CC BY
434
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ОБЗОРЫ
Генетические маркеры в диагностике рака щитовидной железы
ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва ООО «Аллель. Центр инновационных биотехнологий», Москва ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
Проблема дифференциальной диагностики рака щитовидной железы остается актуальной в связи с распространенностью бессимптомных узловых образований этой области и отсутствием методов их неинвазив-ной дифференциальной диагностики. В связи с актуальностью темы в ближайшее время можно ожидать увеличения научных исследований, касающихся изучения ассоциированных генов, мутаций, других маркеров, имеющих клиническую значимость в диагностике и персонализации терапии у пациентов со злокачественными образованиями. В данной статье представлены возможности различных современных молекулярно-генетических исследований в диагностике злокачественного потенциала опухолей щитовидной железы.
Ключевые слова:
щитовидная железа, узловые образования щитовидной железы, рак щитовидной железы, диагностика рака щитовидной железы, генетические исследования, молекулярно-генетические исследования, генетические панели, генетические маркеры рака щитовидной железы, экспрессия гена, микроРНК, RАS-мутации, многокомпонентный каскад RAS/MAPK (Ras-Raf-MAP-киназный путь), внутриклеточная и секретируемая (экзосомальная) фракция малых регуляторных РНК
Эндокринология: новости, мнения, обучение. 2018. Т. 7. № 1. С. 42-49.
Статья поступила в редакцию: 17.01.2018. Принята в печать: 07.02.2018.
Genetic markers in the diagnosis of thyroid cancer
Ametov A.S.1, Depui T.I.1, 1 Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow
Pozdnyakova N.V.2, 2 Allele Center for Innovative Biotechnologies, Moscow
Chemekova A.R.1, Filatova G.A.3 3 A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry
of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
The problem of differential diagnosis of thyroid cancer remains relevant in connection with the prevalence of asymptomatic nodular thyroid formations and the absence of methods for their non-invasive differential diagnosis. In connection with the urgency of the topic, in the near future, one can expect an increase in scientific research related to the study of associated genes, mutations, and other markers of clinical significance in the diagnosis and personalization of therapy in patients with malignant tumors. This article presents the possibilities of various modern molecular genetic studies in the diagnosis of malignant tumorigenic thyroid tumors.
Keywords:
thyroid gland, thyroid nodules, thyroid cancer, thyroid cancer diagnosis, genetic studies, molecular genetic studies, genetic panels, genetic markers of thyroid cancer, gene expression, microRNA, RAS mutations, RAS/MAPK multicomponent cascade (Ras-Raf-MAP kinase pathway), intracellular and secreted (exosomal) fraction of small regulatory RNAs
Endocrinology: News, Opinions, Training. 2018; 7 (1): 42-9.
Received: 17.01.2018. Accepted: 07.02.2018.
Аметов А.С.1, Дэпюи Т.И.1,
Позднякова Н.В. , 3
Чемекова А.Р.1, Филатова Г.А.3
2 2
Злокачественные образования щитовидной железы (ЩЖ) являются самой распространенной онкологической патологией в эндокринологии и достигают 0,5% в структуре общей онкопатологии и 5% среди всех злокачественных образований головы и шеи.
Современные высокоинформативные алгоритмы обследования пациентов с подозрением на злокачественные образования ЩЖ позволяют быстро, точно и эффективно установить наличие заболевания, степень выраженности злокачественного процесса и определить оптимальные методы лечения.
Ни у кого сегодня не вызывает сомнений необходимость выполнения гормонального обследования (для исключения функционального нарушения), ультразвукового исследования (УЗИ) ЩЖ (для определения наличия образований, их структуры, установления поражения лимфатических коллекторов), проведения пункционной биопсии (тонкоигольной аспирационной биопсии - ТАБ) узла под контролем УЗИ (для установления дооперационной морфологической верификации патологического процесса).
УЗ-диагностика занимает лидирующее место в исследовании узловых образований ЩЖ благодаря своей доступности, отсутствию лучевой нагрузки, скорости исследования и экономической эффективности. При УЗИ оцениваются анатомические структуры, размеры ЩЖ и характеристика узлов (узловые новообразования и их характеристики). По данным УЗИ и полученным характеристикам узла можно предположить его злокачественный потенциал.
В настоящее время при постановке диагноза наиболее распространена описательная классификации Thyroid Imaging Reporting and Data System (TIRADS), предложенная в 2011 г. Kwak и соавт., нацеленная на допункционную верификацию узла.
C 2011 по 2017 г. было предложено несколько новых модификаций этой системы.
