CC BY
12
Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
Ukr Neurosurg J. 2020;26(4):20-25 doi: 10.25305/unj.205793
Досл1дження функцюнальноУ активност1 !мунокомпетентних кл1тин мозку в р1зн1 термши п1сля експериментальноУ черепно-мозковоУ травми
Лсяний М.1., Бельська Л.М.
Вiддiл нейроiмунологiï, 1нститут нейрохiрургiï iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра'ши, КиТв, Укра'ша
Над1йшла до редакцп 15.07.2020 Прийнята до публ1кацП 01.10.2020
Адреса для листування:
Бельська Людмила МиколаУвна, Вддл нейро'/мунолоп), 1нститут нейрох1рурп1 ¡м. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, 04050, УкраУна, e-mail: adsg@ukr.net
Мета: дослщити функцюнальну актившсть мкроглм та моноцитарно-макрофагальних кл^ин у рiзнi термiни тсля експериментальноТ черепно-мозковоТ травми (ЧМТ) у щурiв.
Матерiали i методи. Експериментальну ЧМТ моделювали у щурiв шляхом падiння вантажу вагою 100 г з висоти 120 см. Мкрогл№ та моноцити, котрi шфшьтрують центральну нервову систему, видiляли з тканини мозку щурiв у ступеневому градieнтi перколу. Визначення активностi кл^ин мозку, якi фагоцитують, проводили в НСТ-тесп спектрофотометричним методом. Активнiсть мieлопероксидази визначали в лiзатi клiтин кшьюсним спектрофотометричним методом.
Результати. Пiсля ЧМТ у головному мозку виявлено тдвищення ктькосп мiкроглiально-моноцитарних клiтин та збтьшення спонтанноТ продукцií цими клiтинами токсичних молекул кисню, яке залежало вщ термiну травми i локалiзацií травматичного ушкодження. Найбiльше (триразове) збiльшення ктькосп мiкроглiальних та моноцитарно-макрофагальних ^тин вiдзначено на 5-ту добу тсля ЧМТ у пiвкулi з травматичним ураженням. Максимальне пiдвищення спонтанно! продукци супероксидного радикала спостерiгали також на 5-ту добу тсля ЧМТ. Мieлопероксидазна актившсть зазначеноТ популяцií клiтин тдвищувалася вже через 24 год тсля ЧМТ та поступово зменшувалася до контрольних показниюв на 10-ту добу тсля травми, що свiдчить про етапшсть процесу. Висновки. На 5-ту добу тсля ЧМТ у вогнищi запалення переважали мкро^альш та моноцитарно-макрофагальш клiтини М1-прозапального фенотипу. Вплив на кл^инш та молекулярнi механiзми, як регулюють функцiональнi реакцiТ мiкроглiТ/макрофагiв тсля ЧМТ, можливо, сприятиме розробцi терапевтичних втручань, спрямованих на перехщ зазначених кл^ин з М1-фенотипу в М2-фенотип, що необхiдно для полiпшення вщновлення центральноТ нервовоТ системи.
Ключовi слова: черепно-мозкова травма; м/крогл/я; макрофаги мозку; фагоцитоз; експериментальн/ дослдження
Research of the functional activity of immunocompetent brain cells on separate occasions after experimental traumatic brain injury
Mykola I. Lisianyi, Lyudmyla M. Belska
Neuroimmunology Department, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
Received: 15 July 2020 Accepted: 01 October 2020
Address for correspondence:
Lyudmyla M. Belska, Neuroimmunology Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Mayborody st., Kyiv, 04050, Ukraine, e-mail: adsg@ukr. net
Objective: To investigate the functional activity of microglia and monocytic/ macrophage cells on separate occasions after the rat model of experimental brain injury.
Materials and methods. The rat model of experimental brain injury was simulated by dropping a load weighing 100 g from a height of 120 cm. Microglia and infiltrating CNS monocytes were isolated from rat brain tissue in a stepwise Percoll cushion. The activity of phagocytic brain cells was determined in the HCT test by the spectrophotometry method. Myeloperoxidase activity was determined in cell lysate by a quantitative spectrophotometric method. Results. It was found that after brain injury there is an increase in the number of microglial / monocyte cells and an increase in spontaneous production of toxic oxygen molecules by these cells, which depends on the duration of injury and the location of the injury. The greatest threefold increase in microglial and monocytic/macrophage cells is determined on the 5th day after brain injury in the hemisphere with a traumatic injury. The maximum increase in spontaneous production of superoxide anion radical by these cells is also determined on the 5th day after brain injury. In contrast, myeloperoxidase activity of this cell population increases as early as 24 h after brain injury and
Copyright © 2020 Mykola I. Lisianyi, Lyudmyla M. Belska
[icci (D 1 wor'<'s licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License ^^gnJ https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
gradually decreases to control values on the 10th day after the injury, which indicates the gradual development of the process.
