CC BY
74
CV
es
и ш U
Анализ относительной экспрессии гена HMGA2 и онкогенной микроРНК-221 в цитологических препаратах, полученных при тонкоигольной аспирационной биопсии
узлов щитовидной железы
С.Е. Титов1, 2, М.К. Иванов1, 2, Е.В. Цивликова2, М.С. Ганжа2, Е.С. Малахина1, А.В. Малек3, 4, Т.Л. Полоз5,
С.П. Шевченко6, Н.Н. Колесников1
ФГБУНИнститут молекулярной и клеточной биологии СО РАН; Россия, 630090 Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8/2; 2АО «Вектор-Бест»; Россия, 630559 Новосибирская область, пос. Кольцово, Научно-производственная зона, корпус 36; 3ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Россия, 197758 Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68; 4ООО «Онко-система»; Россия, 194356Санкт-Петербург, ул. Хошимина, 11; 5НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Новосибирск-Главный ОАО «РЖД»; Россия, 630003 Новосибирск,
Владимировский спуск, 2а; 6ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 1»; Россия, 630047Новосибирск, ул. Залесского, 6
Контакты: Сергей Евгеньевич Титов [email protected]
Введение. Цитологический анализ препаратов тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии является «золотым стандартом» дооперационной диагностики рака щитовидной железы (ЩЖ). Однако этот метод не всегда позволяет надежно дифференцировать доброкачественные и злокачественные узлы ЩЖ. Так, цитологическое заключение «фолликулярная опухоль или подозрение на фолликулярную опухоль» предполагает оперативное вмешательство. Однако в большинстве случаев это заключение соответствует не фолликулярному раку, а доброкачественной фолликулярной аденоме, в отношении которой хирургическое вмешательство оказывается избыточным. В связи с этим актуален поиск биологических маркеров, анализ содержания которых мог бы повысить специфичность определения злокачественных опухолей. К таким маркерам может относиться повышение уровня экспрессии онкогенов или изменение экспрессии микроРНК, поскольку известно, что при развитии опухолей ЩЖ существенно меняется содержание целого ряда микроРНК.
Материалы и методы. С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с детекцией в реальном времени проведен анализ уровня экспрессии гена HMGA2, в норме активного на эмбриональной стадии, и онкогенной микроРНК миРНК-221 в 713 цитологических препаратах ЩЖ (окрашенный материал, высушенный на стеклах), полученных при выполнении стандартной тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии. Выборка включала препараты, соответствующие разным цитологическим заключениям: доброкачественные образования (n = 375), фолликулярные опухоли или подозрение на фолликулярную опухоль (n = 143), медуллярный рак (n = 7), папиллярный рак (n = 186), анапластический рак (n = 2).
Результаты. Содержание матричной РНК (мРНК) HMGA2 (P = 1,6 х 10-66; площадь под ROC-кривой 0,946) и миРНК-221 (P = 6,3 х 10-61; площадь под ROC-кривой 0,927) оказалось достоверно повышенным при папиллярном раке по сравнению с доброкачественными опухолями. Фолликулярные опухоли продемонстрировали существенную неоднородность по содержанию обоих молекулярных маркеров. При этом для образцов из этой группы с повышенным (в среднем в 85 раз) уровнем экспрессии гена HMGA2 был характерен также повышенный (в среднем в 3раза) уровень миРНК-221. Группа фолликулярных опухолей, в которых не выявлены повышенные уровни мРНК гена HMGA2, по содержанию перечисленных маркеров не отличалась от группы доброкачественных образований. Заключение. Полученные результаты показывают, что оценка экспрессии мРНК HMGA2 и онкогенной миРНК-221 позволяет дифференцировать на дооперационной стадии папиллярный рак ЩЖ и доброкачественные неопухолевые образования, а по содержанию мРНК HMGA2 можно разделить группу фолликулярных опухолей на подгруппы, предположительно различающиеся по риску злокачественности.
Ключевые слова: рак щитовидной железы, молекулярные маркеры, HMGA2, микроРНК-221, тонкоигольная аспирационная пунк-ционная биопсия
DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-4-24-31
Analysis of relative expression of the HMGA2 gene and oncogenic microRNA-221 in cytological slides obtained by a fine-needle aspiration biopsy of the thyroid nodules
S.E. litov1'2, M.K. Ivanov1'2, E.V. Tsivlikova2, M.S. Ganzha2, E.S. Malakhina1, A.V. Malek3 4, T.L. Poloz5, S.P. Shevchenko6, \N.N. Kolesnikov'
1Institute of Molecular and Cell Biology Siberian branch of Russian Academy of Sciences; 8/2 Acad. Lavrent'eva prospect,
Novosibirsk 630090, Russia;
2Vector-Best; build. 36 Scientific-production zone, Kol'tsovo, Novosibirsk Oblast 630559, Russia;
3N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 68 Leningradskaya St., Pesochnyy Settlement,
Saint Petersburg 197758, Russia; 4Oncosystem; 11 Khoshimina St., Saint Petersburg 194356, Russia; 5Railway Clinical Hospital on the Station Novosibirsk-Glavniy; 2a Vladimirovskiy Spusk, Novosibirsk 630003, Russia; City Clinical Hospital No. 1; 6 Zalesskogo St., Novosibirsk 630047, Russia
Background. Fine-needle aspiration biopsy is recognized as the "gold standard" in the preoperative diagnosis of thyroid cancer. However, this method does not always allow reliable differentiation between benign and malignant thyroid nodules. Thus, the cytological report of a "follicular neoplasm or suspicious for a follicular neoplasm" suggests surgical lobectomy. However, in most cases, this conclusion does not point to follicular cancer but to benign neoplasm, follicular adenoma, where the surgical intervention is excessive. This implies the great relevance of finding biological markers capable of enhancing the specificity of detecting malignant neoplasms. Such markers may include an increase in the level of expression of oncogenes or a change in the expression of microRNA, since it is known that the content of a number of microRNAs changes significantly during the development of thyroid tumors.
