ДООПЕРАЦИОННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МЕТАСТАЗОВ ПАПИЛЛЯРНОГО И МЕДУЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ШЕЙНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛАССИФИКАТОРА Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Оригинальное исследование

Дооперационное выявление метастазов папиллярного и медуллярного рака щитовидной железы в шейных лимфатических узлах с помощью молекулярного классификатора

С.Е. Титов1-3, Г.А. Катанян4, Т.Л. Полоз5, Л.Г. Измайлова4, О.А. Зенцова4, Л.Г. Дряева4, В.В. Анищенко6, 7

ФГБУН«Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук»; Россия, 630090 Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8/2; 2АО «Вектор-Бест»; Россия, 630117Новосибирск, ул. Арбузова, 1/1; 3ФГАОУВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»; Россия, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1; 4ГБУЗ «Краевая клиническая больница №2» министерства здравоохранения Краснодарского края; Россия, 350012 Краснодар, ул. Красных партизан, 6; 5ЧУЗ «Клиническая больница "РЖД-Медицина"г. Новосибирск»; Россия, 630003Новосибирск, ул. Владимировский спуск, 2а; 6АО «Медицинский центр "Авиценна"» группы компаний «Мать и дитя»; Россия, 630007Новосибирск, ул. Коммунистическая, 17; 7ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 630091 Новосибирск, Красный просп., 52

Введение. Основной метод дооперационной диагностики рака щитовидной железы (РЩЖ) и выявления его метастазов — цитологическое исследование препаратов, полученных при тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии. Однако результаты такого исследования могут быть неопределенными, а обнаружение метастазов — затруднительным вследствие неопределенности цитологических признаков в ряде образцов. В своей недавней работе мы описали вариант молекулярного классификатора, позволяющего диагностировать и типировать злокачественные опухоли щитовидной железы путем выявления нескольких молекулярных маркеров в цитологических препаратах.

Цель исследования — оценить возможности разработанного метода в дооперационном выявлении метастазов папиллярного и медуллярного РЩЖ в лимфатических узлах боковой клетчатки шеи.

Материалы и методы. Исследовано 86 образцов, полученных при пункционной биопсии отдельных лимфатических узлов у 62 пациентов; во всех случаях по цитологическим данным диагностирован РЩЖ. Проведено исследование образцов методом полимераз-ной цепной реакции в реальном времени. Молекулярными маркерами РЩЖ считали наличие мутации V600E гена ВЯАЕ, нормализованную концентрацию мРНК HMGA2, FN1 и SERPINA1, 5 миРНК и соотношение митохондриальной и ядерной ДНК. Для деления образцов на доброкачественные и злокачественные были использованы классификаторы на основе дерева принятия решений.

Результаты. Описанный ранее классификатор, основанный на анализе мутации V600EBRAF, содержания мРНК HMGA2, 3 микро-РНК и соотношения митохондриальной и ядерной ДНК, позволил выявлять метастазы РЩЖ с хорошей специфичностью (98 %), но меньшей чувствительностью (83 %). Поэтому был создан новый классификатор, основанный на анализе 3маркеров — HMGA2, FN1 и миРНК-375. Он характеризуется большей чувствительностью (93 %) в выявлении метастазов при лишь небольшом снижении специфичности (до 96 %).

Заключение. Мы продемонстрировали возможность дооперационного выявления метастазов РЩЖ в лимфатических узлах боковой клетчатки шеи путем анализа нескольких молекулярных маркеров в цитологическом материале.

Ключевые слова: рак щитовидной железы, метастазы, лимфатические узлы, микроРНК, молекулярная диагностика

Для цитирования: Титов С.Е., Катанян Г.А., Полоз Т.Л. и др. Дооперационное выявление метастазов папиллярного и медуллярного рака щитовидной железы в шейных лимфатических узлах с помощью молекулярного классификатора. Опухоли головы и шеи 2020;10(4):50—9.

Preoperative detection of papillary and medullary thyroid cancer metastases in the lymph nodes of the neck lateral cellular tissue

using a molecular classifier

S.E. Titov1-3, G.A. Katanyan4, T.L. Poloz5, L.G. Izmaylova4, O.A. Zentsova4, L.G. Dryaeva4, V.V. Anishchenko6, 7

'Institute of Molecular and Cellular Biology, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; 8/2 Acad. Lavrentiev Ave., Novosibirsk 630090, Russia;

Контакты: Сергей Евгеньевич Титов titovse78@gmail.com

DOI: 10.17650/2222-1468-2020-10-4-50-59

C«D

2AO Vector-Best; 1/1 Arbuzova St., Novosibirsk 630117, Russia; 3Novosibirsk State University; 1 Pirogova St., Novosibirsk 630090, Russia; 4Regional Clinical Hospital No. 2; 6 Krasnykh Partizan St., Krasnodar 350012, Russia; Clinical Hospital "RZD-Medicine" Novosibirsk"; 2a Vladimirovskiy Spusk St., Novosibirsk 630003, Russia; 6Avicenna Medical Center, Mother and Child group of companies; 17 Kommunisticheskaya St., Novosibirsk 630007, Russia; 7Novosibirsk State Medical University; 52 Krasny Ave., Novosibirsk 630091, Russia

