Значение выявления мутации гена BRAF в дооперационной диагностике рака щитовидной железы Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ч СПбГМУ

© Коллектив авторов, 2009 г. УДК 616.441-07:575.224

М. И. Зарайский, Д. Ю. Семенов, М. Е. Борискова, И. Ю. Сабурова, П. А. Панкова, Н. С. Фещенко, В. Г. Чаусова, У. В. Фарафонова, О. А. Пестерова

ЗНАЧЕНИЕ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ ГЕНА BRAF В ДООПЕ-РАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, кафедра общей хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова

Узловые образования щитовидной железы (У ОЩЖ) обнаруживают у 5-70 % населения [1, 2]. Актуальность проблемы дифференциальной диагностики УОЩЖ заключается в том, что, по некоторым данным, от 10 до 22 % солитар-ных узлов щитовидной железы являются злокачественными, а почти в 90 % случаев рак щитовидной железы на ранних стадиях развивается под маской узлового зоба [3].

Традиционно для дифференциальной диагностики УОЩЖ используется тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием биоптата. Однако цитологический метод имеет ряд ограничений, а именно - получение при ТАБ неинформативных и неопределенных результатов. Неопределенные результаты ТАБ составляют около 30 % [10, 12] и связаны с отсутствием точных цитологических критериев для дифференциальной диагностики ряда доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ). Невозможность на дооперационном этапе имеющимися методами исключить опухолевую природу узла ЩЖ является показанием к выполнению диагностической операции. При хирургическом вмешательстве лишь в 15-20 % неопределенных результатов цитологического исследования выявляется злокачественный процесс [5]. На сегодняшний день окончательный диагноз может быть установлен только в результате гистологического исследования.

Поиск новых методов дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ является одной из актуальных проблем современной тироидоло-гии, что позволило бы улучшить диагностику рака ЩЖ и сократить количество диагностических операций. Исследование событий молекулярного уровня занимает ведущее место в определении патогенеза различных форм рака ЩЖ и, соответственно, может быть применено и в диагностических целях.

Целью настоящей работы являлось выявление значимости наличия мутации У600Е в гене БИЛЕ в дооперационной диагностике рака ЩЖ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика групп пациентов. В исследование были включены 30 пациентов, обследованных на базе кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины и оперированных на кафедре общей хирургии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова в период с 2007 по 2008 гг. Средний возраст пациентов составил 49 ± 8,5 года; соотношение мужчин и женщин - 1:9,7 соответственно. Всем пациентам было выполнено стандартное клиническое и ультразвуковое обследования. У 65 % пациентов узлы ЩЖ были выявлены впервые, 35 % пациентов наблюдались у эндокринолога по поводу доброкачественных заболеваний щитовидной железы, у 10 % из них в анамнезе имелись оперативные вмешательства на ЩЖ по поводу доброкачественных заболеваний в объеме гемитироидэктомия с истмусэктомией.

Всем пациентам до операции контролем УЗИ была выполнена ТАБ с последующим цитологическим исследованием аспирата в цитологической лаборатории ЦЛД СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (табл. 1). На основании цитологического диагноза пациенты были разделены на три группы:

1) пациенты с коллоидным зобом;

2) пациенты с папиллярным раком;

3) пациенты, у которых на основании цитологического заключения нельзя было исключить злокачественную природу узла. Окончательная верификация диагноза проводилась по данным послеоперационного гистологического исследования.

Выявлениемутации V600E гена BRAF. Геномная ДНК выделялась из пункционного материала с помощью набора «ДНК-ГС» («ДНК-Технология», Россия).

Амплификация проводилась на приборе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по стандартной двухпрай-мерной схеме в конечном объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл ДНК, 14 рМол каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации 240 мкМол и 2,5 единиц термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Helicon, Россия) в стандартном ПЦР буфере с содержанием 15 мМол Mg2+. Последовательности используемых праймеров: обратный праймер (общий для дикого и му-тантного аллелей гена BRAF) «RP-BRAF» 5'-GGCCAA AATTTAATCAGTGGA-3' и 2-а прямых праймера: «FW-BRAF» 5-TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3' для «дикого» типа и «FM-BRAF» 5-GGTGATTTTGGTCTAGCT ACAAA-3' для мутантного типа гена [15]. Программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 оС, 3 мин), 40 циклов, включавших денатурацию (94 оС, 20 с), отжиг праймеров (61 оС, 30 с), элонгацию