В настоящий момент принято учитывать следующие УЗ-признаки злокачественности [1]:
1. Структура (кистозная - 0; губчатая - 0; смешанная кистозная и плотная - 0; плотная, солидная - 2).
2. Эхогенность (анэхогенная - 0; гипер- или изоэхоген-ная - 1; гипоэхогенная - 2; выраженно гипоэхогенная - 3).
3. Форма (ширина преобладает над высотой - 0; высота преобладает над шириной - 3).
4. Характеристика краев (ровные, четкие - 0; не определяются - 0; неровные - 2; прорастание капсулы - 3).
5. Кальцинаты (нет - 0; артефакт «хвост кометы» - 0; макрокальцификаты - 1; кальцификация капсулы - 2; микрокальцификаты - 3).
Каждой характеристике в зависимости от выраженности присваивается балл. Рекомендуется проведение ТАБ при >3 баллов. Выделяют 5 типов узлов по данным TIRADS: от 1 балла - вероятно доброкачественный, до 5 баллов -вероятно злокачественный.
В последние годы ТАБ в России считается «золотым стандартом», оптимальным методом диагностики узловых образований ЩЖ, так как обеспечивает относительно высокие показатели чувствительности и специфичности (65-98 и 72-100% соответственно). Однако существенный недо-
статок этого метода - высокий процент неинформативных исследований, когда в силу различных объективных причин не удается установить цитологический диагноз. По данным разных авторов, от 10 до 25% проведенных ТАБ не дают клинически значимой информации.
По рекомендациям дооперационной описательной классификации TIRADS пункционной биопсии подвергаются все узлы >10 мм в диаметре или при наличии выраженных признаков злокачественности, согласно УЗИ. По результатам биопсии можно судить о злокачественном потенциале образования. Согласно цитологической классификации Ве^еБСа, предложенной в 2009 г. Е^. СтЬаБ и соавт., [2], выделяют 6 типов цитологических заключений.
1. Неинформативный пунктат. Вероятность злокачественности 1-4%.
2. Доброкачественный узел. Вероятность злокачественности 0-3%.
3. Атипия неопределенного значения или фолликулярная неоплазия неопределенного значения. Вероятность злокачественности 5-15%.
4. Фолликулярная неоплазия или подозрение на фолликулярную неоплазию. Вероятность злокачественности 15-30%.
5. Подозрение на злокачественность. Вероятность злокачественности 60-75%.
6. Злокачественный узел. Вероятность злокачественности 97-99%.
Большая часть узловых образований представлена коллоидным зобом (КЗ) и 14% - раком ЩЖ (РЩЖ). Наибольший диагностический интерес представляют категории III и IV - фолликулярная неоплазия, подозрение на фолликулярную неоплазию и атипия неопределенного генеза. Эти типы цитологического заключения являются «возможно» злокачественными, «серой» зоной. Их злокачественность можно подтвердить при гистологическом заключении по признакам прорастания капсулы узла тканью опухоли или ее сосудами.
Согласно рекомендациям Ве^еБСа от 2017 г. [3], в случае получения цитологического варианта атипии неопределенного значения рекомендуется удаление доли ЩЖ или использование молекулярного либо генетического тестирования для определения прогноза.
Существует два типа клеток, из которых происходит РЩЖ, - фолликулярные и С-парафолликулярные клетки.
Фолликулярные тиреоидные клетки являются родоначальниками таких видов РЩЖ, как папиллярный (70-80%), фолликулярный (15%), слабо дифференцированный (1-2%), анапластический (<1%).
Папиллярный (ПРЩЖ) и фолликулярный РЩЖ объединяются в классификацию дифференцированных видов РЩЖ. Парафолликулярные С-клетки дают рост медуллярному РЩЖ, распространенность которого составляет около 5% [4].
В последние десятилетия отмечен рост онкопатологии ЩЖ [5]. Абсолютное количество впервые в жизни установленного диагноза злокачественного новообразования ЩЖ в 2016 г. составило 1873 случая, что в среднем на 7,2% больше выявленных в 2015 г. Возможная причина роста заболеваемости - в доступности УЗИ и широкой диагностики папиллярных микрокарцином, которые, согласно исследова-
нию, проведенному в Корее в 2015 г. [6], не влияют на продолжительность жизни и не отличаются злокачественным течением.
Медуллярный рак находится на 3-м месте по распространенности. Он может быть как наследственным, так и спорадическим. Наследственный РЩЖ наблюдается в синдромах множественных эндокринных неоплазий (МЭН) IIA и B. Маркером медуллярного РЩЖ является высокий уровень кальцитонина в крови и смыве иглы после ТАБ. Для того чтобы подтвердить генетическую наследственную предрасположенность заболевания, можно провести моле-кулярно-генетическое исследование полученной ткани узла на наличие транслокаций в протоонкогене RET.