Conclusion. The result of the researches demonstrated that on the 5th day after brain injury microglial and monocytic/macrophage M1 cells of proinflammatory phenotype prevail in the inflammation site. Influences on the cellular and molecular mechanisms that regulate the functional responses of microglia/macrophages after brain injury may facilitate the development of future therapeutic interventions aimed at the phenotypic transition of these cells from Ml to M2, which is necessary to improve CNS recovery. Keywords; brain injury; microglia; brain macrophages; phagocytosis; experimental studies
Исследование функциональной активности иммунокомпетентных клеток мозга в разные сроки после экспериментальной черепно-мозговой травмы
Лисяный Н.И., Бельская Л.Н.
Отдел нейроиммунологии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 15.07.2020 Принята к публикации 01.10.2020
Адрес для переписки:
Бельская Людмила Николаевна, Отдел нейроиммунологии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, 04050, Украина, e-mail: adsg@ukr.net
Цель: исследовать функциональную активность микроглии и моноцитарно-макрофагальных клеток в разные сроки после экспериментальной черепно-мозговой травмы (ЧМТ) у крыс.
Материалы и методы. Экспериментальную ЧМТ моделировали у крыс путем падения груза весом 100 г с высоты 120 см. Микроглию и инфильтрирующие центральную нервную систему моноциты выделяли из ткани мозга крыс в ступенчатом градиенте перколла. Определение активности фагоцитирующих клеток мозга проводили в НСТ-тесте спектрофотометрическим методом. Активность миелопероксидазы определяли в лизате клеток количественным спектрофотометрическим методом.
Результаты. После ЧМТ в головном мозге выявлено повышение количества микроглиально-моноцитарных клеток и увеличение спонтанной продукции данными клетками токсичных молекул кислорода, которое зависело от срока травмы и локализации травматического повреждения. Наибольшее (трехкратное) увеличение количества микроглиальных и моноцитарно-макрофагальных клеток отмечено на 5-е сутки после ЧМТ в полушарии с травматическим поражением. Максимальное повышение спонтанной продукции супероксидного радикала наблюдали также на 5-е сутки после ЧМТ. Миелопероксидазная активность упомянутой популяции клеток повышалась уже через 24 ч после ЧМТ и постепенно приближалась к контрольным показателям на 10-е сутки после травмы, что свидетельствует об этапности процесса.
Выводы. На 5-е сутки после ЧМТ в очаге воспаления преобладали микроглиальные и моноцитарно-макрофагальные клетки М1-провоспалительного фенотипа. Влияние на клеточные и молекулярные механизмы, регулирующие функциональные реакции микроглии/ макрофагов после ЧМТ, возможно, будет способствовать разработке терапевтических вмешательств, направленных на переход данных клеток из М1-фенотипа в М2-фенотип, что необходимо для улучшения восстановления центральной нервной системы.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма; микроглия; макрофаги мозга; фагоцитоз; экспериментальные исследования
Вступ
Нейрозапалення е характерною рисою багатьох нейродегенеративних захворювань i дедалi часпше розглядаеться як важливий патофiзiологiчний механизм, який лежить в основi хрошчноТ нейроде-генераци тсля черепно-мозковоТ травми (ЧМТ). Як первинний медiатор вродженоТ iмунноТ вщпов^ в центральнш нервовш системi (ЦНС), мкро^я вщЬ грае критичну роль у нейрозапаленш та вторинному пошкодженш тсля ЧМТ [1].
Мкро^я - основний ^тинний компонент вродженоТ iмунноТ системи мозку. На ТТ частку припадае близько 10% вщ загальноТ кшькосп кл^ин у ЦНС дорослих оаб. У тдтриманш мкроглм в нормальному фiзiологiчному стаж важливу роль в^грае iмуносу-
пресивний потеншал ЦНС. У здоровому мозку нейрони експресують низку iмуносупресивних бшюв, як д^ть як "вимкнеш" сигнали, котрi разом зi специфiчними рецепторами м^роглм тдтримують ТТ в неактивному стаж. того, розчинш фактори, таю як нейротро-фши, протизапальш цитокши i простагландини, локально вивтьняються нейронами, астроцитами та м^ро^ею i пригшчують iмунну вщповщь, тдтри-муючи мкрогл№ в неактивному стаж [2].