Таблица 1

Распределение пациентов по группам в зависимости от цитологического диагноза

Количество пациентов Результат ТАБ

9 Доброкачественый (УКЗ)

12 Злокачественный (ПР)

9 Неопределенный (ФО)

Электрофореграмма продуктов амплификации: дорожки 1, 2, 3, 4 - «дикий» и мутантный тип гена BRAF. У всех 4 пациентов (I-IV) присутствует дикий тип гена BRAF; дорожки 5, 6, 7, 8 -мутантный тип гена BRAF. Пациенты II и IV - положительные по мутации в гене BRAF, пациенты I и III - отрицательные по мутации в гене BRAF

Таблица 2

Результаты планового гистологического исследования у больных контрольной и исследуемой групп

Цитологическое заключение Количество пациентов Окончательный гистологический диагноз Количество пациентов

Узловой коллоидный зоб 9 Узловой коллоидный зоб 9

Папиллярный рак 12 Папиллярный рак 12

Фолликулярная опухоль 9 Фолликулярная аденома 8

Фолликулярный рак 1

Всего 30 Узловой коллоидный зоб 9

Фолликулярная аденома 8

Папиллярный рак 12

Фолликулярный рак 1

(72 0С, 40 с), и заключительной элонгации (72 0С, 8 мин). Визуализация ПЦР продукта проводилась на трансиллюминаторе (254 нм) после электрофореза в 2 % агарозном геле.

Каждая проба оценивалась по наличию электрофоре-тического сигнала в двух дорожках: дорожка № 1 (амплификация с праймерами для «дикого» и мутантного типов гена БИЛЕ) и дорожка № 2 (амплификация с праймерами только для мутантного типа гена БЯЛЕ). Наличие электро-форетического сигнала в дорожке № 1 являлось контролем метода. Наличие сигнала в дорожке № 2 свидетельствовало о наличии данной мутации в исследуемом образце (рисунок).

Результаты выявления мутации У600Е гена БЯЛБ в материале аспирационных биоптатов и сопоставление

Выявление мутации гена BRAFV600E

Цитологическое заключение Количество пациентов Окончательный гистологический диагноз Количество пациентов BRAF мутация есть BRAF мутации

Узловой коллоидный зоб 9 Узловой коллоидный зоб 9 0 9

Папиллярный рак 12 Папиллярный рак 12 10 2

Фолликулярная 9 Фолликулярная аденома 8 0 8

опухоль Фолликулярный рак 1 1 0

Всего 30 11 19

с диагнозами, сделанными по данным морфологического исследования на послеоперационном материале, были оценены по следующим критериям [13]: предсказательная ценность положительного теста; чувствительность теста; предсказательная ценность отрицательного теста; специфичность теста.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Всем прооперированным больным было выполнено гистологическое исследование операционного материала, по результатам которого проведен сравнительный анализ данных цитологического и гистологического исследований. У всех пациентов с заведомо доброкачественными заболеваниями ЩЖ (9 человек) дооперационный цитологический диагноз узловой коллоидный зоб был подтвержден при гистологическом исследовании. Цитологический диагноз папиллярный рак был подтвержден в 100 % случаев при гистологическом исследовании у пациентов исследуемой группы. Интересным оказалось распределение гистологически верифицированных диагнозов в группе пациентов с неопределенным диагнозом по данным ТАБ. У восьми пациентов диагностирована фолликулярная аденома, у одного - фолликулярный рак (табл. 2).

В работах ряда зарубежным исследователей описывается мутация У600Е в 15 экзоне гена БЯЛР (БЯЛРУ600Е) как наиболее часто встречающаяся при папиллярном раке ЩЖ [9]. Наличие данной мутации ведет к повышению митотической и пролиферативной активности клеток железы.