Introduction. The main method of preoperative diagnosis of thyroid tumors and the identification of possible metastasis is a cytological examination of smears obtained by fine-needle aspiration biopsy. However, the cytological material of the lymph nodes may not be adequate, and the detection of metastases faces a number of difficulties. In our recent study, we described a variant of the molecular classifier that allows the detection and typing of malignant thyroid tumors by analyzing several molecular markers in cytological preparations. The study objective was to assess the applicability of the developed method for the preoperative detection of metastases of papillary and medullary thyroid cancer in the lymph nodes of the neck lateral cellular tissue.

Materials and methods. A total of 86 cytological samples were used, obtainedfrom individual lymph nodes of 62 patients who had a diagnosis — thyroid cancer. Samples were analyzed by real-time polymerase chain reaction regarding the preselected set of molecular markers: the BRAF V600E mutation, the normalized concentration of HMGA2, FN1 and SERPINA1 mRNA, 5 miRNAs and the mitochondrial/nuclear DNA ratio. The decision tree-based classifier was used to discriminate between benign and malignant samples.

Results. The previously described classifier, based on the analysis of the BRAF V600E mutation, the content of HMGA2 mRNA, 3 miRNAs and the mitochondrial/nuclear DNA ratio, revealed metastases of thyroid cancer with good specificity (98 %) but less sensitivity (83 %). Therefore, a new classifier was built, including three markers — HMGA2 and FN1 mRNA, and miRNA-375, which, with regard to the detection of metastases, showed good sensitivity — 93 % with a slight decrease in specificity (up to 96 %).

Conclusion. Thus, we demonstrated the possibility of preoperative detection of thyroid cancer metastases in the lymph nodes of the neck lateral cellular tissue by analyzing several molecular markers in cytological material.

Key words: thyroid cancer, metastases, lymph nodes, microRNA, molecular diagnostics

For citation: Titov S.E., Katanyan G.A., Poloz T.L. et al. Preoperative detection of papillary and medullary thyroid cancer metastases in the lymph nodes of the neck lateral cellular tissue using a molecular classifier. Opukholi golovy i shei = Head and Neck Tumors 2020;10(4):50—9. (In Russ.).

Введение

Цитологическое исследование материала, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ), в настоящее время рассматривается как основной метод диагностики узловых образований щитовидной железы (ЩЖ) на дооперационном этапе. В большинстве случаев оно позволяет верифицировать наличие того или иного патологического процесса с учетом морфологических критериев и провести дифференциальную диагностику гиперпластических узлов, доброкачественных и злокачественных опухолей [1]. Однако приблизительно в 30 % наблюдений цитологические признаки могут быть неопределенными, что связано с отсутствием явных признаков атипии в клетках опухолей ЩЖ, и окончательный диагноз можно установить лишь при гистологическом исследовании, т. е. после хирургического вмешательства [2]. Как правило, цитологическое исследование позволяет диагностировать папиллярный, медуллярный и недифференцированный рак ЩЖ (РЩЖ), однако в ряде случаев могут возникать серьезные затруднения при определении степени злокачественности [3].

Ввиду высокой частоты метастазирования карцином ЩЖ в регионарные лимфатические узлы (ЛУ) (14—22 % на момент диагностики заболевания [4, 5]) актуальной проблемой остается цитологическая верификация лимфаденопатий шеи при наличии в ЩЖ

узлов, вызывающих подозрения в их доброкачественности. Однако материал ТАБ ЛУ может быть недостаточно адекватным, а сложности его цитологического исследования часто обусловлены наличием большого количества лимфоидных элементов, гистиоцитов, многоядерных клеток типа гигантских клеток инородных тел, сопутствующих воспалительным и дегенеративным процессам [6].

Совершенствование методов дооперационной верификации патологических процессов в ЩЖ и выявления метастазов РЩЖ в ЛУ необходимо для точного определения объема хирургического вмешательства. В Российских клинических рекомендациях по диагностике и лечению высокодифференцированного рака щитовидной железы у взрослых (2017) предписывается [7]:

— удалять ЛУ центральной зоны (VI уровня), если по данным дооперационного обследования есть подозрение на наличие метастазов в этой зоне (cN1) или они выявлены интраоперационно;

— выполнять профилактическую центральную лим-фаденэктомию (VI уровня, ипси- или билатеральную) при распространенной первичной опухоли (T3 или T4), дооперационно верифицированных метастазах в ЛУ боковой клетчатки шеи (cN1b);

— удалять клетчатку II—V уровней фасциально-клет-чаточного пространства шеи только при доказанном метастатическом поражении ЛУ этих зон

по результатам ТАБ; селективное удаление метастатических ЛУ вне футлярно-фасциального блока не рекомендовано.