В случае наиболее распространенных карцином - ПРЩЖ и фолликулярного РЩЖ их генетические маркеры достоверно не определены, но по ряду научно-исследовательских работ зарубежных исследователей определен ряд генов-регуляторов, мутации в которых характеризуют предрасположенность к тому или иному варианту новообразования. Среди них протоонкогены KRAS, NRAS, HRAS, гены BRAF, PI3K. Также проводятся исследования для определения генов-кандидатов в диагностике папиллярной карциномы.
Молекулярно-генетической основой для развития онкологических заболеваний является активация онкогенных каскадных сигнальных путей внутри клетки. Активация патологического сигнального пути запускает процессы, влияющие на основные факторы канцерогенеза: пролиферацию, ангиогенез, адгезию, дифференциацию клеток.
В концепции развития РЩЖ наиболее актуальны такие каскадные пути, как RAS/MAPK (Ras-Raf-MAP-киназный путь), митоген-активная протеинкиназа, включающая RAS- и BRAF-мутации, NF-kB, Р13К-АКТ-пути. В развитии опухоли может играть роль как один каскадный путь, так и несколько. В зависимости от вида соматических мутаций и функциональных изменений, кодируемых микроРНК, развиваются разные цитологические типы опухолей. Достоверно продемонстрировано, что в опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой происходят существенные изменения уровней экспрессии различных микроРНК - малых кодирующих РНК, которые играют важнейшую роль в регуляции транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экс-пресии генов [7]. При этом сами изначальные изменения, которые инициируют рост опухоли (например, RAS- или BRAF-мутации), непосредственно не связаны с последующими агрессивными клиническими проявлениями. Повышенный уровень экспрессии многих микроРНК способствует процессам развития пролиферации и миграции опухолевых клеток. Например, типичная онкогенная микроРНК (микроРНК-21) способствует прогрессированию опухоли посредством ряда механизмов, таких как активация сигнального пути EGFR/AKT [8], ингибирование экспрессии гена фосфатазы с двойной субстратной специфичностью (PTEN), тормозящего передачу сигнала по онкогенному сигнальному пути PI3K/AKT/mTOR [9], снижение чувствительности к лиганду, индуцирующему ФНО-зависимый апоптоз (TRAIL) благодаря снижению экспрессии транскрипционного фактора Tap63 [10]. МикроРНК, уровни экспрессии которых значительно изменяются в тканях при развитии онколо-
гического процесса, могут служить биомаркерами онкоге-неза. В ряде зарубежных работ в качестве таких маркерных микроРНК приводятся гиперэкспрессируемые miR-29b-1-5p, miR-31-5p, miR-138-1-3p, miR-139-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-204-5p, miR-222-3p, miR-375, miR-551b-3p [11, 12], исследование которых позволяет снизить количество диагностических хирургических операций при узловых новообразованиях ЩЖ до 69%. Злокачественность опухоли связана с последующими изменениями, которые нарушают адгезию клеток, их рост, выживаемость и другие важные клеточные функции. Как уже говорилось, изменения сигнальных путей носят каскадный характер и с течением времени приводят к появлению новых мутаций. Так, дальнейшие изменения, такие как мутации генов TERT и TP 53, которые встречаются в тканях агрессивных, плохо дифференцированных карцином, могут сочетаться с менее злокачественными мутациями, но в совокупности предрекают неблагоприятный прогноз.
RAS-мутации
Одним из хорошо изученных сигнальных путей является нисходящий многокомпонентный каскад RAS/MAPK (Ras-Raf-MAP-киназный путь), который тесно связан с пролиферацией опухолевых клеток. Сигналы, передаваемые при активации рецептора EGFR по сигнальному пути RAS/MAPK, определяют пролиферативную активность опухолевой клетки, способность к дифференцировке, метастазированию, уход от апо-птоза, индукцию ангиогенеза и т.д. Мутации в каскадном пути RAS встречаются практически при каждом онкологическом заболевании человека. Пути RAS были исследованы первыми в качестве кандидатов маркеров РЩЖ. Существуют 3 изоформы RAS: протоонкогены HRAS, KRAS и NRAS. Их роль в развитии РЩЖ хорошо известна. Мутации НРАS преимущественно обнаруживается в опухолях ЩЖ. Мутации генов RAS встречаются в среднем в 30-45% случаев при развитии фолликулярного РЩЖ, 30-45% - при развитии фолликулярного варианта ПРЩЖ, 20-40% - при низкодифференцирован-ном РЩЖ, 10-20% - при анапластическом варианте РЩЖ и редко - в случае классического ПРЩЖ [13].