При исследовании гистологического материала от больных, прооперированных по поводу рака ЩЖ, наличие БЯЛРУ600Е мутации определялось с частотой 3869 % [4, 8, 10, 12]. Ряд авторов связывают наличие данной мутации в опухоли с большей агрессивностью процесса (наличие регионарных метастазов, развитие рецидива в течении 6 лет) [8]. Также в последнее время появился ряд исследований с длительным отдаленным наблюдением пациентов (до 15-20 лет), в таких исследованиях была выявлена положительная корреляция между наличием БЯЛРУ600Е мутации и более неблагоприятным прогнозом течения заболевания [6]. По данным авторов, эта мутация также ассоциирована с большей частотой экст-ратироидной инвазии, поражением регионарных лимфоузлов и наличием отдаленных метастазов [8, 11]. Авторы этих исследовании делают вывод о необходимости более длительного (более 5 лет) и тщательного наблюдения пациентов, у которых выявлена БЯЛРУ600Е мутация [14].

Однако существуют и другие исследования, авторы которых не выявляют статистически значимой корреляции между этой мутацией и агрессивностью течения процесса [12]. Небольшое количество работ опровергают наличие связи между БЯЛРУ600Е мутацией и прогнозом [4, 7].

Таблица 3

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

V*/

ч СПбГМУ ..

Ряд статей посвящены исследованию возможности определения BRAFV600E мутации в материале ТАБ при неясном либо неинформативном заключении цитологического исследования. До операции правильный диагноз удавалось поставить 76 % пациентов. Чувствительность определения данной мутации в материале ТАБ составила 83 %, а специфичность - 96 % [10].

В ходе исследования нами были получены следующие результаты (табл. 3). В группе пациентов с цитологическим диагнозом «коллоидный зоб», который был позже подтвержден гистологически, мутантный тип гена BRAF не был выявлен ни в одном случае. В группе пациентов с бесспорным диагнозом «папиллярный рак» (по результатам цитологического и гистологического исследований) мутантный тип гена BRAF определялся в 10 из 12 образцов (83,3 %). Большой интерес представляет третья группа, в которую вошли пациенты с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль». По данным гистологической оценки препаратов, у 8 пациентов был поставлен окончательный диагноз «фолликулярная аденома» и у 1 -«фолликулярный рак». Мутантный тип гена BRAF не определялся ни в одном из образцов, взятых у пациентов с фолликулярной аденомой, однако в образце, взятом у пациента с фолликулярным раком, был обнаружен мутантный тип гена BRAF.

Таким образом, данное исследование позволяет у ряда пациентов ставить показания к оперативному вмешательству по поводу рака ЩЖ с соответствующим объемом оперативного вмешательства. Отсутствие данной мутации позволяет ограничить показания к оперативному вмешательству с диагностической целью.

Критерии достоверности предложенной методики представлены в табл. 4. Так, чувствительность метода исследования составила 85 %, специфичность - 100 % и диагностическая ценность - 93 %. Наличие в образцах мутантного типа гена BRAF с вероятностью 100 % свидетельствует о злокачественности процесса, а отсутствие данной мутации характерно для доброкачественных заболеваний.

Таким образом, наличие мутации V600E гена BRAF является диагностическим маркером высокодифферен-цированного рака ЩЖ и может быть использовано в качестве дополнительного метода дооперационной диагностики.

ЛИТЕРАТУРА

1. Валдина, Е. А. Заболевания щитовидной железы : Руководство / Е. А. Валдина. - 3-е изд. - СПб. : Питер, 2006. - 368 с.

2. Гринева, Е. Н. Узловые образования щитовидной железы. Диагностика и врачебная тактика / Е. Н. Гринева // Проблемы эндокринологии. - 2003. - Т. 49. - № 6. - С. 59-62.

3. Пачес, А. И. Рак щитовидной железы / А. И. Пачес. - М. : Москва, 1995. - 375 с.

4. Brzezianska, E. Investigation of V600E BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma in the Polish population / Е. Brzezianska [et al] // Neuro Endocrinol Lett. - 2007. - № 28 (4). - Р. 351-359.

5. Cibas, E. S. Cytology. Diagnos principles and clinical correlates. WB Sunders company. A division of Harcourt Brace Company / E. S. Cibas

Таблица 4

Критерии достоверности метода выявления мутации V600E гена BRAF у пациентов с подозрением на рак щитовидной железы

Параметр BRAF-мутация ( %)

Предсказательная ценность положительного теста 100

Чувствительность теста 85

Предсказательная ценность отрицательного теста 9O

Специфичность теста lOO

Диагностическая точность метода 93

[et al]. - Philadelphia ; London ; Toronto ; Montreal ; Sydney ; Tokyo, 1996. - P. 217-242.

