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо актуальних штамів E. coli (Пзаг=17) (рис. 2) була значно нижча за відповідні показники штаму B. subtilis 1.1. Також нами встановлено штамоспе-цифічний характер прояву антагоністичної активності досліджуваних штамів. Так штам B. Amylo-
liquefaciens УКМ В-5113 проявляв середню антагоністину активність на рівні 9 мм до 52 % від всіх досліджених ізолятів E. coli та високу - 15 мм до 11 % штамів. З частотою 6 % виділялися штами кишкової палички, до яких бацили проявляли низьку антагоністичну активність. Штам B. subtilis 1.1 був більш проявляв середню антагоністичну активність шодо E. coli - 58 % штамів пригнічувалося на
11-12 мм, 35 % на 14-17 мм.
Рис. 2. Розподіл антагоністичної активності штамів B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо ізолятів E. coli за величиною зон затримки росту останніх
Нами відмічено, що антагоністична активність штаму B. subtilis 1.1. щодо грампозитивних тесткультур була значно вища, ніж до грамнегативних, а активність штаму B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 не залежала від будови клітинної стінки тест-культур.
Зони затримки росту переважної більшості тест-культур S. aureus (рис. 3, а) та Streptococcus spp.
(рис. 3, б) штамом B. subtilis 1.1. становили 16-20 мм, що свідчить про високу антагоністичну активність. Відмічено також, що з частотою 7 % зустрічалися штами S. aureus та Streptococcus, антагоністична активність бацил, щодо яких була високою і сягала 24 мм.
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
8 10 12 14 16 18 20 22 24
Рис. 3. Розподіл антагоністичної активності штамів B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо ізолятів за величиною зон затримки їх росту: а - S. aureus, б - Streptococcus spp
19
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
Також було досліджено антагоністичну активність досліджуваних штамів бацил до ряду інших ізолятів представників родів Salmonella, Klebsiella, Enterococcus, Enterobacter, Pseudomonas (табл. 2).
Встановлено, що досліджувані штами бацил проявляють низьку антагоністичну активність щодо досліджених тест-культур Salmonella, Klebsiella, Enterococcus, Enterobacter, Pseudomonas. Антагоністична активність штаму B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо штамів P. aeruginosa sp 1, Enterococcus fecalis sp 1 та E. cloaceae sp 1 була відсутня. Штам Bacillus sp. 1.1 щодо даних тест-культур проявляв більшу активність. Необхідно відмітити, що антагоністична активність штаму Bacillus sp. 1.1 щодо актуальних штамів Salmonella sp лежала в межах 10 мм зон затримки росту, що згідно літературних даних є гранично допустимою мінімальною величною антагоністичної активності для пробіотичних штамів. Таким чином нами показано, що
досліджувані штами B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 володіли вираженою антагоністичною активністю до штамів S. aureus та Streptococcus, помірну до E. coli та Proteus spp та низьку до P. aeruginosa, Enterococcus fecalis та E. cloaceae.
Стійкість досліджуваних штамів щодо жовчі та низьких значень рН
При проходженні через ШКТ пробіотичні мікроорганізми піддаються негативному впливу ряду чинників: соляної кислоти шлунку, травних фермен-
тів, жовчі та жовчних кислот. Тому при відборі штамів мікроорганізмів, перспективних для створення пробіотиків на їх основі необхідно враховувати їх стійкість до несприятливих умов ШКТ. Перш за все при потраплянні до травного тракту мікроорганізми піддаються короткочасному (1-3 год) впливу соляної кислоти. У зв’язку з цим нами встановлено життєздатність досліджуваних штамів при рН 2,0-6,0 та тривалості експозиції 1 год (рис. 4).
B. subtilis. 1.1
рН середовища
рН середовища
Рис. 4. Життєздатність пробіотичних штамів
B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 при низьких значеннях рН середовища
Таблиця 2
Антагоністична активність досліджуваних штамів B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 щодо
_________________________Salmonella sp, K. pneumoniae, E. ^ fecalis та P. aeruginosa___________________
Штам мікроорганізму Зона затримки росту, мм
B. subtilis 1.1. B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
Salmonella sp 1160 9±1 7±1
Salmonella sp 99 10±2 7±1
Salmonella sp 272 10±1 8±1
Salmonella sp 1 8±2 8±2
Salmonella sp 2 10±1 7±1
K. pneumoniae sp 1 8±1 5±1
E. cloaceae sp 1 7±2 2,7±1
Enterococcus fecalis sp 1 7±2 2,7±2
P. aeruginosa sp 1 4,6±1 1,3±1
Встановлено, що штам B. subtilis 1.1 менш стійкий до дії низького рН, ніж B. amyloliquefaciens УКМ В-5113. Так за годинної інкубації при рН 2,0 відмічалося зниження кількості життєздатних клітин на 28,57 та 16,37 % відповідно, порівняно з контролем. При підвищенні рН середовища до 4,0 кількість життєздатних клітин B. subtilis 1.1 збільшувалася на
5,0 % порівняно з даними при рН 2, а штаму B. Amy-loliquefaciens УКМ В-5113 - 8 %. Слід відмітити, що при цьому ми використовували культуру бацил з 10 % рівнем споруляції, тобто в культурі переважали вегетативні клітини. При використанні в складі готового препарату переважно спорової культури, кількість життєздатних клітин була б значно більшою.