ГНсля ЧМТ протягом короткого часу спостерЬ гаеться сильна нейрозапальна вщповщь, яка опосе -редкуеться складними молекулярними i кл^инними мехашзмами. Залежно вщ штенсивност ушкодження ЧМТ спричиняе миттеву загибель ^тин у мюц удару. Гошкоджеш кл^ини вивтьняють DAMP, як пере-
дають сигнали шшим локальним та iмунним клiтинам, якi шфтьтрують. Астроцити, мiкроглiя та пошкод-жеш нейрони в мiсцi травми секретують цитоюни i хемокiни. Цi потужш iмуннi медiатори спричиняють подальшу активашю мiкроглií i астроцитiв в м^ц пошкодження та залучають периферичнi iмуннi клiтини, якi проходять крiзь пошкоджений гемато-енцефалiчний бар'ер протягом гострого посттравматичного перюду. Гематогеннi моноцити залуча-ються у пошкоджений мозок у вщповщь на локальнi сигнали хемоюшв (CCL2, CXCL10, CCL5 тощо), де вiдбуваeться íх диференцiювання в макрофаги [3]. Показано переважання в м^ц ураження через 3 дш тсля травми запальних моноци^в з експреаею хемокiнового рецептора ССЯ2 ^11Ь + CD45hiCCR2 + Ly6Chi) [4]. Дендритш клiтини, Т-лiмфоцити i природы юлери (ИК) також проникають у мозок з ЧМТ протягом цього перюду, але в набагато меншш юлькост^ нiж моноцити, якi шфтьтрують. ^м того, протягом цього перюду активуються резиденты ^альш клiтини мозку. Астроцити в м^ц травми активуються i продукують цитокiни та хемокши, якi сприяють додатковому залученню i активацií резидентноí мiкроглií та периферичних iмунних клiтин. Мiкроглiя трансформуеться з розгалужено!' в амебоíдну форму i морфологiчно не вiдрiзняеться вiд залучених гематогенних макрофапв. Вони секре -тують прозапальш цитокiни та втьш радикали, якi е цитотоксичними для нейрошв i можуть призвести до нейродегенераци пiсля ЧМТ [5].
Ниш активно вивчають роль i внесок у розвиток ЧМТ М1- i M2-подiбноí поляризованоí мiкроглií та макрофапв, яю iнфiльтрують. Описано, що м^ро^я i макрофаги реагують на прозапальш молекули, таю як бактерiальний лтопол^ахарид, Th1-цитокiн, iнтерферон-Y (IФН-Y), щоб набути "класичнного" M1-подiбного фенотипу, який продукуе висок рiвнi прозапальних цитокiнiв (штерлейюн (I L)-1p, IL-12, фактор некрозу пухлини-а (ФНП-а), хемокiни (CCL2, СХ^9, CXCL10) i aктивнi форми кисню [6]. До M1-подiбних мaркерiв фенотипу належать CD16, CD32, CD86, молекули пстосум^ництва класу 2 (МНС II) та шдукована ИО-синтетаза (iNOS). M1-подiбнa aктивaцiя пов'язана з фагоцитозом, здатшстю знищу -вати пaтогеннi мкрооргашзми за рахунок обмеження зaлiзa, тдкислення фагосом i вивiльнення активних форм кисню [7]. У багатьох випадках M1-подiбнa вщповщь е захисною i пригнiчуеться пiсля усунення пошкодження або патогену, але нерегульована або нaдмiрнa M1-подiбнa aктивaцiя в головному мозку може спричинити нейротоксичшсть через вивть-нення прозапальних чинникiв i нейротоксичних медiaторiв, якi запускають цикли опосередковaноí мiкроглiею нейродегенерaцií. Мiкроглiя i макрофаги також вщпов^ають на ТЬ|2-цитокши, тaкi як IL-4 i ^-13, щоб iндукувaти "альтернативний" M2a-подiбний стан, пов'язаний iз залученням Th2-клiтин, в^новленням тканин i стимуляцiею росту [8]. М^ро^я/макрофаги можуть набувати промiжного M2b-подiбного фенотипу у вiдповiдь на вплив iмунного комплексу i лiгaнду Toll-рецепторiв [8]. M2b-подiбний фенотип володiе прозапальною або протизапальною дiею i пов'язаний з iмунними реaкцiями пaм'ятi (перемикання класу В-кл^ин i
залучення Т-регуляторних кл^ин). Фенотип М2Ь мае характеристики як кл^ин М1 (МНС II, CD86), так i клiтин М2 (IL-10high, IL-12low). Коли макрофаги М2Ь стимулюють Т-клiтини, вони змiщуються в б^ Th2-вiдповiдi [8] , що припускае 1х можливiсть бути потенцшним регулятором М2-вiдповiдi в цiлому.