Для повышения точности дооперационной диагностики в дополнение к цитологическому исследованию материала ТАБ может быть осуществлен поиск молекулярных маркеров злокачественности в цитологических препаратах [8, 9]. Диагностический потенциал разных типов молекулярных маркеров определяется характерными для них ограничениями. Соматические мутации (точечные замены и транслокации) и повышение уровня экспрессии онкогенов в целом характеризуются высокой прогностической ценностью положительного результата и позволяют повысить общую специфичность типирования. Однако диагностическая чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата может быть достаточно низкой [10] в силу того, что наличие ни одного из этих маркеров не является обязательным при развитии какого бы то ни было типа опухоли.

В то же время количественный анализ экспрессии микроРНК (миРНК) в пункционном материале может обеспечить более высокую диагностическую чувствительность типирования и, соответственно, прогностическую ценность отрицательного результата, однако специфичность такого анализа может быть невысокой [10]; она в значительно большей степени зависит от ошибок, допускаемых при биопсии. Поскольку каждый маркер по отдельности не имеет всех необходимых характеристик, исследователи пытаются их комбинировать, как правило, соединяя выявление мутаций с определением уровня экспрессии ряда генов или с определением профиля экспрессии миРНК [11].

В своей недавней работе мы описали свой вариант молекулярного классификатора, позволяющего выявлять и типировать злокачественные опухоли ЩЖ путем анализа нескольких молекулярных маркеров в цитологических препаратах [12]. Результаты, описанные в той работе, были получены на выборке образцов, относящихся в основном ко II—VI категориям по классификации Bethesda (Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology) [2], и методика не проверялась на образцах ЛУ с метастазами РЩЖ и без них [12]. Цель настоящего исследования — оценить возможности разработанного метода в дооперационном выявлении метастазов папиллярного и медуллярного РЩЖ в лимфатических узлах боковой клетчатки шеи.

Материалы и методы

Клинический материал. В работе было использовано 86 цитологических образцов, полученных при ТАБ отдельных ЛУ у 62 пациентов, которым по данным пунк-ционной биопсии поставлен диагноз РЩЖ (у 60 пациентов — папиллярный рак, у 2 — медуллярный). Образцы были получены в Краевой клинической боль-

нице № 2 (г. Краснодар) в соответствии с законодательством России: от каждого пациента было получено письменное информированное согласие на использование его материала, все данные были деперсонализированы. Протокол исследования был утвержден этическим комитетом Краевой клинической больницы № 2.

При первичной диагностике опухоли ЩЖ у всех пациентов с лимфаденопатией боковой клетчатки шеи выполнена биопсия паравазальных ЛУ. Если при цитологическом исследовании было подтверждено наличие метастазов РЩЖ, проводили тиреоидэктомию, центральную лимфодиссекцию, фасциально-футляр-ную лимфодиссекцию. Получено гистологическое заключение о наличии или отсутствии метастазов в удаленных ЛУ: метастазы обнаружены в 29 из 86 образцов, не выявлены в 57 образцах.

Метод классификации. Первоначально для деления образцов на доброкачественные и злокачественные было использовано дерево принятия решений, предложенное нами ранее [13] (рис. 1).

Рак щитовидной железы / Thyroid cancer

миР-375 / miR-375 +

i 1

миР-146Ь / miR-146b + >

1 f

мтДНК/ mtDNA + *

Медуллярный / Medullary

Папиллярный/ Papillary

Гюртлеклеточ-ный / Hürthle cell

Фолликулярная опухоль с молекулярными маркерами злокачественности/ Follicular tumor with molecular markers of malignancy

Рис. 1. Дерево принятия решений (классификатор) для деления образцов, полученных при тонкоигольной биопсии щитовидной железы, на доброкачественные и злокачественные с последующим типированием последних. «+» означает превышение установленного уровня отсечки для данного маркера или выявление мутации BRAF V600E Fig. 1. Decision tree for stratification of thyroidfine needle aspiration puncture biopsy smears on benign and malignant, followed by typing the latter. "+" means exceeding the established cutoff level for the marker or identifying the BRAF V600E mutation

Предложенный классификатор делит все цитологические образцы на следующие группы:

— доброкачественные образования, в том числе фолликулярные аденомы (фолликулярные опухоли без маркеров злокачественности);

— злокачественные образования: папиллярный, медуллярный, гюртлеклеточный рак, фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности. Анаплас-тический рак и низкодифференцированные карциномы не выделяются данным классификатором как отдельные типы, но определяются как злокачественные.

Выделение нуклеиновых кислот. Высушенный цитологический препарат смывали в пробирку 3 порциями по 200 мкл лизирующего буфера (4 моль/л гуани-дина изотиоцианата, 25 ммоль/л цитрата натрия, 0,3 % саркозила, 3 % дитиотреитола). Пробирки помещали в термошейкер на 10 мин при 65 °С. Раствор центрифугировали в течение 2 мин при 10 000 g, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли к нему равный объем изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугиро-

вали в течение 10 мин при 12 000 g, супернатант сливали, осадок промывали в 500 мкл 70 % этанола, затем в 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деиони-зованной воды.