В случае доброкачественной фолликулярной аденомы RAS-мутации встречаются в 20-25% случаев. Однако сами по себе RAS-мутации имеют низкую чувствительность и специфичность. Необходимы другие предраковые изменения, кроме как в системе RAS, чтобы фолликулярная аденома трансформировалась в рак. Это предположение доказывается в исследованиях, в которых in vivo была выведена популяция тиреоицитов с RAS- и HRAS-мутациями, в итоге развились только высокодиф-ференцированные клетки ЩЖ [14]. В целом роль RAS-мутации в диагностике РЩЖ до сих пор остается неясной.
Ввиду того что наличие той или иной мутации отличает доброкачественное новообразование от потенциально злокачественного, наличие RAS-мутации в доброкачественном узле дает повод для беспокойства. Поэтому некоторые специалисты рекомендуют удалять все RAS-положительные узлы. Другие группы исследователей не рекомендуют удаление цитологически доброкачественных узлов, что согласуется с существующими международными рекомендациями [15], и советуют вести динамическое наблюдение. Группы Medici
и Alexander исследовали этот вопрос [16]. По результатам одиночная мутация была малоинформативна в диагностике РЩЖ. Доброкачественные по цитологии и инструментальным исследованиям RAS-положительные узлы имели благоприятные прогноз и на протяжении 8 лет исследования не давали клинически значимого роста образований. Это служит одним из подтверждений того, что цитологически доброкачественные RAS-узлы могут контролироваться консервативно на протяжении длительного времени.
Неясен прогноз RAS-положительных узлов в отношении фолликулярной аденомы и атипии неясного генеза [17]. Не установлено, на протяжении какого времени узлы остаются доброкачественными и их можно контролировать консервативно.
В настоящее время распространена оценка УЗ-картины ЩЖ 1 раз в 1-2 года. По результатам исследований Medici, при обследовании 1200 человек с общим количеством узловых образований 1600, не было отмечено случаев малигнизации и значимого увеличения доброкачественных узлов за 4 года наблюдения. Таким образом, авторы рекомендуют сократить частоту наблюдения за пациентами с узловым зобом до 3 лет [16]. Одиночная RAS-мутация не является предиктором злокачественности образования в случае доброкачественно верифицированных узлов. По результатам ранних исследований Medici подтверждается, что выявление RAS-мутации в злокачественных узлах не означает агрессивного течения рака. Обычно это фолликулярный вариант папиллярного РЩЖ, характеризующийся доброкачественным течением без прорастания и отдаленных метастазов. Эти опухоли хорошо излечимы и имеют благоприятный прогноз [18].
В случае выявления одиночной RAS-мутации в дифференцированном РЩЖ можно говорить о благоприятном прогнозе. RAS-мутация может рассматриваться как молекулярный маркер злокачественности в одном из следующих случаев.
1. В качестве элемента генетической панели, имеющего высокую прогностическую отрицательную ценность для исключения РЩЖ.
2. Если RAS-мутация обнаружена, но цитологически узел доброкачественный, ситуация имеет хороший прогностический потенциал и не требует операции. Частота проведения УЗИ примерно 1 раз в 3 года.
3. Если RAS-мутация обнаружена, то дифференцированный РЩЖ имеет хороший прогноз и его можно лечить менее агрессивными методами - гемитиреоидэктомией, без последующего применения радиоактивного йода.
4. Если клинические признаки отрицательны, по результатам цитологии выявлена фолликулярная аденома или атипия неопределенного генеза, то в случае RAS-положительной мутации можно провести гемитиреоидэктомию с последующим консервативным ведением.
Ориентироваться на наличие RAS-мутации можно только в случае ее одиночной диагностики. Если были обнаружены другие мутации, такие как TERT PI3K, опухоль стоит рассматривать как более агрессивную и наблюдать в соответствующих клинических условиях.
BRAF
Мутация BRAF V600E наиболее распространена в случае ПРЩЖ, ее частота достигает 45% [19, 20]. В исследовании Medici подтвердили связь мутации BRAF V600E с агрессивностью рака и неблагоприятным прогнозом [16]. При оценке линии BRAF V600E трансгенных мышей отмечался рост агрессивного тиреоидного папиллярного рака [21]. Проведенный крупный метаанализ подтверждает более агрессивное течение ПРЩЖ при наличии мутации BRAF V600E [22]. По результатам исследований Хенке, мутация BRAF V600E не является предиктором развития агрессивного ПРЩЖ [23]. В работе сделаны выводы, что мутация BRAF V600E невыра-женно коррелирует с клинико-патологическими признаками ПРЩЖ.