Materials and methods. The expression level of the HMGA2 gene, normally active at the embryonic stage, and oncogenic miRNA-221 mi-croRNA was analyzed using real-time reverse transcription polymerase chain reaction in 713 cytological preparations of the thyroid gland (stained material dried on glasses) obtained by standard fine-needle aspiration biopsy. The sample included preparations corresponding to different cytological diagnoses: benign (n = 375), follicular neoplasm or suspicious for a follicular neoplasm (n = 143), medullary carcinoma (n = 7), papillary carcinoma (n = 186) and anaplastic carcinoma (n = 2).
Results. The content of messenger RNA (mRNA) HMGA2 (P = 1.6 x 10-66, area under curve ROC 0.946) and miR-221 (P = 6.3 x 10-61, area under curve ROC 0.927) proved to be significantly elevated in papillary carcinoma compared to benign tumors. Follicular neoplasms showed significant heterogeneity in the quantity of both molecular markers. At the same time, an elevated level of miR-221 (3 times on average) was also characteristic of samples from this group with an increased level of expression of the HMGA2 gene (an average of 85 times). With regard to the quantity of these markers, the group of follicular neoplasms, in which no increase in the HMGA2 mRNA level was detected, did not differ from the group of benign nodules.
Conclusions. The obtained results show that assessing the expression of HMGA2 mRNA and oncogenic miR-221 makes it possible to differentiate the papillary thyroid carcinoma from goiter at the preoperative stage, and based on the content of the HMGA2 mRNA, the group of follicular neoplasms can be divided into subgroups presumably differing in the risk of malignancy.
Key words: thyroid cancer, molecular markers, HMGA2, microRNA-221, fine needle aspiration biopsy
cv
ев
и ш u
Введение
Среди всех заболеваний эндокринной системы узловые патологии щитовидной железы (ЩЖ) преобладают по распространенности и встречаются (по различным данным) у 4—10 % населения. Большинство (~95 %) узлов доброкачественные и не требуют оперативного вмешательства [1]. Точность дооперацион-ного определения типа узловой патологии принципиальна, поскольку диагноз определяет необходимость и объем хирургического вмешательства. Основной метод дооперационной диагностики — цитологическое исследование препарата, полученного с помощью направляемой ультразвуком тонкоигольной аспираци-онной пункционной биопсии. Несмотря на то, что цитологический анализ на данный момент является «золотым стандартом» дооперационной диагностики, его технические ограничения и зависимость от подготовки исполнителя в ряде случаев не позволяют надежно дифференцировать доброкачественные и злокачественные узлы [2]. Особенно это касается фолликулярных опухолей. Цитологический анализ не в состоянии разделить доброкачественные фолликулярные аденомы (ФА), не требующие хирургического вмешательства, и фолликулярный рак (ФР). В результате пациентов, у которых развивается ФА, по результатам цитологического анализа направляют на операцию, которая является ненужной и может иметь долговременные отрицательные последствия для здоровья. Применение на стадии дооперационной диагностики дополнитель-
ных диагностических тестов с более высокой положительной предсказательной ценностью в отношении злокачественных опухолей могло бы помочь снизить долю нежелательных медицинских манипуляций.
Негистоновые белки хроматина из семейства HMGA (high mobility group A), являющиеся архитектурными факторами транскрипции, достаточно давно известны как маркеры злокачественности и быстрой прогрессии [3]. Белки HMGA влияют на целый спектр биологических процессов в клетке, включая рост, пролиферацию и дифференцировку. Оба гена, кодирующие белки HMGA (HMGA1 и HMGA2), активно экспрессируются на эмбриональном этапе развития, в то время как в клетках взрослого организма их экспрессия находится на фоновом уровне [4]. Однако при развитии злокачественных опухолей эпителиального происхождения уровень экспрессии этих генов опять значительно повышается. Увеличение уровня экспрессии гена HMGA2 было отмечено при раке толстой кишки [5], мочевого пузыря [6], ЩЖ [7], кожи [8], яичников [9] и др.