Молекулярный анализ. Оценку относительного уровня экспрессии генов HMGA2, FN1, SERPINA1 (с нормализацией на ген домашнего хозяйства PGK1), миРНК-146Ь, -221, -375, -31, -551Ь (с нормализацией на геометрическое среднее содержания миРНК-29Ь, -23а, -197), соотношения митохондриальной и ядерной ДНК, а также определение соматической мутации V600E в гене BRAF осуществляли так, как описано ранее [12]. Дополнительные маркеры: миРНК-31 и -551Ь — выбраны на основании результатов предыдущего исследования [12], 2 новых гена: FN1 и SERPINA1 — выбраны на основании данных научной литературы [14—16]. Олигонуклео-тиды, использованные в работе, приведены в табл. 1.

Классификацию цитологических препаратов ЛУ проводили с помощью программы TANAGRA [17] методом построения дерева принятия решений С4.5 [18] с оценкой качества прогноза с помощью кросс-валидации с 5 разбиениями.

Таблица1. Использованные в работе последовательности олигонуклеотидов Table 1. The sequences of oligonucleotides used in this work

Мишень Ihn олигонуклеотида Последовательность (5' ^ 3')

Target Sequence (5' ^ 3')

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTATTCGCACCTCCGACACGA

RT primer CAGCCTATG

миР-146Ь Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-146b ПЦР-зонд TaqMan probe

(R6G)-ATTCGCACC(T-BHQ1)CCGACACGACAGCCTATG

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer ACCAGCTGAGAACTGAATTCC

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTATTCGCACCTCGACACGAC

RT primer GAAACCCA

миР-221 Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-221 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-ATTCGCACC(T-BHQ1)CGACACGACGAAACCCAG

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CAGCAGCTACATTGTCTGC

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTATTCGCACCTCGACACGAC

RT primer AGCTATGC

миР-31 Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-31 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-ATTCGCACC(T-BHQ1)CGACACGACAGCTATGC

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CAAGCAGGCAAGATGCTG

Продолжение табл. 1 Continuation of table 1

Мишень Target Ihn олигонуклеотида Oligonucleotide type Последовательность (5' ^ 3') Sequence (5' ^ 3')

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTATTCGCACCTCGACACGACT

RT primer CACGCGA

миР-375 Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-375 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-ATTCGCACC(T-BHQ1)CGACACGACTCACGCGA

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer ACAGCTTTGTTCGTTCGGC

ОТ-праймер GAGGAGAGGCCTTGTAGCACGACCTTATCCTCACCTCCT

RT primer CTCCTCCTGAAACC

миР-551Ь Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer GCCTTGTAGCACGACCTTA

miR-551b ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TC(C-LNA)TCACC(T-BHQ1)CCTCTCCTCCTGAAACC

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CACACTCAGCGACCCATACTT

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTTTCGCACCCTCGACACGAC

RT primer AA(C-LNA)AC(T-LNA) GAT

миР-29Ь Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-29b ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TTCGCACCC(T-BHQ1)CGACACGACAACACTGAT

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CAGCACTAGCACCATTTGAA

ОТ-праймер GTCGTGTCTGAGGCTCACTGAGACCTTTCGCACCCTCGACACGAC

RT primer GGAAATCC

миР-23а Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CTGAGGCTCACTGAGACCT

miR-23a ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TTCGCACCC(T-BHQ1)CGACACGACGGAAATCC

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CAGCACATCACATTGCCAG

ОТ-праймер GTCGTGGGTGAAGCAGACAGACACAATTACGCACCTGCCACGAC

RT primer GCTGGGTG

миР-197 Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer GTGAAGCAGACAGACACAA

miR-197 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TTACGCACC(T-BHQ1)GCCACGACGCTGGGTG

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CCACGTTCACCACCTTCTC

Обратный ОТ/ПЦР-праймер Reverse RT/PCR primer ACTTGTTGTGGCCATTTCCT

HMGA2 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-CAGAAGCCAC(T-BHQ1)GGAGAAAAACGGCCAA

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer TCCCTCTAAAGCAGCTCAAAA

Окончание табл. 1 The end of table 1

Мишень Target Hin олигонуклеотида Oligonucleotide type Последовательность (5' ^ 3') Sequence (5' ^ 3')

Обратный ОТ/ПЦР-праймер Reverse RT/PCR primer CTGCACGAACATCGGTGAA

FN1 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-ACCACA(T-BHQ1)CGAGCGGATCTGGCCCC

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer GAGGAGAGTGGAAGTGTGA

Обратный ОТ/ПЦР-праймер Reverse RT/PCR primer CCTGCCAGCAGGAGGATG

SERPINA1 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TGGGA(C-LNA)AG(T-BHQ1)GAATCGACAATGCCGTCTTC

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CCTGTCTCCTCAGCTTCA

Обратный ОТ/ПЦР-праймер Reverse RT/PCR primer GCTGGCTCGGCTTTAAC

PGK1 ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TTCCCAGAAGCA(T-BHQ1)CTTTTCCCTTCCCTTCT

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer GGAGAACCTCCGCTTTCAT

Митохонд- Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer GATCACAGGTCTATCACCCTA