Експериментальш дослiдження на моделях iшемiчноí травми головного мозку показали, що бть-шнсть клiтин мiкроглií i залучених макрофапв у м^ц пошкодження мають змшаш М1- i M2-подiбнi профЫ aктивaцií, M2-подiбнa вiдповiдь е короткочасною та е фенотитчний зсув у б^ M1-вiдповiдi протягом 1 тиж тсля травми [9].
Отже, тсля нейротравми м^ротальш клiтини е першими ^тинами, якi реагують на пошкодження i можуть чинити як захисну, так i пошкоджувальну дiю на нейрони залежно вщ фенотипу. В зв'язку з цим актуальним е вивчення функцiонaльноí активной мiкроглiaльних кл^ин на рiзних етапах розвитку ЧМТ, осюльки можливiсть перемикання мiкроглií з М1-фенотипу на М2 розглядають як нову стратепю в лiкувaннi зaзнaченоí пaтологií мозку.
Мета: дослiдити функцюнальну aктивнiсть мкро-глií та моноцитарно-макрофагальних ^тин у рiзнi термши пiсля експериментaльноí черепно-мозковоí травми у щурiв.
Матерiали i методи
Проведено одноцентрове проспективне когортне дослщження. В робот використано експеримен-тaльнi тварини (29 аутбредних статевозртих щурiв-самок розведення вiвaрiю 1нституту нейрохiрургií iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши). До групи дослiдження залучено 20 тварин, до групи контролю (штактш тварини) - 9.
Ус роботи з експериментальними тваринами проводили з дотриманням законодавчих норм та вимог Закону Украши №3447 IV "Про захист тварин вщ жорстокого поводження", £вропейськоí конвенци про захист хребетних тварин, яю використовуються для дослщних та шших наукових цiлей (Страсбург, 1986), принцитв бiоетики та норм бiологiчноí безпеки.
Тварин утримували у стандартних умовах акре-дитованого вiвaрiю. Знеболювання та евтaнaзiю проводили тд наркозом.
Проведення дослiдження затверджене комiсiею з етики та бiоетики 1нституту нейрохiрургií iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши (протокол №26 вщ 11 травня 2018 р.).
Дизайн досл'щження
Моделювання черепно-мозково! травми в експе-риментальних щур':в
Черепно-мозкову травму моделювали шляхом падшня вантажу (вагою 100 г) з висоти 120 см на голову щурiв, яю перебували в стаж наркотичного сну (внутршньочеревно 0,5 мл 5,0% розчину тюпенталу), котрий тривав 30 хв. Голову тварин розташовували тд пластиковою вертикальною трубою дiaметром 2,5 см заввишки 120 см таким чином, щоб удар (контакт) вантажу, який падав, припадав на лiву твкулю в дтянц тiм'яноí та потиличноí часток головного мозку.
П^ля отримання травми у тварин рефлекторно вщбувалася затримка дихання на деюлька секунд, яке
noTiM вщновлювалося до звичайного ритму. Судом та шших порушень або видтення ce4i та калу не було. Через 20-30 хв тварини виходили i3 наркозу i починали ворушитися та пересуватися по кл^цк У трьох тварин тсля ЧМТ спостер^али швидку смерть через зупинку дихання або судомну реак^ю, яка виникала протягом 3-10 хв тсля травми. При дослщженш причин смерт цих тварин виявлено пошкодження венозних cинуciв та крововилив у головний мозок у дтянц лобово-скроневоТ частки. Крiм того, зафнк-сували загибель 5 тварин протягом 48-72 год тсля ЧМТ, як тсля виходу iз наркозу були дуже квoлi та малорухлив^ що cвiдчилo про наявнicть дуже тяжко!' травми. При дocлiдженнi головного мозку померлих тварин мкроскотчно виявлено набряк, пперем^ та невеликi зони забою лiвoï пiвкулi рoзмiрoм близько 3-5 мм. У щурiв, кoтрi вижили, змодельовано ЧМТ у виглядi забою мозку легкого та середнього ступеня тяжкосп.
Видлення кл/тин м/кроглп та ¡мунокомпетентних кл/тин, як/ ¡нфльтрують ЦНС
М^рогл^ та моноцити, яю шфшьтрують ЦНС, видтяли з тканини мозку щурiв у cтупiнчаcтoму градieнтi перколу за методом J. Sedgwick та ствавт. [10]. Застосування цього методу дало змогу видтити фракшю клiтин, якi мicтять резидентнi макрофаги мозку, гематогенш моноцити/макрофаги i фракцю збагачену OX1low-мiкрoглiальними клiтинами. За даними автoрiв методу, в запальнiй ЦНС на градieнтi щiльнocтi видiлялиcя не лише ох1|<ж-кл^ини, а i ОХ1ЫзМ-кл^ини iнфiльтрату ЦНС лiмфoïднo-макрoфа-гального ряду. Частка м^роглм (OX1low) у дорослих штактних тварин при цьому метoдi видiлення стано-вить 82,9 % вщ загального числа видiлених ^тин, як виявили автори методики за даними цитофлуоро-метричного аналiзу з використанням моноклональних антитт щурiв.