Мутация BRAF T1799A 600Е часто встречается в человеческих раковых клетках, особенно меланоме и ЩЖ. Несколько больших исследований ассоциируют BRAF-мутацию с агрессивным течением РЩЖ, таким как лимфатические метастазы, прорастание капсулы, распространенный процесс опухолевого роста, рецидивы [24, 25]. Проведенные многоцентровые исследования показали ассоциацию BRAF V600E-мутации с тяжелым течением ПРЩЖ с возрастанием риска рецидива, нечувствительности к радиоактивному йоду, более агрессивному течению, неэффективности терапии [26, 27], доказывающие агрессивную роль этой мутации в развитии ПРЩЖ. Оценки BRAF-мутации улучшают диагностику ПРЩЖ.
Крупное мультицентровое исследование показало связь мутации BRAF 600Е со смертностью от ПРЩЖ [28]. Исследования показали, что BRAF 600Е-мутация прочно ассоциирована с неблагоприятным течением заболевания даже у пациентов с низким риском [29]. BRAF 600Е, обнаруженные в предоперационном ТАБ, предсказывали плохой клинико-патологический исход ПРЩЖ и были предиктором метастазов в димфатических узлах (что требовало профилактической центральной лимфодиссекции, даже у пациентов без подтвержденного метастазирования). Таким образом, рекомендуется предоперационная оценка BRAF 600Е в образцах ТАБ для стратификации риска и определения хирургической и терапевтической тактики у пациентов с ПРЩЖ.
RET/PTC*
Наличие этой мутации предсказывает высокие темпы роста доброкачественных образований, однако их участие в онкогенезе на данный момент неясно [30]. Лучшим примером транслокации генов, приводящей к развитию рака, является транслокация гена RET - папиллярная тиреоидная карцинома. Существует более 10 видов RET-PTC-транслокаций, которые определяются как гены-партнеры, самые распространенные из которых RET-PTC1 и RET-PTC3. В результате мутаций в лиганд-независимой демеризации может формироваться и доброкачественная фолликулярная аденома ЩЖ (ФАЩЖ), и фолликулярный вариант ПРЩЖ, и классический
* RET - протоонкоген, кодирующий рецепторы тирозикиназы. ЭНДОКРИНОЛОГИЯ: новости, мнения, обучение. Том 7, № 1 2018
вариант ПРЩЖ. Недавние исследования показали корреляцию между наличием RET-PTC и скоростью роста доброкачественной опухоли ЩЖ [31].
PAX8/PPAR-
Генетические изменения в сигнальных путях PI3K-AKT гораздо чаще происходят в фолликулярной карциноме ЩЖ (ФКЩЖ), чем в ФАЩЖ. Поэтому можно предположить, что при активации сигнальных путей PI3K-AKT происходит наделение ФАЩЖ инвазивными свойствами опухолевых клеток. Существуют вторичные молекулярные изменения в развитии ФКЩЖ, которые играют не столь значимую роль как PI3K-AKT, они включают WNT-ß-catenin111, HIFla, FOXO3 и NF-kB путь [32]. Комбинация этих маркеров в одной панели, согласно исследованию, показала повышение чувствительности в случае атипии неопределенного генеза до 88% и фолликулярной неоплазии - до 87% [33]. Чувствительность этого теста в двойном слепом многоцентровом исследовании была хоть и ниже, но оставалась высокой 80% [34]. Мутация PAX8/PPAR-Y не встречается в низко- и плохо дифференцированных карциномах [35]. Также наличие мутации PPAR-y соотносится с женским полом, молодым возрастом и локальной распространенностью, не сочетается с отдаленными метастазами.
E/F7AX
Ген EIF1AX локализован на Х хромосоме и кодирует фактор трансляции эукариот 1А. В исследовании A. Karunamurthy и соавт. было оценено 647 узлов ЩЖ. Мутация в экзонах 2, 5 и 6 была выделена в 7,4% фолликулярных аденом и 1,3% гиперпластических узлов (без выявления других мутаций) [36]. При проведении ТАБ и выявлении мутации EIF1AX вероятность РЩЖ составляет примерно 20%. Эта вероятность выше в случае сочетания с мутацией RAS. Также мутация EIF1AX встречается при диагностике папиллярной и анапла-стической карцином ЩЖ и в 1,3% доброкачественных узлов.
AKT 7
Мутация выделена в плохо дифференцированных папиллярных карциномах. Задействована в PI3K-AKT каскадном пути. Встречается в 19% случаев йодонегативных агрессивных карцином.