Штами мікроорганізмів, що перспективні для створення пробіотичних препаратів повинні бути стійкими до концентрацій жовчі не менше 0,4 %. Нами, встановлено, що досліджувані штами B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 здатні рости при всіх досліджуваних концентраціях жовчі (рис. 5).
Концентрація жовчі 0,2 % не впливала на ріст жодного з штамів. За умови збільшення концентрації жовчі 0,4 % відмічалося значне зниження кількості життєздатних клітин (на 70 %). В діапазоні концентрацій жовчі 0,6-1,0 % значення оптичної густини (ОГ) вирощеної суспензії B. subtilis 1.1 та B. Amyloliquefaciens УКМ В-5113 були у 13 та 6,6 разів менше за відповідні значення в контролі.
20
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
Головними складовими жовчі є жовчні кислоти, що переважно представлені кон’югатами з гліцином або таурином. При тяжких розладах травлення або циркуляції жовчних кислот в просвіт кишківника можуть надходити значні кількості некон'югованих жовчних кислот, що характеризуються значною подразливою дією на тканини кишківника та високою бактеріостатичною та бактерицидною діями на мікрофлору. Тому нами було досліджено ріст досліджуваних штамів B. Sub-tilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 в присутності холієвої (первинної некон'югованої жовчної кислоти) та дезоксихолієвої (вторинної) кислот (рис. 6, 7).
Y///A B. subtilis. 1.1
B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
Рис. 5. Ріст досліджуваних штамів B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 в присутності жовчі
Я B. subtilis. 1.1
£| B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
Концентрація холієвої кислоти (%) Концентрація холієвої кислоти (%)
Рис. 6. Ріст досліджуваних штамів B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 в присутності холієвої кислоти
Встановлено, що штами B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 здатні зберігати високі ростові показники за концентрації холевої кислоти в середовищі культивування 0,2 та 0,4 %, відповідно. Враховуючи, те що загальний рівень синтезу первин-них жовчних в людини становить 400-600 мг/добу, отримані нами результати свідчать, що ріст досліджуваних штамів бацил в кишківнику не буде інгібуватися цими речовинами. Отримані результати не узгоджуються з повідомленнями про те, що некон'юговані жовчні кислоти чинять більший
бактерицидний ефект, ніж кон'юговані. Можливо, бацили секретують у поживне середовище значну кількість амінокислот, в тому числі гліцину, який утворює глікохолієву кислоту, зменшуючи, таким чином, негативний вплив на бацили.
B. subtilis. 1.1
B. amyloliquefaciens УКМ В-5113
Дезоксихолієва кислота (%) Дезоксихолієва кислота (%)
Рис. 7. Ріст досліджуваних штамів B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 в присутності дезоксихолевої кислоти
При дослідженні впливу дезоксихолієвої кислоти на ріст штамів B. subtilis 1.1 та B. amy-loliquefaciens УКМ В-5113 були отримані суперечливі результати. При збільшенні концентрації дезоксихолієвої кислоти (ДХК) в середовищі культивування, збільшувався інгібуючий вплив останньої на ріст досліджуваних штамів. Проте при досягненні 0,6 та 0,8 % відсоткового вмісту жовчної кислоти в середовищі відмічалося значне підвищення оптичної густини суспензії бацил. При підрахунку кількості життєздатних клітин штамів бацил в даних варіантах досліду (дані не представлені), встановлено, що КУО/мл при 0,1 та 0,6 % вмісті ДХК для штаму B. subtilis 1.1 та 0,6 та 0,8 % для штаму B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 достовірно не відрізнялися. Збільшення ОГ суспензії викликано появою осаду, що імовірно, утворився з ДХК. Дане явище потребує більш докладних досліджень.
Таким чином, нами показано, що штами B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 здатні витримувати низькі значення рН середовища та високі концентрації жовчі, що задовольняє вимоги до пробіотичних культур.
Узагальнення
На сьогоднійшній день у зв'язку із
вининкненням резистентності у патогненних мікроорганізмів до актуальних антибіотиків широкого розповсюдження набувають пробіотичні препарати. У зв'язку із тим, що пробіотики на основі молочнокислих бактерій, як основних мешканців шлунково-кишкового тракту, часто мають низьку антагоніст-тичну активність науковці спрямовують свої дослідження на пошук культур з вищою антагоністичною активністю - наприклад бактерій роду Bacillus.
Отже, нами показано, що досліджувані штами B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 відповідають вимогам, що висуваються до пробіотичних штамів. Досліджувані нами штами -
21
Біологічні науки
Scientific Journal «ScienceRise» №5/1(5)2014
проявляють середню і високу антагоністичну активність до різних УПМ, здатні до росту за різних значень рН та концентрації жовчі. Особливістю їх є те, що вони здатні синтезувати пігменти кароти-ноїдної природи, який має провітамінну активність.