Пюля отримання клiтини вiдмивали вiд залишюв перколу в CMF-буферi, ресуспендували в cередoвищi 1гла, пiдрахoвували в розчиш трипанового синього та 3% оцтовоТ кислоти i використовували в подальших дocлiдженнях.
Визначення активност ¡мунокомпетентних кл/тин мозку в НСТ-тест
Визначення активной ^тин мозку, якi фагоци -тують, проводили в НСТ-теcтi (спонтанному та стиму -льованому) [11]. Результати вираховували спектрофо-тометрично на cпектрoфoтoметрi Immunohem (США) за довжини хвилi 570 нм. Спонтанну фагоцитарну актившсть виражали в умовних одиницях.
Визначення активностi внутр/шньокл/тинно'/ м/елопероксидази iмунокомпетентних кл/тин
Актившсть мieлoперoкcидази (МПО) визначали в лiзатi кл^ин кшьюсним спектрофотометричним методом з використанням сумш 0,04% ортофент-дiамiну та 0,014% H 2О2 у фосфатно-цитратному буферу оптичну густину - за довжини хвилi 492 нм на спек-трoфoтoметрi Immunohem (США). Активнicть МПО виражали в умовних одиницях [12].
Статистичний анал '13
Статистичну обробку даних проводили з використанням комп'ютерноТ програми Statistica-8 з визначенням середньоТ арифметичноТ, квадратичного вщхилення (а) та рiвня статистично!' значущocтi
(р) та програми Microsoft Excel 2007 з визначенням середньоТ арифметичноТ, стандартного статистичного вщхилення i t-критерiю Стьюдента. Статистично значущими вважали вiдмiннocтi при p<0,05.
Результати та обговорення
Юльюсть клiтин, якi видiляли з тканини ЦНС на градieнтi, який ми використовували, змшювалася залежно вiд термшу дocлiдження пicля ЧМТ. Вмicт у ЦНС цieï фракци клiтин через 24 год тсля нанесення травми збшьшувався в 1,4 разу в правш пiвкулi (без травматичного пошкодження) i в 2,2 разу - в лiвiй пiвкулi (з травматичним ураженням) пoрiвнянo з показниками контрольних тварин (Табл. 1).
Найбтьшу шфтьтра^ю тканини мозку в обох твкулях клiтинами, якi видтялися на ступеневому градieнтi, вiдзначенo на 5-ту добу тсля травми. Бтьш виражене статистично значуще (р<0,05) збтьшення ктькосп цих клiтин cпocтерiгали в пiвкулi з травматичним ушкодженням, що, можливо, cвiдчить про прoлiферацiю резидентних макрoфагiв та iнтенcивну шфшьтрашю тканини ЦНС у цей перюд гематогенними клiтинами моноцитарно-макрофагального i лiмфoïд-ного ряду. На 10-ту добу тсля травми виявлено посту-пове зниження ктькосп видiлених мiкрoглiальних та моноцитарно-макрофагальних кл^ин як у правш, так i в лiвiй твкул^ але показники не досягали контрольних значень (див. Табл. 1), що може свщчити про зменшення запальноТ реакцп.
Ми також вивчали функцюнальну актившсть зазначених ^тин у НСТ-тестк Цей тест фунтуеться на здатност клiтин, якi фагоцитують, поглинати штросинш тетразoлiй i вiднoвлювати його продуктами окисно-вщновних реакцiй "метабoлiчнoгo вибуху", кoтрi супроводжують процес фагоцитозу. Результати спонтанного тесту характеризують iнтенcивнicть вироблення активних метаболтв кисню пiд час фагоцитозу. Результати стимульованого тесту дають уявлення про функцioнальнo-метабoлiчнi резерви клiтини i здатшсть до активацiï in vitro [11].
В штактному мозку доросло!' тварини продуцентами активних форм кисню е резидентш макрофаги ЦНС - мкротя, периваскулярш макрофаги, для яких, так само, як i для тканинних макрофапв, за нашими даними, у фiзioлoгiчних умовах характерна низька спонтанна i висока стимульована продукшя супероксидного радикала (Табл. 2) [13].