Возможность оценки уровня экспрессии гена HMGA2 для стратификации злокачественных и доброкачественных опухолей и неопухолевых образований в препаратах ЩЖ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) впервые показана почти 10 лет назад [10]. Авторы проанализировали выборку гистологических препаратов (n = 61), представленную преимущественно образцами папиллярного рака (ПР; n = 28), ФА (n = 19) и ФР (n = 9),
ж ш
и
N
ев
и ш и
х ш
и
и выявили повышение уровня экспрессии этого гена в злокачественных опухолях по сравнению с доброкачественными. Чувствительность и специфичность определения злокачественных новообразований, основанные на оценке содержания матричной РНК (мРНК) ИМ0А2, составили 95,9 и 93,9 % соответственно [10]. Схожая методика использована в работе [11], в которой был проведен анализ экспрессии ИМОА2 в 115 цитологических препаратах с известным гистологическим заключением. Несмотря на высокую (97 %) специфичность определения злокачественных новообразований, диагностическая чувствительность составила лишь 71 %, что может быть связано с иной структурой выборки, в которой лишь небольшую (п = 22 (19,1 %)) долю составили образцы ПР, но при этом 80 (69,6 %) образцов представляли собой фолликулярные опухоли. В работе [12] на выборке из 170 гистологических и 226 цитологических препаратов узлов ЩЖ было подтверждено существенное повышение уровня экспрессии гена ИМОА2 в большинстве злокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными опухолями и образованиями, а также продемонстрирована высокая корреляция между результатами цитологического и гистологического исследования препаратов. В то же время в некоторых работах авторам не удалось выявить достоверных различий в уровне экспрессии гена ИМОА2 в злокачественных и доброкачественных опухолях и образованиях с помощью количественной ПЦР [13, 14].
Таким образом, существует консенсус относительно роли гена ИМОА2 в процессах образования злокачественных опухолей, в том числе ЩЖ, однако выводы относительно применимости данного маркера для диагностических целей, полученные разными авторами, расходятся, что может быть связано не только с техническими особенностями используемых методов, но и со структурой анализируемых выборок. Следует подчеркнуть, что во всех упомянутых работах выборки включали относительно небольшую долю доброкачественных неопухолевых образований.
Результаты исследований последних лет показали, что при развитии разных опухолей ЩЖ существенно изменяется содержание целого ряда клеточных микро-РНК, в том числе миРНК-221. Эта микроРНК высоко консервативна для позвоночных и у ряда млекопитающих, включая человека, кодируется Х-хромосомой в тандеме с миРНК-222. Повышенная экспрессия миРНК-221 отмечена при ряде онкологических заболеваний [15]. К ее мишеням относится белок СБ117, рецептор одной из тирозинкиназ [16], а также регулятор клеточного цикла р27Юр1 [17]. Нарушения экспрессии миРНК-221 могут приводить к нарушениям клеточного цикла и дедифференцировке, а также способствовать клеточной миграции и аберрантному ан-гиогенезу. Таким образом, миРНК-221 является классической онкогенной микроРНК.
Повышение содержания миРНК-221 при развитии опухолей ЩЖ впервые продемонстрировано более
10 лет назад [18] и позже подтверждено в ряде работ. Большинство этих исследований касалось ПР ЩЖ. В то же время показано, что повышенный уровень миРНК-221 характерен и для ФР ЩЖ как обычных, так и В-клеточных [19]. Также было продемонстрировано, что ФА ЩЖ различаются по уровню экспрессии миРНК-221: в классических ФА он не изменен (как и в доброкачественных образованиях), а в В-клеточ-ных — повышен [19]. М. Бейшег и соавт. показали, что лишь для кластера миРНК-221/222 характерно выраженное увеличение содержания для разных типов рака ЩЖ, включая ПР и ФР [20]. Это позволило авторам предположить, что повышенная экспрессия любой из этих ми-кроРНК может рассматриваться как универсальный маркер злокачественности клеток ЩЖ. В то же время в работе В. ^Ь^аБ и соавт. было продемонстрировано, что повышение уровня миРНК-221 при ФР, в отличие от ПР, не ассоциировано с инвазией и метастазирова-нием и может являться ранним событием при трансформации фолликулярных клеток, происходящим уже на стадии доброкачественных новообразований [21].
Цель исследования — анализ экспрессии гена ИМОА2 и микроРНК миРНК-221 с помощью ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) в выборке из 713 цитологических препаратов, полученных на стадии дооперационного типирования узлов ЩЖ, соответствующих в дальнейшем разным цитологическим заключениям.
Материалы и методы
Клинический материал. В работе использовали 713 цитологических образцов, полученных в период с 2014 по 2016 г. при проведении стандартной тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии в Центре новых медицинских технологий (г. Новосибирск) и НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург). В соответствии с законодательством России цитологический материал от каждого пациента был получен при наличии информированного согласия на его использование, все данные были деперсонализированы. Образцы классифицированы в соответствии с системой Бетесда [22]: категория II по системе Бетес-да: доброкачественные образования (п = 375); категория IV по системе Бетесда: фолликулярная опухоль или подозрение на фолликулярную опухоль (п = 143); категория VI по системе Бетесда: медуллярный рак (п = 7), ПР (п = 186), анапластический рак (п = 2). Послеоперационные гистологические диагнозы для всех образцов нам не были доступны.