5. Висновки
Морфологічні та фізіолого-біохімчні дослідження показали, що досліджені мікроорганізми мають 66 % схожість із B. subtilis ssp. subtilis.
Досліджувані штами B. subtilis 1.1. та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 володіли вираженою антагоністичною активністю до штамів S. aureus та Streptococcus, помірну до E. coli та Proteus spp та низьку до P. aeruginosa, Enterococcus fecalis та E. Cloaceae.
Встановлено, що штами B. subtilis 1.1 та B. amyloliquefaciens УКМ В-5113 здатні витримувати низькі значення рН середовища та високі концентрації жовчі, що задовольняє вимогам до пробіотичних культур.
Література
1. Пирог, Т. П. Загальна мікробіологія [Текст]: підруч. / Т П. Пирог; 2-е вид., доп. і перероб. - К. : НУХТ,
2010. - 632 с.
2. Буценко, Л. М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів [Текст] : навч. посіб. / Л. М. Буценко, Ю. М. Пенчук, Т П. Пирог. - К. : НУХТ, 2010. - 323 с.
3. Старовойтова, С. О. Технологія пробіотиків [Текст] : підруч. / С. О. Старовойтова, О. І. Скроцька, Ю. М. Пенчук, Т П. Пирог. - К. : НУХТ, 2012. - 318 с.
4. Cutting, S. Bacillus probiotics [Text] / S. Cutting // Food Microbiology. - 2011. - Vol. 28, Issue 2. - P. 214-220. doi: 10.1016/j.fm.2010.03.007
5. Sanders, M. Sporoformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus [Text] / M. Sanders, L. Morelli, T. Tompkins // Comprehensive reviews in food science and food safety. - 2003. - Vol. 2, Issue 3. -P. 101-110. doi: 10.1111/j.1541-4337.2003.tb00017.x
6. Khaneja, R. Carotenoids found in Bacillus [Text] / R. Khaneja, L. Perez-Fons, S. Fakhry, L. Baccigalupi,
S. Steiger, E. To, G. Sandmann, T. Dong, E. Ricca, P. Fraser, S. Cutting // Journal of Applied Microbiology. - 2009. -Vol. 108, Issue 6. - P 1889-1902. doi: 10.1111/j.1365-2672.2009.04590.x
7. Похиленко, В. Д. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность [Текст] / В. Д. Похиленко, В. В. Перелыгин // Газета «Новости медицины и фармации». - 2008. - Т. 18, № 259.
8. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1 [Text] / N. R. Krieg (Ed). - The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1984. - 964 p.
References
1. Pirog, T. P (2010). Zagalna microbiologiya [General Microbiology]. NUHT, 632.
2. Bucenko, L. M., Penchuk, Ju. M., Pirog, T. P (2010). Tekhnologii mikrobnogo sintezy likarskih zasobiv [Technology of drugs microbial synthesis]. Kyiv, Ukraine: NUHT, 323.
3. Starovoytova, S. O., Skrocka, O. I., Penchuk, Ju. M., Pirog, T. P (2012). Tekhnologiya pobiotikiv [Probiotics technology]. Kyiv, Ukraine: NUHT, 318.
4. Cutting, S. (2011). Bacillus probiotics. Food Microbiology, 28 (2), 214-220. doi: 10.1016/j.fm.2010.03.007
5. Sanders, M., Morelli, L., Tompkins, T. (2003).
Sporoformers as human probiotics: Bacillus,
Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Comprehensive reviews in food science and food safety. 2 (3), 101-110.
doi 10.1111/j.1541-4337.2003.tb00017.x
6. Khaneja, R., Perez-Fons, L., Fakhry, S., Baccigalupi, L., Steiger, S., To, E., Sandmann, G, Dong, T., Ricca, E., Fraser, P., Cutting, S. (2009). Carotenoids found in Bacillus. Journal of Applied Microbiology. 108 (6), 1889-1902.
doi: 10.1111/j.1365-2672.2009.04590.x
7. Pohilenko, V. D., Pereligin, V. V. (2008). Probiotiki na osnove sporoobrazuyushih bakteriy i ih bezopasnost [Probiotics based on spore-forming bacteria and their safety]. Newspaper “news of Medicine and Pharmacy”, 18 (259).
8. Krieg, N. R. (Ed.) (1984). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 1. Baltimore: The Williams & Wilkins Co., 964.
Рекомендовано до публікації д-р мед. наук Авдєєва Л. В.
Дата надходження рукопису 25.11.2014
Мілян Владислав Олександрович, кафедра біотехнології і мікробіології, Національний університет харчових технологій, вул. Володимирська, 68, м. Київ, Україна, 01601 E-mail: uunium@gmail.com
Хархота Максим Андрійович, кандидат біологічних наук, Відділ антибіотиків, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ вул. Академіка Заболотного, 154, м. Київ, Україна, 03143 E-mail: uunium@gmail.com
Нечипуренко Олексій Олександрович, аспірант, Відділ антибіотиків, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ вул. Академіка Заболотного, 154, м. Київ, Україна, 03143 E-mail: uunium@gmail.com
22