Таблиця 1. Юльюсть iмунoкoмпетентних кл^ин мозку в рiзнi термши тсля черепно-мозковоУ травми
Термш п1сля травми Юльюсть кл1тин, 106 на 0,5 г мозку
Права п1вкуля Л1ва п1вкуля
24 год (n=6) 2,41 ± 0,51 3,7 ± 0,26*
5-та доба (n=9) 2,85 ± 1,09 4,95 ± 1,38*
10-та доба (n=5) 2,2 ± 0,63 2,8 ± 0,91
Контроль (n=9) 1,68 ± 0,62 1,74± 0,67
Прим/тка: * - статистично значуща (р<0,05) рiзниця з показниками iнтактних тварин.
Таблиця 2. Функцюнальна актившсть iмунних ^тин мозку в pi3Hi термiни пiсля черепно-мозково' травми
Термш шсля травми НСТ тест (спонтанна актившсть), у. о. НСТ-тест (стимульована актившсть), % зимозан Активнiсть мieлопероксидази
Права швкуля мозку Лiва пiвкуля мозку Права швкуля мозку Лiва пiвкуля мозку Права швкуля мозку Лiва пiвкуля мозку
24 год (n = 6) 53,33±9,38 66,65±5,44* 115,64±13,56 104,63±12,09 13,35±1,20 15,5±1,69
5-та доба (n=9) 59,53±8,27 81,32±10,95* 112,07±16,98 102,65±15,07 8,75±0,80 9,44±1,48
10-та доба (n=5) 51,49±6,83 60,41±5,72 110,62±10,34 101,56±9,34 7,95±1,44 8,12±1,32
Контроль (n=9) 45,81±7,43 48,25±7,54 129,71±7,03 124,95±5,58 7,6±2,33 6,84±1,41
Примтка: * - статистично значуща (р<0,05) рiзниця з показниками штактних тварин.
Як показало наше дослщження, в 1-шу добу пiсля ЧМТ мало м^це деяке пiдвищення спонтанно!' продукци супероксидного радикала клiтинами мозку, яю фагоцитують (у середньому (59,98 ± 7,91) у. о. для тварин з ЧМТ та (47,03 ± 7,48) у. о. для штактних тварин). У кл^ин, яю видтялися з травмовано' пiвкулi, визначено тдвищення продукцiï супероксидного радикала в 1,4 разу порiвняно з контролем. Це супроводжувалося деяким зниженням функцюналь-но-метаболiчних резервiв макрофагiв, про що свщ-чило зменшення продукци супероксидного радикала порiвняно з контролем (див. Табл. 2) у вщповщь на додатковий стимул (зимозан) in vitro.
На 5-ту добу тсля ЧМТ вщзначено статистично значуще (р<0,05) пiдвищення спонтанноï продукцiï супероксидного радикала кл^инами, якi фагоцитують, котрi видiлялися з пiвкулi мозку з травматичним пошкодженням, що, на нашу думку, спричинено м^ра -шею мкротальних та макрофагальних клiтин у зону ураження та активащею |'х in vivo внаслiдок пору-шення гомеостазу. Можливим пiдтвердженням такого припущення е вiдсутнiсть статистично значущо' рiзницi мiж контрольними показниками спонтанно'' продукци супероксидного радикала ^тинами мозку, яю фагоцитують, та вiдповiдними показниками ^тин, котрi видiляли з пiвкулi без травматичного враження в експериментальних щурiв у цей термш.
Поступове зменшення спонтанно' продукци реак-тивних молекул кисню м^ро^альними та моноци-тарно-макрофагальними ^тинами, котрi видiлялися з травмовано' пiвкулi мозку, спостерiгали на 10-ту добу пiсля ЧМТ.
Також ми вивчали актившсть МПО, яка вщображуе функцюнальну активнiсть клiтин, якi фагоцитують. Установлено, що актившсть МПО у цих кл^ин вдвiчi зростала через 24 год тсля травми (див. Табл. 2). Таю змши виявлено у кл^ин, яю видiляли як iз право' пiвкулi, так i з лiвоï пiвкулi. На 5-ту добу тсля ЧМТ вщзначено поступове зниження актив-ностi МПО кл^инами мозку, якi фагоцитують, але показники перевищували контрольнi значення. На 10-ту добу тсля травми актившсть МПО ^тин, яю видiляли з неушкоджено' пiвкулi, не вiдрiзнялася вiд контрольних показниюв, а у клiтин, видтених з травмованоï пiвкулi, - в 1,2 разу перевищувала контрольнi показники.