Выделение нуклеиновых кислот из цитологических препаратов и анализ содержания микроРНК выполняли, как описано ранее [23]. Нормировку уровня миРНК-221 проводили на содержание референсной миРНК-197 [24] по формуле: 2 (а 197 - а 221), где О — пороговый цикл реакции для соответствующей микроРНК.
Полуколичественная оценка содержания мРНК HMGA2. Ддя ОТ-ПЦР-РВ использовали специфические праймеры
и флуоресцентно меченные зонды для выявления мРНК гена HMGA2 и гена домашнего хозяйства PGK1 (фосфоглицераткиназа), применяемого в качестве нормализатора. Все праймеры и зонды были синтезированы в АО «Вектор-Бест» (Россия). Олигонуклеотиды выбирали с использованием онлайн-сервиса Primer-Quest (http://eu.idtdna.com/Primerquest/Home/Index/). Эффективность амплификации для каждой системы оценивали с помощью калибровочной кривой, построенной по разведениям очищенного препарата РНК, выделенной из операционного материала от пациента с ПР ЩЖ, в котором было выявлено высокое содержание мРНК HMGA2. Значение E для амплификации гена PGK1 составило ~100 %, для гена HMGA2 - ~99 %.
Последовательности олигонуклеотидов для детекции мРНК HMGA2:
HMGA2-F: 5'-TCCCTCTAAAGCAGCTCAAAA (прямой праймер);
HMGA2-R: 5'-ACTTGTTGTGGCCATTTCCT (обратный праймер);
HMGA2-P: 5'-(ROX)-CAGAAGCCAC (T-BHQ2) GGAGAAAAACGGCCAA-p (флуоресцентно меченный зонд).
Последовательности олигонуклеотидов для детекции мРНК PGK1:
PGK-F: 5'-GGAGAACCTCCGCTTTCAT (прямой праймер);
PGK-R: 5'-GCTGGCTCGGCTTTAAC (обратный праймер);
PGK-P: 5'-(ROX)-TTCCCAGAAGCA (T-BHQ2) CTT-TTCCCTTCCCTTCT-p (флуоресцентно меченный зонд).
Для проведения ОТ-ПЦР-РВ использовали термо-циклер CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) и лиофи-лизированные смеси Мастер-микс ОТ-ПЦР (АО «Век-тор-Бест», Россия). Температурный режим реакции: 45 °С — 30 мин, 94 °С — 2 мин, 50 циклов: денатурация при 94 °С — 10 с, отжиг и элонгация: 60 °С — 20 с. Концентрация праймеров в реакции — 0,5 мкМ, флуоресцентно меченного зонда — 0,25 мкМ.
Для оценки уровня экспрессии гена HMGA2 использовали нормировку на ген домашнего хозяйства PGK1. Расчеты уровня относительной экспрессии
производили по формуле: 2 (Ct PGK - Ct HMGA), где Ct — пороговый цикл реакции для соответствующей мРНК. Если для образца не было получено значений Ct для мРНК HMGA2, в то время как значения Ct для мРНК PGK1 находились в пределах стандартных значений для цитологических препаратов (Ct <36), экспрессию HMGA2 в этом образце считали недетек-тируемой. Образцы с низким содержанием мРНК PGK1 (Ct >36) исключали из анализа.
Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 9.1 (StatSoft Inc., США). Сравнение 2 независимых выборок по количественному признаку проводили с помощью критерия Манна— Уитни. Критический уровень значимости был принят равным 0,05. Для расчета диагностических характеристик применяли ROC-анализ.
Результаты
На рис. 1 представлены относительные уровни экспрессии гена HMGA2 в образцах с разными цитологическими диагнозами, на рис. 2 — медианные значения и диаграмма размаха.
Из рис. 1 и 2 видно, что для доброкачественных образований характерен относительно невысокий уровень экспрессии гена HMGA2 и миРНК-221 по сравнению с ПР. В образцах ПР содержание миРНК-221 в среднем было выше в 6 раз, чем в образцах доброкачественных образований, а HMGA2 — в 200 раз. Фолликулярные опухоли занимают промежуточное положение значений относительного уровня экспрессии гена HMGA2 и миРНК-221 по сравнению с другими группами. Статистическую значимость полученных различий определяли с помощью критерия Манна— Уитни, результаты представлены в табл. 1, из которой видно, что показанные нами различия в уровне экспрессии IIMGA2 и миРНК-221 между доброкачественными образованиями, с одной стороны, и ПР, с другой стороны, статистически значимы.
Кроме того, статистически значимые различия выявлены между доброкачественными образованиями и фолликулярными опухолями, с одной стороны, и фолликулярными опухолями и ПР — с другой.