риальная ДНК Mitochondrial ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-TGCATGGAGAGC(T-BHQ1)CCCGTGAGTGGT

DNA Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CCCCAGACGAAAATACCAAA

Обратный ПЦР-праймер Reverse PCR primer CCATAGTTTCACCAGTGAGG

Ядерная ДНК Nuclear DNA ПЦР-зонд TaqMan probe (R6G)-CCAGGGAC(T-BHQ1)CTTCTGGGCTGCTGAGAT

Прямой ПЦР-праймер Forward PCR Primer CATTGTCAGCCAGTGAGT

Примечание. ОТ-праймер — праймер, используемый в обратной транскрипции; ПЦР — полимеразная цепная реакция; BHQ1 — гаситель флуоресценции типа «черная дыра» 1; LNA — заблокированная (запертая, закрытая) нуклеиновая кислота; R6G — родамин 6G (родамин 590).

Note. BHQ1 — black hole quencher 1; LNA — locked nucleic acid; PCR — polymerase chain reaction; R6G — rhodamine 6G (rhodamine 590); RT primer — reverse transcription primer.

Доверительные интервалы для чувствительности, специфичности и точности рассчитывались по методу Клоппера—Пирсона. Доверительные интервалы для прогностических значений являются стандартными логитными доверительными интервалами, приведенными в [19].

Результаты

Цитологические препараты были проанализированы с помощью предложенного нами молекулярного классификатора, позволяющего определить образец

как злокачественный или доброкачественный. Относительный уровень экспрессии отдельных маркеров представлен на рис. 2, результаты деления ЛУ на доброкачественные и злокачественные приведены в табл. 2.

Из 29 ЛУ, в которых при гистологическом исследовании подтверждено наличие метастазов, в 27 выявлен папиллярный рак, в 2 — медуллярный. С помощью молекулярного классификатора к злокачественным было отнесено 24 ЛУ, к доброкачественным — 5, т. е. метастазы были выявлены этим методом в 82,8 % случаев. Из 57 ЛУ, в которых при цитологическом исследовании

10,00

0,10

миР-146Ь / miR-146b

1 ______

|Г

1Л1Л1Л1Л

10,00 1,00 0,10 0,01

Г

миР-221 / miR-221

А

w W 1Л1Л1Л 1Л1Л1Л

¿¿¿^^ееееееее

§00000000

миР-375 / miR-375

HMGA2

100,0000 10,0000 1,0000 0,1000 0,0100 0,0010 0,0001

1Л1Л1Л1Л1Л1Л1Л1Л1Л

£££££ 1=1=1=1=1=1=1=1=1=

1Л 1Л 1Л 1Л 1Л

1Л1Л1Л1Л

10,000000 1,000000 01,00000 0,010000 0,001000 0,000100 0,000001

^^^ееееееее

= 00000000

fcfcfcfcjgEEEEEEEE = 00000000

1Л 1Л 1Л 1Л

сссссссс

ссссссссс

сссссссс

сссссссс

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии миРНК-146Ь, -21, -375 и гена HMGA2 в цитологических образцах (в порядке возрастания). Данные приведены в виде логарифмической шкалы, образцы с признаками метастазов медуллярного рака выделены красным. Mts PTC — лимфатические узлы с метастазами папиллярного рака (n = 27); Mts MTC — лимфатические узлы с метастазами медуллярного рака (n = 2); Ln without mts — лимфатические узлы без метастазов (n = 57)

Fig. 2. All values of relative expression levels of miRNA-146b, -221, -375 and the HMGA2 gene in increasing order in fine needle aspiration puncture biopsy smears. Data are shown on a logarithmic scale, samples with metastases of medullary cancer are highlighted in red. Mts PTC — lymph nodes with metastases ofpapillary thyroid carcinoma (n = 27); Mts MTC — lymph nodes with metastases of medullary thyroid carcinoma (n = 2); Ln without mts — lymph nodes without metastases (n = 57)

Таблица 2. Результаты деления лимфатических узлов на доброкачественные и злокачественные с помощью молекулярного классификатора

Table 2. Results of classification of lymph nodes into benign/malignant by molecular classifier

Результат применения молекулярного классификатора molecular classifier Результат цитологического/ гистологического исследования

Result of cytological/histological analysis

Обнаружены метастазы Lymph node metastases Лимфатический узел без метастазов

Рак Cancer 24 1

Доброкачественные

образования 5 56

Benign

метастазы не были обнаружены, при молекулярном анализе также не было обнаружено маркеров злокачественности в 56 образцах, т. е. точность при определении ЛУ без метастазов составила 98,2 %.

Диагностические характеристики метода выявления ЛУ с метастазами с помощью молекулярного классификатора (включая 95 % доверительный интервал):

♦ специфичность

♦ чувствительность

♦ точность

♦ прогностическая ценность положительного результата

♦ прогностическая ценность отрицательного результата Таким образом, предложенный нами классификатор при хорошей специфичности выявления метастазов дифференцированного РЩЖ в ЛУ продемонстрировал меньшую чувствительность.