Таким чином, установлено, що в 1-шу добу тсля ЧМТ в обох твкулях головного мозку збтьшуеться юльюсть кл^ин мiкроглiï та моноцитарно-макро-
фагального ряду. Подальше пiдвищення вм^ту цих клiтин визначаеться на 5-ту добу тсля ЧМТ, зокрема в 2,5-3,0 рази - в пiвкулi з травматичним ушкод-женням. На 10-ту добу юльюсть зазначених кл^ин не досягае контрольних значень, що, можливо, свщчить про наявшсть залишкового запального процесу в цей термш.
Через 24 год тсля травматичного ушкодження мозку вщбуваеться початкова активащя м^ро-тальних ^тин, що супроводжуеться тдвищенням продукцiï супероксидного радикала. На 5-ту добу тсля ЧМТ у запальному вогнищi спостер^аеться значне тдвищення вмiсту м^ро^ально-макрофа-гальних клiтин, переважання М1-прозапального фенотипу цих клiтин i висока продукшя токсичних молекул кисню. Кл^ини М1-фенотипу, для яких характерна висока секретя не лише активних молекул кисню, а i прозапальних та нейротоксичних медiаторiв, можуть посилювати пошкодження i робити внесок у розвиток патолопчного процесу. ^м того, M1-подiбнi макрофаги порушують регенерашю аксошв за допомогою активацiï регуляцiï протеогл^ашв сульфату хрондроïтину, якi е потужним шпб^ором вiдростання аксонiв [4,6].
Пщвищення спонтанноï продукцiï токсичного супероксидного радикала i поляризащя клiтин моноцитарно-макрофагального ряду в М1-фенотип, можливо, зумовлена кл^инами лiмфоïдного ряду, якi шфтьтрують тканину мозку та можуть спричи-нити активашю мiкроглiïï та макрофапв за рахунок продукци прозапальних цитоюшв, таких як, 1ФН^ та ФНП-а. C. Соlton i спiвaвт. [13] продемонстру-вали збiльшення форболмiристaтaцетaт шдуковано' продукцiï супероксидного радикала мiкроглiaльними кл^инами дорослих iнтaктних тварин пiд впливом 1ФН^. M. Woodroofe i ствавт. [14] також показали можливiсть збтьшення продукцiï токсичних молекул кисню м^ротальними клiтинaми дорослих iнтaктних щурiв тсля впливу 1ФН^. Нaведенi дaнi, на нашу думку, можуть свщчити про поляризащю клiтин макрофагального ряду за М1-фенотипом, що спри-чиняе розвиток запального процесу i може розгляда-тися як етюпатогенетичний чинник при ЧМТ. Глибше розумшня молекулярних мехaнiзмiв, яю регулюють функцiонaльнi реaкцiï мiкроглiï/мaкрофaгiв тсля ЧМТ, можливо, сприятиме розробцi терапевтичних втручань, спрямованих на фенотитчне перемикання зазначених ^тин для полiпшення функцюнального вiдновлення пiсля ЧМТ.
Висновки
1. Пюля ЧМТ у головному мозку спостер^аеться пiдвищення кшькосп мiкрoглiальнo-мoнoцитарних клiтин, яке залежить вщ термiну травми та лoкалiзацiï травматичного ушкодження. Найбтьше (триразове) збiльшення кшькосп мiкрoглiальних клiтин та клiтин шфшьтрату виявлено на 5-ту добу тсля ЧМТ у пiвкулi з травматичним ураженням.
2. У щурiв тсля експериментального травматичного ушкодження мозку тдвищуеться спонтанна прoдукцiя токсичних молекул кисню м^ро^аль-но-макрофагальними клiтинами, яка змшюеться залежно вiд термiну тсля ЧМТ. Найбтьше тдвищення спонтанно!' продукци супероксидного радикала мкро-глiальнo-мoнoцитарними кл^инами вiдзначене на 5-ту добу тсля ЧМТ, що свщчить про переважання в цей термш у вoгнищi запалення клiтин М1-фенотипу.
3. Мieлoперoкcидазна активнicть мiкрoглiï та клiтин моноцитарно-макрофагального ряду тдви-щувалася вже через 24 год тсля ЧМТ i поступово знижувалася до контрольних показниюв на 10-ту добу пicля травми.
Розкриття шформацп
Конфл/кт ттерейв
Автори заявляють про вiдcутнicть кoнфлiкту штереав.
Етичнi норми
Дocлiдження проведено вщповщно до принципiв бioетики, регламентованих бвропейською конвен-цieю про захист хребетних тварин, яких використо-вують для дослщних та iнших наукових цшей (1986), Директивою 2010/63/6С "Про захист тварин, що використовуються в наукових цтях" (2010), Законом УкраТни №3447-IV "Про захист тварин вщ жорстокого поводження" (2006). Проведення дослщження затвер -джене кoмicieю з питань етики та бюетики 1нституту нейрoхiрургiï iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни (протокол №26 вщ 11 травня 2018 р.).