CV
ев
и ш U
ж ш
и
8 7 6 5 4 3 2
О s 1 0
$ <ч ш V
S ф
у Q-
0 с
1 и
9
_ 8 -Q ¡^
in 7
ф I '
m it
OX 6
ао. ° ^ о
>s О- 5
5 S 4
о | 2
<5 й 1
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOQ=Q=Q=Q=Q=Q=Q=Q= ЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧ:4:000000 с 1= 1= 1= 1= 1= 1= 1=
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOQ=Q=Q=Q=Q=Q=Q=Q= ЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДЧДОеееее с 1= 1= 1= 1= 1= 1= 1=
Рис. 1. Все значения относительных уровней экспрессии гена НМОА2 и микроРНК-221 в порядке возрастания в цитологических образцах. ДО — доброкачественные образования (п = 375); ФО — фолликулярные опухоли (п = 143); ПР — папиллярный рак (п = 186)
9
3
см
ев
и ш и
х ш
и
С
О
ср
_ ИМвЛ2 Выбросы
а микроРНК-221 Выбросы
о
-Т-
В
. А
О
АР
ДО
МР ПР
Диагноз
ФО
Рис. 2. Диаграмма размаха относительных уровней экспрессии гена НМ0Л2 и микроРНК-221 в цитологических образцах. Средняя линия обозначает медиану, «ящик» — интерквартильный размах, «усы» — минимальные и максимальные значения без выбросов; выбросы обозначены кружками. АР — анапластический рак; ДО — доброкачественные образования; МР — медуллярный рак; ПР — папиллярный рак; ФО — фолликулярные опухоли
Для оценки диагностических характеристик уровня экспрессии НМ0Л2 и миРНК-221 как диагностических маркеров, позволяющих дифференцировать доброкачественные неопухолевые образования и злокачественные опухоли, с использованием ЯОС-анализа, мы взяли 2 гомогенные в отношении признака доброкачественности/злокачественности группы образцов: доброкачественные образования и ПР. Результаты анализа приведены в табл. 2. Очевидно, что деление по уровню экспрессии НМОЛ2 обладает более высокими диагностическими характеристиками, чем по уровню экспрессии миРНК-221, что, возможно, связано с большим размахом значений уровня экспрессии НМОЛ2.
При использовании отсечки значения относительного уровня экспрессии НМОЛ2, равной 0,2, достигается максимальная (100 %) специфичность определения
образцов с ПР, чувствительность при этом составляет 79 %. Если применить эту отсечку к фолликулярным опухолям, то 24,5 % таких образцов попадают в группу с уровнем экспрессии НМОЛ2 >0,2, который рассматривается нами как повышенный и в которую не попадает ни одно доброкачественное образование (рис. 3).
Разница в уровне экспрессии гена НМОЛ2 между группами фолликулярных опухолей с его повышенным и «нормальным» содержанием достигает 85 раз, а разница в уровне экспрессии миРНК-221 между этими группами составляет в среднем 3 раза (рис. 4). При этом в существенной части (23 %) образцов фолликулярных опухолей с низким содержанием мРНК НМОЛ2, а также в небольшой части образцов доброкачественных образований уровень миРНК-221 был повышен. Обратная ситуация (уровень миРНК-221 низкий, а уровень ЫМОЛ2 повышен) оказалась нехарактерной для нашей выборки.
□ Доброкачественные образования
□ Фолликулярные опухоли □ Папиллярный рак
,120
0-0,2 >0,2 Относительный уровень экспрессии гена НМ6Л2
Рис. 3. Распределение образцов опухолей и образований щитовидной железы с разными цитологическими диагнозами по уровням экспрессии гена НМОЛ2 (повышен/не повышен)
Таблица 1. Попарное сравнение разных групп опухолей щитовидной железы по уровню экспрессии гена НМОЛ2 и микроРНК-221 и значимость различий
Группа, количество образцов Ме (01-03) НМОА2 Ме (01-03) микроРНК-221
1-я 2-я 1-я группа 2-я группа Р 1-я группа 2-я группа Р
ДО, 375 АР, 2 0,003 (0-0,016) 1,011 (0,36-1,66) 0,014 0,226 (0,171-0,328) 2,457 (0,789-4,130) 0,018
ДО, 375 МР, 7 0,003 (0-0,016) 0 (0-0,012) 0,310 0,226 (0,171-0,328) 0,426 (0,3-0,509) 0,010
ДО, 375 ПР, 186 0,003 (0-0,016) 0,67 (0,24-1,55) 0 0,226 (0,171-0,328) 1,374 (0,624-2,570) 0
ДО, 375 ФО, 143 0,003 (0-0,016) 0,03 (0,0005-0,19) 5 х 10-11 0,226 (0,171-0,328) 0,303 (0,212-0,650) 1 х 10-6
ФО, 143 ПР, 186 0,03 (0,0005-0,19) 0,67 (0,24-1,55) 2 х 10-23 0,303 (0,212-0,650) 1,374 (0,624-2,570) 3 X 10-22
Примечание. Ме (й1—й3) — медиана (межквартильный размах), жирным шрифтом выделены значимые различия. ДО — доброкачественные образования; АР — анапластический рак; МР — медуллярный рак; ПР — папиллярный рак; ФО — фолликулярные опухоли.