6. David, V. Prognostic significance of BRAF mutation in patients affected by papillary thyroid carcinoma with a follow up of 20 years / V. David [et al] // J. Clin. Endocrinology. - 2007. - № 75 (4). -P. 325-334.

7. Fugazzola, L. Correlation between B-RAFV600E mutation and clinic-pathologic parameters in papillary thyroid carcinoma : data from a multicentric Italy study and review of the literature / L. Fugazzola [et al] // Endocr Relat Cancer. - 2006. - № 13 (2). - P. 455-464.

8. Kebebew, E. The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer / E. Kebebew [et al] // Ann. Surg. - 2007. -№ 246 (3). - P. 466-470.

9. Kimura, E. T. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer : genetic evidence for constitutive activation of the RET/ PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma / E. T. Kimura [et al] // Cancer Res. - 2003. - № 63. - P. 1454-1457.

10. Ki-wook, C. Detection of BRAFV600E mutation on fine needle aspiration specimens of thyroid nodule cytopathology diagnosis, especially in BRAFV600E mutation-prevalent area / C. Ki-wook [et al] // Clin Endocrinol (Oxf). - 2006. - № 65 (5). - P. 660-666.

11. Lee, J. H. Clinicopathologic significance of BRAF V600V mutation in papillary carcinomas of the thyroid : a meta-analysis / J. H. Lee // Americn Cancer Society. - 2007.

12. Leslie, R. R. Utility of BRAF V600E mutation detection in cytologically indeterminate thyroid nodules / R. R. Leslie [et al] // CytoJournal. - 2006. - № 3. - P. 10.

13. Linn, S. A new conceptual approach to teaching the interpretation of clinical tests / S. Linn // Journal of Statistics Education. -2004. - Vol. 12. - № 3.

14. Ugolini, C. Presence of BRAF V600E in very early stages of papillary thyroid carcinoma / C. Ugolini [et al] // Thyroid. - 2007. -Vol. 17. - № 5. - P. 381-388.

15. Xiulong, X. High Prevalence of BRAF Gene Mutation in Papillary Thyroid Carcinomas and Thyroid Tumor Cell Lines / X. Xiulong // Cancer Research. - 2003. - № 63. - P. 4561-4567.

РЕЗЮМЕ

М. И. Зарайский, Д. Ю. Семенов, М. Е. Борискова, И. Ю. Сабурова, П. А. Панкова, Н. С. Фещенко, В. Г. Чаусова, У. В. Фарафонова, О. А. Пестерова

Значение выявления мутации гена BRAF в дооперацион-ной диагностике рака щитовидной железы

Вопрос дооперационной диагностики рака щитовидной железы (РЩЖ) в настоящее время остается актуальным в связи со сложностями цитологической интерпретации ТАБ. Цель - исследование диагностической значимости выявления мутации BRAFV600F в дооперационной диагностике РЩЖ. В исследование были включены 30 пациентов, наблюдавшихся в клинике общей хирургии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, у которых нельзя было исключить на дооперационном этапе РЩЖ. ДНК выделялась сорбент-ным методом из ткани ЩЖ, взятой методом ТАБ. Выявление мута-

ции гена BRAF проводилось c помощью ПЦР с праймерами, характерными для «дикого» и мутантного типа гена. У 10 пациентов из 12 с гистологически подтвержденным папиллярным РЩЖ и у 1 пациента с фолликулярным раком была выявлена мутация BRAFV600F. У восьми пациентов с гистологически верифицированными доброкачественными заболеваниями ЩЖ данная мутация не определялась. Встречаемость BRAF мутации у пациентов папиллярным РЩЖ составила 83,3 %. Исследование мутации BRAFV600F может использоваться в дооперационной диагностике РЩЖ.

Ключевые слова: мутация BRAFV600F, диагноз, рак щитовидной железы.