Ф/нансування
Дослщження не мало спонсорськоТ тдтримки.
References
1. Karve IP, Taylor JM, Crack PJ. The contribution of astrocytes and microglia to traumatic brain injury. Br J Pharmacol. 2016 Feb;173(4):692-702. doi: 10.1111/bph.13125. PMID: 25752446; PMCID: PMC4742296.
2. Loane DJ, Kumar A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Exp Neurol. 2016 Jan;275 Pt 3(0 3):316-327. doi: 10.1016/j.expneurol.2015.08.018. PMID: 26342753; PMCID: PMC4689601.
3. Jassam YN, Izzy S, Whalen M, McGavern DB, El Khoury J. Neuroimmunology of Traumatic Brain Injury: Time for a Paradigm Shift. Neuron. 2017 Sep 13;95(6):1246-1265. doi: 10.1016/j.neuron.2017.07.010. PMID: 28910616; PMCID: PMC5678753.
4. Hsieh CL, Kim CC, Ryba BE, Niemi EC, Bando JK, Locksley RM, Liu J, Nakamura MC, Seaman WE. Traumatic brain injury induces macrophage subsets in the brain. Eur J Immunol. 2013 Aug;43(8):2010-22. doi: 10.1002/eji.201243084. PMID: 23630120; PMCID: PMC4210355.
5. Jin Y, Wang R, Yang S, Zhang X, Dai J. Role of Microglia Autophagy in Microglia Activation After Traumatic Brain Injury. World Neurosurg. 2017 Apr;100:351-360. doi: 10.1016/j.wneu.2017.01.033. PMID: 28108422.
6. Xu H, Wang Z, Li J, Wu H, Peng Y, Fan L, Chen J, Gu C, Yan F, Wang L, Chen G. The Polarization States of Microglia in TBI: A New Paradigm for Pharmacological Intervention. Neural Plast. 2017;2017:5405104. doi: 10.1155/2017/5405104. PMID: 28255460; PMCID: PMC5309408.
7. Gao HM, Liu B, Hong JS. Critical role for microglial NADPH oxidase in rotenone-induced degeneration of dopaminergic neurons. J Neurosci. 2003 Jul 16;23(15):6181-7. doi: 10.1523/ JNEUR0SCI.23-15-06181.2003. PMID: 12867501; PMCID: PMC6740554.
8. Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo Veritas. J Clin Invest. 2012 Mar;122(3):787-95. doi: 10.1172/JCI59643. PMID: 22378047; PMCID: PMC3287223.
9. Jin Y, Wang R, Yang S, Zhang X, Dai J. Role of Microglia Autophagy in Microglia Activation After Traumatic Brain Injury. World Neurosurg. 2017 Apr;100:351-360. doi: 10.1016/j.wneu.2017.01.033. PMID: 28108422.
10. Sedgwick JD, Schwender S, Imrich H, Dörries R, Butcher GW, ter Meulen V. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Aug 15;88(16):7438-42. doi: 10.1073/pnas.88.16.7438. PMID: 1651506; PMCID: PMC52311.
11. Lisyanyy MI, Belska LM, Semenova VM, Rozumenko VD, Stajno LP. [Study of effect of rat embryonic neural tissue peptides on intracerebral tumor cells and functional activity of peripheral blood mononuclears]. Problems of Cryobiology and Cryomedicine. 2008 Dec 22;18(4):441-444. Ukrainian. http://cryo.org.ua/journal/index.php/probl-cryobiol-cryomed/article/view/347
12. Rudenko VA, Gnedkova IO, Pichkur LD, Verbovska SA, Pokholenko YaO. [Influence of xenogenic transplantation of mesenchymal stem cells and Il- 10 on cellular immunity in rats with experimental allergic encephalomyelitis]. Coliection of Scientific Works of Staff Member of P. L. Shupyk NMAPE. 2014;(23(2)):434-41. Ukrainian. http://nbuv.gov.ua/UJRN/ Znpsnmapo_2014_23%282%29__59
13. Colton CA, Gilbert DL. Production of superoxide anions by a CNS macrophage, the microglia. FEBS Lett. 1987 Nov 2;223(2):284-8. doi: 10.1016/0014-5793(87)80305-8. PMID: 2822487.
14. Woodroofe MN, Hayes GM, Cuzner ML. Fc receptor density, MHC antigen expression and superoxide production are increased in interferon-gamma-treated microglia isolated from adult rat brain. Immunology. 1989 Nov;68(3):421-6. PMID: 2556346; PMCID: PMC1385458.