TERT
Встречается в зародышевых и соматических стволовых клетках и практически не встречается в большинстве соматических клеток. Распространенность среди фолликулярных тиреоидных карцином 10-35%, папиллярных карцином -5-15%, плохо дифференцированных карцином - 20-50%, анапластических - 30-75%. Мутация TERT способствует опухолевой прогрессии, ее выделение является неблагоприятным прогностическим маркером, так как в ряде исследований она показала свою взаимосвязь с большим размером опухоли, отдаленными метастазами, экстратиреоидным рас-
пространением и высоким уровнем смертности (особенно в случае ПРЩЖ) [37]. Эта мутация часто встречается с другими мутациями, например с BRAFp.V600E85, и в этом случае отличается крайне неблагоприятным прогнозом [38].
TP53
Распространенность мутации среди плохо дифференцированных карцином - 10-35%, среди анапластических карцином достигает 40-80%. В исследовании T. Ibrahim pasic, B. Xu и соавт. мутация TP53 была зарегистрирована среди 9% фатальных плохо дифференцированных карцином [39].
Можно с уверенностью предположить, что процесс про-грессирования тиреоидного рака представляет собой постепенное накопление множества мутаций, которые совместным действием усиливают онкогенность. Таким образом, генетические изменения, активирующие MAPK- и PI3K-AKT-пути, являются важным механизмом, который управляет прогрессией РЩЖ. В случае активации MAPK-пути развивается ПРЩЖ. Активация PI3K-PTEN-AKT пути встречается в агрессивных карциномах ЩЖ (включая плохо дифференцированные и анапластические опухоли), и пациенты могут реагировать на специфические методы лечения ингибиторами AKT или mTOR [40]. В случае активации обоих путей их негативное воздействие усиливается и развиваются плохо дифференцированный РЩЖ и анапластическая тиреойод-ная карцинома. Эта модель была получена в исследовании на трансгенных мышах Pten и knock-in of KrasGl2D, у которых были активированы оба пути, что привело к развитию агрессивного РЩЖ. Аналогичное явление наблюдается при меланоме. У мышей с активацией BRAF- и, следовательно, MAPK-путей развивалась гиперплазия меланоцитов, при активации же обоих путей - меланома с метастазами [41]. Одновременная активация обоих путей представляет собой механизм активации опухолевой прогрессии.
Сочетание генетических мутаций, найденных в генах BRAF, RAS, RET-PTC и PAX8-PPAR-y c ТАБ может улучшить точность цитологической диагностики РЩЖ, недоступной стандартному цитологическому анализу. На настоящий момент Американская тиреидологическая ассоциация рекомендует использовать диагностические генетические панели для исследования узлов III и IV категорий Bethesda с неопределенной цитологической структурой. Используются следующие диагностические панели c различной комбинацией исследуемых генов.
ThyroSeq v2. Исследует 14 генов, встречающихся при различных видах РЩЖ, и 42 гена-кандидата, вероятно, связанных с канцерогенезом [42].
Рекомендуется использовать в случае неопределенной цитологии по результатам ТАБ.
Исследуемые гены: BRAF, RAS, K-RAS, N RAS, HRAS, CTNNB1, NTRK1, NTRK3, RET, AKT1, TERT, GNAS PIK3CA, PTEN, TSHR, TG, PAX8/PPAR-y, IGF2BP3/IMP3,KRT7/KRT20, TP53, CALCA, MET, EIF1AX, TTF1, PTH, SCL5A5.
Недостатком этой панели генов является то, что она централизована в отделе молекулярной и геномной патологии университета Питсбурга и использует только клеточные блоки для анализа.
Afirma (Сан-Франциско, США). Комбинированное, микроскопическое и генетическое исследование: мутации BRAF, RAS; транслокации RET/PTC и PAX8-PPAR-y). Частный тест, использующий микроРНК для диагностики узлов неопределенной цитологии. Этот тест широко применяется в США, но недоступен за пределами страны. Панель включает 25 генов для первоначальной диагностики медуллярного рака, агрессивных карцином, вероятности отдаленного метастазирова-ния с дальнейшим расширенным анализом. В исследовании, проведенном на 256 узловых образованиях, показала чувствительность 95% и специфичность 30% [43]. Вероятность злокачественности в случае отрицательных результатов равнялась 3-5%. Рекомендуется использовать этот тест в случае получения неясной цитологии по данным ТАБ, во избежание ненужных операционных вмешательств.
TheGenX (Парсиппани, Нью-Джерси).