SUMMARY

M. I. Zarayskiy, D. Yu. Semenov, M. T. Boriskova, I. Yu. Saburova, P. A. Pankova, N. S. Feshcenko, V. G. Chausova, U. V. Farafonova, O. P. Pesterova Detection of BRAFV600E gene mutation in preoperative thyroid cancer diagnostics

Preoperative thyroid cancer (PTC) diagnostics still remains an essential problem because up to 30 % of the fine needle aspiration biopsies (FNABs) of thyroid nodules are diagnosed as «indeterminate». The aim of the work was to evaluate the role of preoperative detection of BRAFV600F mutation in the FNAB specimens. We studied 30 aspirates taken by FNA from patients with thyroid gland nodes. DNAs were extracted by a sorbent method. BRAFV600F mutation was analyzed with primers specific for wild and mutant gene type by RT-PCR. All patients were divided into three groups according to cytological conclusions: colloid nodules (n=9), PTC (n=12), and suspicious for malignancy (n=9). In the group of patients with PTC the diagnosis was confirmed by histology, and BRAFV600F mutation was detected in 10 (83 %) FNAB specimens. In the group with suspicious cytological diagnosis only one patient had follicular cancer by histology and positive BRAFV600F mutation. There were no false positive BRAFV600F mutations in our study. Thereby, we received the following criteria of validity of the method: sensitivity - 85 %, specificity - 100 %, diagnostic accuracy - 93 %. Our findings suggest that BRAFV600F mutation analysis may be a useful adjunct marker for preoperative diagnosis of thyroid gland cancer.

Key words: BRAFV600F mutation, diagnosis, thyroid cancer.

© 3. Г. Тадтаева, А. А. Скоромец, Ю. Л. Кацадзе, 2009 г. УДК 616.857-053.32-008.841.5]: 575

З. Г. Тадтаева, А. А. Скоромец, Ю. Л. Кацадзе

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПРИ МИГРЕНИ С АУРОЙ У ДЕТЕЙ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, РосНИИ гематологии и трансфузиологии, Детская городская больница № 22, Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

Головная боль продолжает оставаться одной из наиболее частых жалоб при обращении к врачу, что обуславливает интерес к изучению мигрени. Согласно эпидемиологическим данным, мигрень наблюдается у 3-5 % детей и у 10-12 % подростков [9], занимая второе место по частоте встречаемости среди первичных форм головной боли. Несмотря на большое количество научных исследований, посвященных этиопатогенезу мигрени, механизмы возникновения приступов головной боли до конца не изучены.

Несомненным является роль наследственных факторов в развитии мигрени [1]. Наиболее существенным подтверждением значимости генетических механизмов является прогресс в раскрытии молекулярно-генетических основ васкулярно-церебральных заболеваний, включая мигрень. В последнее десятилетие наметился рост числа исследований, касающихся роли генетических факторов системы гемостаза в патогенезе мигрени. Среди них изучены мутации и полиморфизмы генов плазменных фак-

торов свертывающей системы крови, белков системы фибринолиза, тромбоцитарных рецепторов, ферментов, участвующих в поддержании физиологического сосудистого эндотелия [4]. Установлено, что наличие мутаций в этих генах заметно повышает риск развития заболевания, особенно при наличии у одного и того же больного нескольких тромбофилических факторов в сочетании с внешними факторами [11]. В настоящее время к числу генов, влияющих на риск развития мигрени, относятся мутации и полиморфные варианты генов фактора свертывания крови V (G1691A полиморфизм, известный как фактор V Лейден), ген протромбина (полиморфизм G20210A), метилентетрагидрофолатредуктазы (полиморфизм С677Т), гены тромбоцитарных гликопротеинов (полиморфизмы T1565C и С434Т). Наиболее изученным генетическим дефектом системы гемостаза при мигрени с аурой, который приводит к развитию гиперкоагуляци-онного состояния, является резистентность FV к активированному протеину С - РАПС. D. D'Amico et al. (1998) при обследовании пациентов с мигренью с аурой обнаружили резистентность к активированному протеину С и Лейденовскую мутацию у 14,5 % больных, что значительно выше, чем в общей популяции (2-6 %) [5]. Вместе с тем в исследовании J. Corral et al. не было отмечено увеличения риска развития мигрени при мутациях генов протромбина, V фактора свертывания и генов тромбоцитарных рецепторов [4].

Активация коагуляционных факторов плазмы и усиление агрегационных свойств тромбоцитов рассматривается в качестве одного из важных патогенетических механизмов развития мигрени [3]. Повышенная агрегация тромбоцитов может быть генетически детерминированной, которую связывают с мутацией гетеродимера GpIIb/IIIa. Дисфункция эндотелия рассматривается в качестве одного из важных механизмов развития мигренозной головной