98,2 % (90,6-99,7 %) 82,8 % (64,2-94,2 %) 93,0 % (85,4-97,4 %)

96,0 % (77,3-97,4 %)

91,8 % (83,4-96,2 %)

Поскольку дерево принятия решений, построенное для выявления признаков злокачественности в узлах ЩЖ, характеризуется недостаточной чувствительностью при выявлении метастазов в ЛУ, для последних мы построили отдельное дерево принятия решений, добавив при машинном обучении в качестве дополнительных маркеров миРНК-31 и -551Ь и гены FN1 и SERPINA1. Относительный уровень экспрессии дополнительных маркеров представлен на рис. 3, получившееся дерево принятия решений — на рис. 4, результаты деления образцов на доброкачественные /злокачественные с помощью нового классификатора — в табл. 3.

Диагностические характеристики метода выявления ЛУ с метастазами с помощью нового молекулярного классификатора (включая 95 % доверительный интервал):

♦ специфичность 96,5 % (87,9-99,6 %)

♦ чувствительность 93,1 % (77,2-94,2 %)

♦ точность 95,3 % (88,5-98,7 %)

♦ прогностическая ценность положительного результата 93,1 % (77,5-98,1 %)

♦ прогностическая ценность отрицательного результата 96,5 % (87,8-99,1 %) Классификатор, построенный специально для

выявления признаков метастазов папиллярного и медуллярного РЩЖ в ЛУ, характеризуется более высокой чувствительностью, но несколько худшей специфичностью.

Обсуждение

В настоящее время основными методами доопера-ционного выявления метастазов в ЛУ являются ультразвуковое исследование ЛУ шеи и ТАБ. Однако данные методы имеют свои ограничения, и существует необходимость в расширении диагностического арсенала за счет новых методов, позволяющих повысить точность

10,000 1,000 0,100 0,010 0,001

миР-31 / miR-31

rr—

1Л1Л1Л1Л

0,0100 0,0010 0,0001

миР-551Ь / miR-551b

¡riliilP

¿¿^^^ееееееее

FN1

SERPINA1

= 00000000

1Л1Л1Л1Л

10,000

0,100 0,010

l:l Í !

НИР"-

= 00000000

1Л1Л1Л1Л

_л

____J

IIP' 1 llll liP"F

ii 11 и

§00000000

1Л1Л 1Л1Л 1Л1Л 1Л1Л

fcfcfcfcfcEEEEEEEE Д Д Д Д Д 13 13 13 13 13 13 13 13

ёёёё^оооооооо

cccccccc

cccccccc

cccccccc

cccccccc

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии миРНК-31, -551b и генов FN1 и SERPINA1 в цитологических образцах (в порядке возрастания). Данные приведены в виде логарифмической шкалы, образцы с метастазами медуллярного рака выделены красным. Mts PTC — лимфатические узлы с метастазами папиллярного рака (n = 27); Mts MTC — лимфатические узлы с метастазами медуллярного рака (n = 2); Ln without mts — лимфатические узлы без метастазов (n = 57)

Fig. 3. All values of the relative expression levels of miRNA-31, -551b and the FN1 and SERPINA1 genes in increasing order in fine needle aspiration puncture biopsy smears. Data are shown on a logarithmic scale, samples with metastases of medullary cancer are highlighted in red. Mts PTC — lymph nodes with metastases of papillary thyroid carcinoma (n = 27); Mts MTC — lymph nodes with metastases of medullary thyroid carcinoma (n = 2); Ln without Mts — lymph nodes without metastases (n = 57)

Нет метастазов / Without metastases

Таблица 3. Результаты деления лимфатических узлов на метастатически пораженные и без признаков метастазов с помощью нового молекулярного классификатора

Table 3. Results of classification of lymph nodes into benign/malignant by the new molecular classifier

Результат применения Результат цитологического/ гистологического исследования

Result of cytological/histological analysis

молекулярного

классификатора Обнаружены метастазы Лимфатический узел без метастазов

Result of using the molecular classifier

Рак Cancer 27 2

Доброкачественные образования Benign 2 55

Рис. 4. Дерево принятия решений (классификатор) для деления образцов, полученных при тонкоигольной аспирационной биопсии лимфатических узлов, на содержащие и не содержащие метастазы. «+» означает превышение установленного уровня отсечки для данного маркера Fig. 4. Decision tree for classifying lymph node fine needle aspiration puncture biopsy smears as containing and not containing metastases. "+" means exceeding the established cutoff level for the marker

выявления метастазов. Учитывая собственный опыт выявления и типирования злокачественных опухолей ЩЖ в материале ТАБ, на основе анализа нескольких молекулярных маркеров (определения уровня экспрессии нескольких миРНК, онкогена HMGA2, соотношения митохондриальной и ядерной ДНК и выявления мутации в гене BRAF) [12], мы оценили возможность применения данного подхода к дооперационному выявлению метастазов в ЛУ. Предложенный нами классификатор при хорошей специфичности (98 %) выявления метастазов РЩЖ в ЛУ продемонстрировал

меньшую чувствительность (83 %). Что касается типирования, то оба метастаза медуллярного рака с помощью классификатора были определены как медуллярный рак, а из 22 ЛУ с метастазами папиллярного рака с помощью классификатора 20 (91 %) были определены как папиллярный рак, а 2 (9 %) — как фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности.