Таблица 2. КОС-анализ и диагностические характеристики уровня экспрессии гена НМ0Л2 и микроРНК-221 при дифференцировании доброкачественных опухолей и папиллярного рака
■
СМ
ев
Характеристика
НМОЛ2
микроРНК-221
Площадь под ЯОС-кривой, %
95 % доверительный интервал Отсечка
Специфичность, % Чувствительность, % ПЦПР, % ПЦОР, %
94,6
1,6 X 10-66
92,1-97,2
0,0944 97,9
86.5 95,3
93.6
0,1962 100 79,0 100 90,6
92,7 6,3 х 10-61 90,1-95,2
0,4583
89.3
84.4 79,7 92,0
1,3698 100 50,5 100 80,3
Примечание. Р1 — нулевая гипотеза (действительная площадь 0,5); ПЦПР — предсказательная ценность положительного результата; ПЦОР — предсказательная ценность отрицательного результата.
И
ш и
н е в
о р
у
-1
- ИМвЛ2
Выбросы Е микроРНК-221 Выбросы
4 ^
4 ё У 0
г
ДО
ФО1 ФО2
Диагноз
ПР
Рис. 4. Диаграмма размаха относительных уровней экспрессии гена НМОЛ2 и микроРНК-221 в цитологических образцах доброкачественных образований, фолликулярных опухолей и папиллярного рака. Средняя линия обозначает медиану, «ящик» — интерквартильный размах, «усы» — минимальные и максимальные значения без выбросов; выбросы обозначены кружками. ДО — доброкачественные образования; ФО1 — фолликулярные опухоли с пониженным содержанием мРНК НМОЛ2; ФО2 — фолликулярные опухоли с повышенным содержанием мРНК НМОЛ2; ПР — папиллярный рак
Обсуждение
Несмотря на то, что роль повышения экспрессии гена НМОЛ2 в развитии разнообразных злокачественных опухолей эпителиального происхождения хорошо известна и исследована, попытки использования уровня экспрессии НМОЛ2 в качестве маркера злокачественных процессов в ЩЖ приводят к неоднозначным результатам. С одной стороны, выявление белков ЫМОЛ2 с помощью иммуногистохимии [25, 26] либо экспрессии гена НМОЛ2 с помощью ОТ-ПЦР [10-12, 25] в ряде работ позволило достоверно дифференцировать злокачественные и доброкачественные опухоли. С другой стороны, есть работы, в которых утверждается, что повышенная экспрессия гена НМОЛ2 не является надежным диагностическим маркером [13, 14].
Несовпадение результатов разных работ может быть вызвано как применяемыми техниками анализа, так и различиями в составе проанализированных выборок и вкладом человеческого фактора (поскольку в качестве референсного метода используется гистологическое заключение, надежность которого существенно зависит от квалификации исполнителя).
Мы провели оценку возможности анализа экспрессии гена НМОЛ2 в качестве способа дифференцирования злокачественных и доброкачественных опухолей и неопухолевых образований ЩЖ, используя собственные реактивы и наборы олигонуклеотидов для ОТ-ПЦР. Наши результаты, в целом близкие к результатам работ [11] и [12], указывают на то, что повышение уровня экспрессии НМОЛ2 может быть характерно для карцином, происходящих из фолликулярных клеток ЩЖ, как высоко-, так и низкодифференцированных. Лишь в 1 из 7 медуллярных карцином, происходящих из парафолликулярных нейроэндокринных клеток (С-клеток), был зарегистрирован высокий уровень экспрессии НМОЛ2. В обеих анапластических (низкодиф-ференцированных) карциномах уровень экспрессии НМОЛ2 оказался значительно повышен. Это согласуется с данными других исследователей. Так, в работах [12, 25] обнаружено, что уровень экспрессии НМОЛ2 был повышен во всех исследованных образцах анапла-стической карциномы.
ПР является самым распространенным типом рака ЩЖ, поэтому в нашей работе он также был представлен наибольшим количеством образцов. Для данной группы образцов уровень экспрессии гена НМОЛ2 оказался повышен по сравнению с доброкачественными образованиями в среднем в 200 раз, что хорошо согласуется с результатами работы [10]. Повышенная экспрессия НМОЛ2 выявлена нами в 86 % образцов ПР. Увеличение экспрессии НМОЛ2 при ПР по сравнению с доброкачественными образованиями ЩЖ показано в ряде работ, хотя доля образцов ПР с повышенным
X ш
и
9
8
7
6
5
4
3
2
0
CV
ев
и ш u
ж ш
и
уровнем экспрессии этого гена в разных работах различается: 92 % [25], 77 % [11], а в работе [12] при классическом варианте ПР — 97 %, при фолликулярном варианте — 75 %, в среднем — 86 %. Эти различия можно объяснить особенностями проанализированных выборок, используемыми техниками анализа экспрессии ИМОА2, а также выбранными значениями уровня экспрессии этого гена, рассматриваемыми как «повышенный».