Анализ ДНК - точечных мутаций генов KRAS, HRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA; транслокации RET/PTC1 RET/PTC3 PAX8/ PPAR-y. Методика дает возможность подтвердить или исключить рак. Использует секвенирование 7 генов. Отличается от других 7 генных исследований тем, что выделяет микроРНК и количественно оценивает на собственном спектрофотометре NanoDrop мм nd1000 (NanoDrop Technologies, Уолтем, штат Массачусетс).
Thyra MIR (Interpace Diagnostics Morris Corporate Center 1, Building A300 Interpace Parkway Parsippany, исследование экспрессии 10 микроРНК). Оценивалась микроРНК - малая некодируемая часть РНК. Экспрессия различных микроРНК была зафиксирована в различных тиреоидных неоплазиях [44]. Thyra MIR оценивает различные микроРНК: miR-29-b-1-5p, miR-31-5p, miR-138-1-3p, miR-139-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-204-5p, miR-222-3p, miR-551b-3p. По результатам можно предположить, злокачественное образование или нет. Комбинация панелей Thyra MIR и TheGenX в отношении цитологии неопределенного генеза демонстрировала чувствительность 84% и специфичность 80% [45].
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2. Используют наиболее распространенные гены BRAF, NRAS, HRAS, KRAS и RET.
Тест с оценкой 7 генов. Используется комбинация генов BRAF V600E, PAX8/PPAR-y, RET/PTC, HRAS, KRAS и NRAS. Эта комбинация генов рекомендуется Американской тире-оидологической ассоциацией в качестве дополнительной предоперационной диагностики в случае неясной цитологии ЩЖ [46]. Однако, согласно исследованию 2017 г., чувствительность и специфичность панели не превышали таковые у ТАБ [47].
Заключение
Проблема дифференциальной диагностики РЩЖ остается актуальной в связи с распространенностью бессимп-
томных узловых образований ЩЖ и отсутствием методов их неинвазивной дифференциальной диагностики.
Корректная и своевременная дифференциальная диагностика является основой правильного выбора лечебной тактики и соответственно определяет результаты лечения. В течение последних лет методы молекулярно-генетиче-ского анализа активно разрабатываются и внедряются в клиническую практику, позволяя оптимизировать диагностический процесс. Анализ молекулярно-генетических маркеров, внутриклеточной и секретируемой (экзосо-мальной) фракций малых регуляторных РНК (микроРНК) является одним из наиболее перспективных методов диагностики онкологических заболеваний ЩЖ. Стабильность внеклеточной микроРНК определяется связью с белками, липопротеинами или ее упаковкой в мембранные микровезикулы - экзосомы. Есть основания предполагать, что экзосомы со специфическим составом микроРНК являются результатом процесса активной и биологически значимой секреции, в то время как высвобождение других форм микроРНК сопровождает апоптотическую или некротическую гибель клеток. Это определяет особую диагностическую ценность экзосомальной фракции циркулирующих микроРНК, которая может отражать наличие и клинически значимые свойства опухоли. Кроме этого, определение генетических маркеров на ранней стадии позволяют выявить группы пациентов с повышенным риском онко-образования и прогнозировать качество и активность процесса.
Также, выделяя генетическую предрасположенность, можно судить о вероятности развития рака у родственников, о возможности скорого метастазирования, оценить эффективность проводимой терапии и степень активности процесса у пациента, определить масштаб операции: будет это тотальная тиреоидэктомия с центральной лимфодиссекцией или удаление доли в случае микрокарциномы с благоприятным прогнозом. В случае же цитологического диагноза III и IV класса Bethesda высокочувствительная и специфическая генетическая диагностика позволит оптимизировать показания для хирургического вмешательства.
Молекулярно-генетическое исследование может являться основанием для персонализации стратегии терапии. Учитывая лавинообразное увеличение активности в области исследования генетических маркеров, в ближайшее время можно ожидать увеличения количества ассоциированных генов, мутаций, других маркеров, имеющих клиническую значимость в диагностике и персонализации терапии. Формируются новые диагностические панели с высокой чувствительностью и специфичностью. Возможно, комплексная диагностика узловой патологии ЩЖ в комплексе с генетическими и цито-гистохимическими исследованиями повысят дооперацион-ную диагностику.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Аметов Александр Сергеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой эндокринологии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва E-mail: [email protected]
Дэпюи Татьяна Игоревна - доктор медицинских наук, профессор кафедры эндокринологии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва E-mail: [email protected]
Позднякова Наталья Вячеславовна - научный руководитель, директор ООО «Аллель. Центр инновационных биотехнологий», Москва
Чемекова Анна Рудольфовна - аспирант кафедры эндокринологии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва
Филатова Гульнара Ахмятовна - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры клинической аллергологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. A^. Евдокимова» Минздрава России , Москва E-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Horvath E., Majlis S., Rossi R., Franco C., et al. An ultrasonogram reporting system for thyroid nodules stratifying cancer risk for clinical management. J Clin Endocrinol Metab. 2009; 94 (5): 1748-51.