В целом профиль молекулярных маркеров метастазов рака не отличался существенным образом от такового злокачественных узлов ЩЖ. Но профиль молекулярных маркеров ЛУ без метастазов отличался от профиля доброкачественных узлов ЩЖ. Самое принципиальное различие — повышенный уровень экспрессии миРНК-146Ь в нормальных ЛУ по сравнению с таковым в доброкачественных узлах ЩЖ. Несмотря на то что миРНК-146Ь — один из принципиально важных маркеров папиллярного РЩЖ, в данном случае это не

сказалось на специфичности метода, поскольку эта миРНК используется только на этапе типирования, а не на этапе деления образцы на доброкачественные и злокачественные.

Недостаточная чувствительность, по-видимому, объясняется недостаточным размахом изменений использованных маркеров, так что в образцах с метастазами эти изменения не удавалось зафиксировать в сравнении с уровнем маркеров в материале самого ЛУ. Таким образом, из 27 образцов с метастазами папиллярного рака мутация V600E в гене BRAF была выявлена в 15 (55 %), повышенный уровень экспрессии гена НМ6А2 — в 16 (59 %), повышенный уровень миРНК-375 — в 9 (33 %), повышенный уровень миРНК-221 — в 12 (44 %).

По этой причине мы решили построить отдельное дерево принятия решений для выявления метастазов в ЛУ с привлечением дополнительных молекулярных маркеров. В частности, на этапе обучения мы добавили к первоначальному набору маркеров миРНК-31 и -551Ь, экспрессия которых повышается при папиллярном раке, а также 2 онкогена — FN1 и SERPINA1. В конечном счете в новый классификатор было включено 3 маркера — НМОА2, FN1 и миРНК-375, при этом чувствитель-

ность нового классификатора при выявлении метастазов оказалась выше — 93 %, а специфичность снизилась лишь незначительно — до 96 %. Повышение чувствительности произошло за счет одного из дополнительных маркеров — гена FN1. В целом этот маркер хуже выявляет злокачественные опухоли ЩЖ, чем НМОА2 (данные не опубликованы), но его изменения имеют больший размах: разница между минимальным и максимальным уровнем относительной экспрессии FN1 в 3 раза больше, чем аналогичный показатель НМОА2.

Заключение

В данной работе мы продемонстрировали возможность дооперационного выявления метастазов РЩЖ в ЛУ боковой клетчатки шеи путем анализа нескольких молекулярных маркеров в материале ТАБ. Данный метод не требует специального (повторного) проведения биопсии, поэтому анализ может быть выполнен вслед за цитологическим исследованием образца.

Выводы данной работы ограничены вследствие относительно небольшого размера выборки и ввиду того, что отсутствие метастазов в 57 ЛУ было установлено только при цитологическом исследовании.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Bongiovanni M., Spitale A., Faquin W.C. et al. The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology: a meta-analysis. Acta Cytol 2012;56(4):333-9.

DOI: 10.1159/000339959.

2. Ali S., Cibas E. The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology: definitions, criteria, and explanatory notes. 2nd edn. New York: Springer, 2018.

DOI: 10.1007/978-3-319-60570-8.

3. Wang C.C., Friedman L., Kennedy G.C. et al. A large multicenter correlation study of thyroid nodule cytopathology and histopathology. Thyroid 2011;21(3):243-51. DOI: 10.1089/thy.2010.0243.

4. Zaydfudim V., Feurer I.D., Griffin M.R., Phay J.E. The impact of lymph node involvement on survival in patients with papillary and follicular thyroid carcinoma. Surgery 2008;144(6):1070-8.

DOI: 10.1016/j.surg.2008.08.034.

5. Liu F.H., Kuo S.F., Hsueh C. et al. Postoperative recurrence of papillary thyroid carcinoma with lymph node metastasis. J Surg Oncol 2015;112(2):149-54.

DOI: 10.1002/jso.23967.

6. Torres M.R., Nobrega Neto S.H., Rosas R.J. et al. Thyroglobulin in the washout fluid of lymph-node biopsy: what is its role

in the follow-up of differentiated thyroid carcinoma? Thyroid 2014;24(1):7-18. DOI: 10.1089/thy.2013.0244.

7. Бельцевич Д.Г., Ванушко В.Э., Румянцев П.О. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению высокодифференцированного рака щитовидной железы у взрослых, 2017 год. Эндокринная хирургия 2017;11(1):6—27. [Beltsevich D.G., Vanushko V.E., Rumiantsev P.O. et al. 2017 Russian clinical practice guidelines for differentiated thyroid cancer diagnosis and treatment. Endokrinnaya hirurgiya = Endocrine Surgery 2017;11(1):6-27.