Особенностью нашей выборки по сравнению с другими известными нам работами на эту тему является высокая доля доброкачественных неопухолевых образований. В реальном потоке образцов тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии, направляемых на цитологический анализ, именно доброкачественные образования (категория II по системе Бетесда) составляет подавляющее большинство. Поэтому оценка реальной предсказательной ценности молекулярного маркера (в нашем случае — уровня экспрессии гена ИМОА2), на наш взгляд, не может быть корректной без анализа достаточной выборки доброкачественных образований. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют, что уровень экспрессии ИМОА2 не превышает определенной величины в группе, относящейся ко II категории по системе Бетесда. Таким образом, выявление повышенного содержания этой мРНК обладает высокой (100 %) положительной предсказательной ценностью в отношении злокачественных опухолей (кроме ФР). Отрицательная предсказательная ценность такого анализа в отношении выявления злокачественных опухолей несколько ниже (89,3 %), поскольку для ряда случаев ПР, а также для большинства медуллярных раков повышение уровня мРНК ИМОА2 не выявлено.
В рамках проведенного исследования мы не могли оценить напрямую достоверные различия уровня экспрессии ИМОА2 между ФР (злокачественными опухолями) и ФА (доброкачественными опухолями), поскольку анализировали препараты, для которых было известно только цитологическое заключение, не позволяющее дифференцировать ФР и ФА. Таким образом, можно было предположить, что в отношении злокачественности группа фолликулярных опухолей является гетерогенной. И действительно, нами была выявлена очевидная неоднородность этой группы в отношении содержания как мРНК ИМОА2, так и миРНК-221. При этом опухоли с повышенным содержанием мРНК ИМ6А2, как и ПР, характеризовались достоверно (р = 0,0001) повышенным уровнем экспрессии миРНК-221. Количественное соотношение 2 подгрупп образцов фолликулярных опухолей, отличающихся по уровню экспрес-
сии ИМОА2 (в 26 % таких образцов этот уровень был повышен, в 74 % повышение не наблюдалось, см. рис. 3), также соответствует известному из литературы соотношению доброкачественных и злокачественных опухолей, выявляемых среди образцов с цитологическим диагнозом, соответствующим IV категории по системе Бетесда. Согласно системе Бетесда [22] риск злокачественности для этой категории составляет 15—30 %.
Исходя из полученных результатов, у нас есть основания предполагать, что выявленная неоднородность экспрессии мРНК ИМОА2 и миРНК-221 в цитологических препаратах отражает гетерогенность выборки образцов фолликулярных опухолей: часть из них, с повышенным уровнем мРНК ИМОА2, представлена преимущественно или исключительно злокачественными опухолями, а другая часть — доброкачественными (ФА). При этом уровень экспрессии миРНК-221 оказался повышен также и в некоторых образцах фолликулярных опухолей, для которых не обнаружено повышение экспрессии ИМ6А2. Доля таких образцов составила 23 %. Согласно данным литературы уровень миРНК-221 может быть повышен и в некоторых фолликулярных опухолях, не рассматриваемых как злокачественные [19]. В связи с этим диагностическая ценность этого маркера для выявления злокачественных опухолей ниже, чем ценность мРНК ИМОА2.
Заключение
Таким образом, нами показано, что содержание мРНК онкогена ИМОА2 и онкогенной миРНК-221 достоверно отличается между ПР ЩЖ и доброкачественными образованиями (II категория по системе Бетесда), а также существенно варьирует в гетерогенной группе образцов, объединенных цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль или подозрение на фолликулярную опухоль». При этом в одних фолликулярных опухолях содержание этих маркеров повышено в той же степени, что при ПР, а в других является относительно низким, что сближает их с доброкачественными образованиями. При этом для опухолей с повышенным содержанием мРНК ИМОА2 характерен также повышенный уровень экспрессии миРНК-221. Указанные различия могут быть выявлены на стадии дооперационного типирования узловых новообразований ЩЖ с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Это позволяет рассматривать мРНК ИМОА2 и, в меньшей степени, миРНК-221 как перспективные молекулярные маркеры, оценка содержания которых может способствовать повышению точности типирования новообразований ЩЖ на дооперационной стадии.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке фундаментальных научных исследований по темам 0310-2014-0002; 0310-2015-0003; 0310-2015-0007.
Financing. The study was conducted with financial support for basic scientific research under the projects 0310-2014-0002; 0310-2015-0003;0310-2015-0007.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Ghossein R. Problems and controversies in the histopathology of thyroid carcinomas of follicular cell origin. Arch Pathol Lab Med 2009;133(5):683-91.
2. Baloch Z.W., Sack M.J., Yu G.H. et al. Fine-needle aspiration of thyroid: an institutional experience. Thyroid 1998;8(7):565-9.
3. Pallante P., Sepe R., Puca F., Fusco A. High mobility group a proteins as tumor markers. Front Med (Lausanne) 2015;2:15.
4. Cleynen I., Van de Ven W.J. The HMGA proteins: a myriad of functions (Review). Int J Oncol 2008;32(2):289-305.
5. Wang X., Liu X., Li A.Y. et al. Overexpression of HMGA2 promotes metastasis and impacts survival
of colorectal cancers. Clin Cancer Res 2011;17(8):2570-80.