(In Russ.)].

8. Shibru D., Chung K.W., Kebebew E. Recent developments in the clinical application of thyroid cancer biomarkers. Curr Opin Oncol 2008;20(1):13-8. DOI: 10.1097/cc0.0b013e3282f27e49.

9. Villabona C.V., Mohan V., Arce K.M. et al. Utility of ultrasound versus gene expression classifier in thyroid nodules with atypia of undetermined significance. Endocr Pract 2016;22(10):1199-203. DOI: 10.4158/EP161231.OR.

10. Keutgen X.M., Filicori F., Fahey T.J. 3rd. Molecular diagnosis for indeterminate thyroid nodules on fine needle aspiration: advances and limitations. Expert Rev Mol Diagn 2013;13(6):613-23.

DOI: 10.1586/14737159.2013.811893.

11. Labourier E., Shifrin A., Busseniers A.E. et al. Molecular testing for miRNA, mRNA, and DNA on fine-needle

aspiration improves the preoperative diagnosis of thyroid nodules with indeterminate cytology. J Clin Endocrinol Metab 2015;100(7):2743-50. DOI: 10.1210/jc.2015-1158.

12. Titov S.E., Ivanov M.K., Demenkov P.S. et al. Combined quantitation of HMGA2 mRNA, microRNAs, and mitochondrial-DNA content enables the identification and typing of thyroid tumors in fine-needle aspiration smears. BMC Cancer 2019;19(1): 1010. DOI: 10.1186/s12885-019-6154-7.

13. Titov S.E., Demenkov P.S., Lukyanov S.A. et al. Preoperative detection of malignancy in fine-needle aspiration cytology (FNAC) smears with indeterminate cytology (Bethesda III, IV) by a combined molecular classifier. J Clin Pathol 2020;73(11):722-7.

DOI: 10.1136/jclinpath-2020-206445.

14. Vierlinger K., Mansfeld M.H., Koperek O. et al. Identification of SERPINA1 as single marker for papillary thyroid carcinoma through microarray meta analysis and quantification of its discriminatory power in independent validation. BMC Med Genomics 2011;4:30.

DOI: 10.1186/1755-8794-4-30.

15. Sponziello M., Rosignolo F., Celano M., et al. Fibronectin-1 expression

is increased in aggressive thyroid cancer and favors the migration and invasion of cancer cells. Mol Cell

Оригинальное исследование

Endocrinol 2016;431:123-32. DOI: 10.1016/j.mce.2016.05.007.

17. Rakotomalala R. [TANAGRA: a free software for research and academic purposes (In French)]. In: Proceedings of EGC'2005, RNTI-E-3. Vol. 2. Pp. 697-702.

San Francisco: Morgan Kaufmann Publishers Inc., 1993.

16. Qiu J., Zhang W., Zang C. et al.

Identification of key genes and miRNAs markers of papillary thyroid cancer. Biol Res 2018;51(1):45. DOI: 10.1186/s40659-018-0188-1.

18. Quinlan J.R. C4.5: programs for machine learning.

19. Mercaldo N.D., Lau K.F., Zhou X.H. Confidence intervals for predictive values with an emphasis to case-control studies. Stat Med 2007;26(10):2170-83. DOI: 10.1002/sim.2677.

Вклад авторов

С.Е. Титов: разработка дизайна исследования, проведение молекулярно-генетического тестирования, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание текста статьи;

Г.А. Катанян: разработка концепции и дизайна исследования, отбор пациентов, написание текста статьи; Т.Л. Полоз: разработка концепции исследования, научное редактирование статьи; Л.Г. Измайлова, О.А. Зенцова, Л.Г. Дряева: отбор пациентов;

B.В. Анищенко: анализ полученных данных, научное редактирование статьи. Authors' contributions

S.E. Titov: developing of research design, molecular genetic testing, analysis of the obtained data, reviewing of publications on the article's theme, article writing;

G.A. Katanyan: developing of study concept and design, selection of patients, article writing;

T.L. Poloz: developing of study concept, scientific editing of the article;

L.G. Izmaylova, О.А. Zentsova, L.G. Dryaeva: selection of patients;

V.V. Anishchenko: analysis of the obtained data, scientific editing of the article.

ORCID авторов / ORCID of authors

C.Е. Титов / S.E. Titov: https://orcid.org/0000-0001-9401-5737 Т.Л. Полоз / T.L. Poloz: https://orcid.org/0000-0003-4006-7560

В.В. Анищенко / V.V. Anishchenko: https://orcid.org/0000-0003-1178-5205

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-14-00074). Financing. The study was performed with a financial support of Russian Science Foundation (project No. 20-14-00074).

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике Краевой клинической больницы № 2 (г. Краснодар). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics

The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Regional Clinical Hospital No. 2 (Krasnodar). All patients gave written informed consent to participate in the study

Статья поступила: 07.07.2020. Принята к публикации: 20.10.2020. Article submitted: 07.07.2020. Accepted for publication: 20.10.2020.