6. Ding X., Wang Y., Ma X. et al. Expression of HMGA2 in bladder cancer and its association with epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Prolif 2014;47(2):146-51.
7. Chiappetta G., Tallini G., De Biasio M.C. et al. Detection of high mobility group I HMGI(Y) protein in the diagnosis
of thyroid tumors: HMGI(Y) expression represents a potential diagnostic indicator of carcinoma. Cancer Res 1998;58(18):4193-8.
8. Raskin L., Fullen D.R., Giordano T.J. et al. Transcriptome profiling identifies HMGA2 as a biomarker of melanoma progression and prognosis. J Invest Dermatol 2013;133(11):2585-92.
9. Malek A., Bakhidze E., Noske A. et al. HMGA2 gene is a promising target for ovarian cancer silencing therapy. Int J Cancer 2008;123(2):348-56.
10. Belge G., Meyer A., Klemke M. et al. Up-regulation of HMGA2 in thyroid carcinomas: a novel molecular marker to distinguish between benign and malignant follicular neoplasias. Genes Chromosomes Cancer 2008;47(1):56-63.
11. Lappinga P.J., Kip N.S., Jin L. et al. HMGA2 gene expression analysis performed on cytologic smears to distinguish benign from malignant thyroid nodules. Cancer Cytopathol 2010;118(5):287-97.
12. Jin L., Lloyd R.V., Nassar A. et al. HMGA2 expression analysis in cytological and paraffin-embedded tissue specimens of thyroid tumors by relative quantitative RT-PCR. Diagn Mol Pathol 2011;20(2):71-80.
13. Nagar S., Ahmed S., Peeples C. et al. Evaluation of genetic biomarkers
for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms. Am J Surg 2014;207(4):596-601.
14. Берёзкина И. С., Саприна Т. В.,
Зима А. П. и др. Исследование галекти-на-3, Ki-67, убиквитина, HMGA2 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в пункци-онном материале при узловом зобе. Клиническая и экспериментальная ти-реоидология 2016;12(2):19—27. [Berezkina I.S., Saprina T.V., Zima A.P. et al. The study of galectin-3, Ki-67, ubiquitin, HMGA-2 by polymerase chain reaction in real time (RT-PCR) in the puncture specimens of nodular goiter. Klinicheskaya i eksperimental'naya tireoidologiya = Clinical and Experimental Thyroidology 2016;12(2):19-27. (In Russ.)].
15. Garofalo M., Quintavalle C., Romano G. et al. miR221/222 in cancer: their role
in tumor progression and response to therapy. Curr Mol Med 2012;12(1):27-33.
16. Urbich C., Kuehbacher A., Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases, inflammation, and angiogenesis. Cardiovascular Res 2008;79(4):581-8.
17. Galardi S., Mercatelli N., Giorda E. et al. miR-221 and miR-222 expression affects the proliferation potential of human prostate carcinoma cell lines by targeting p27kip1. J Biol Chem 2007;282(32):23716-24.
18. He H., Jazdzewski K., Li W. et al. The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(52):19075-80.
19. Nikiforova M.N., Tseng G.C., Steward D. et al. MicroRNA expression profiling
of thyroid tumors: biological significance and diagnostic utility. J Clin Endocrinol Metab 2008;93(5):1600-8.
20. Dettmer M., Vogetseder A., Durso M.B. et al. MicroRNA expression array identifies novel diagnostic markers for conventional and oncocytic follicular thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2013;98(1):E1-7.
21. Wojtas B., Ferraz C., Stokowy T. et al. Differential miRNA expression defines migration and reduced apoptosis in follicular thyroid carcinomas. Mol Cell Endocrinol 2014;388(1-2):1-9.
22. Cibas E.S., Ali S.Z. The Bethesda system for reporting thyroid cytopathology.
Am J Clin Pathol 2009;132(5):658-65.
23. Titov S.E., Ivanov M.K., Karpinskaya E.V. et al. miRNA profiling, detection
of BRAF V600E mutation and RET-PTC1 translocation in patients from Novosibirsk oblast (Russia) with different types of thyroid tumors. BMC Cancer 2016;16:201.
24. Titov S.E., Demenkov P.S., Ivanov M.K. et al. Selection and validation of miRNAs as normalizers for profiling expression
of microRNAs isolated from thyroid fine needle aspiration smears. Oncol Rep 2016;36(5):2501-10.
25. Chiappetta G., Ferraro A., Vuttariello E. et al. HMGA2 mRNA expression correlates with the malignant phenotype in human thyroid neoplasias. Eur J Cancer 2008;44(7):1015-21.
26. Jang M.H., Jung K.C., Min H.S. The diagnostic usefulness of HMGA2, Survivin, CEACAM6, and SFN/14-3-3 8 in follicu-lar thyroid carcinoma. J Pathol Transl Med 2015;49(2):112-7.
cv
ев
и ш u
X ш
и
Статья поступила: 30.10.2017. Принята в печать: 09.11.2017. Article received: 30.10.2017. Accepted for publication: 09.11.2017.