2. Cibas E.S., Ali S.Z. The Bethesda System For Reporting Thyroid Cytopathology. NCI Thyroid FNA State of the Science Conference. Am J Clin Pathol. 2009; 132 (5): 658-65.
3. Cibas E.S., Ali S.Z. Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid. 2017; 27 (11): 1341-6.
4. Howlader N., et al. SEER Cancer Statistics Review 1975-2009 (Vintage 2009 Populations). National Cancer Institute, 2012 [online]
5. Jemal A., Bray F., Center M.M., Ferlay J., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011; 61 (2): 69-90.
6. Choi Y.M., Kim W.G., Kwon H., Jeon M.J., et al. Changes in standardized mortality rates from thyroid cancer in Korea between 1985 and 2015: Analysis of Korean national data. Cancer. 2017; 123 (24): 4808-14.
7. Marumoto K., Koyama T., Miyake H., et al. Diffusion-tensor imaging in elderly patients with idiopathic normal pressure hydrocephalus or Parkinson's disease: diagnosis of gait abnormalities Fluids Barriers CNS. 2012; 9 (1): 20.
8. Zhang K.L., et al. MicroRNA-566 activates EGFR signaling and its inhibition sensitizes glioblastoma cells to nimotuzumab. Mol Cancer. 2014; 13: 63.
9. Meng F., et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology. 2007; 133 (2): 647-58.
10. Quintavalle C., et al. miR-221/222 target the DNA methyltransferase MGMT in glioma cells. PloS One. 2013; 8 (9): e74466.
11. Labourier E., Beaudenon A., Wylie D., Giordano T.J. Multi-categorical testing for miRNA, mRNA and DNA on fine needle aspiration improves the preoperative diagnosis of thyroid nodules with indeterminate cytology. ENDO 2015. Presented at the 97th Meeting and Expo of the Endocrine Society March 5-8, 2015. SAT-344.
12. Hu Y., et al. Candidate microRNAs as biomarkers of thyroid carcinoma: a systematic review, meta-analysis, and experimental validation. Cancer Med. 2016; 5 (9): 2602-14.
13. Frattini M., Ferrario C., Bressan P., Balestra D., et al. Alternative mutations of BRAF, RET and NTRK1 are associated with similar but distinct gene expression patterns in papillary thyroid cancer. Oncogene. 2004; 23 (44): 7436-40.
14. Gire V., Wynford-Thomas D. RAS oncogene activation induces proliferation in normal human thyroid epithelial cells without loss of differentiation. Oncogene. 2000; 19 (6): 737-44.
15. Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C., Doherty G.M., et al. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer:
The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016; 26 (1): 1-133.
16. Medici M., Kwong N., Angell T.E., Marqusee E., et al. The variable phenotype and low-risk nature of RAS-positive thyroid nodules. BMC Med. 2015; 13: 184.
17. Medici M., Liu X., Kwong N., Angell T.E., et al. Long-interval versus short-interval follow-up of cytologically benign thyroid nodules: a prospective cohort study. BMC Med. 2016; 14: 1186.
18. Xing M., Westra W.H., Tufano R.P., Cohen Y., et al. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90 (12): 6373-9.
19. Charles R.P., Iezza G., Amendola E., Dankort D., et al. Mutationally activated BRAF(V600E) elicits papillary thyroid cancer in the adult mouse. Cancer Res. 2011; 71 (11): 3863-71.
20. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer. 2005; 12 (2): 245-62.
21. Lee S.J., Lee M.H., Kim D.W., Lee S., et al. Cross-regulation between oncogenic BRAF(V600E) kinase and the MST1 pathway in papillary thyroid carcinoma. PLoS One. 2011; 6 (1): e16180.
22. Li C., Lee K.C., Schneider E.B., Zeiger M.A. BRAF V600E mutation and its association with clinicopathological features of papillary thyroid cancer: a meta-analysis. J Clin Endocrinol Metab. 2012; 97 (12): 4559-70.
23. Henke L.E., Pfeifer J.D., Ma C., Perkins S.M., et al. BRAF mutation is not predictive of long-term outcome in papillary thyroid carcinoma. Cancer Med. 2015; 4 (6): 791-9.
24. Rabes H.M., Demidchik E.P., Sidorow J.D., Lengfelder E., et al. Pattern of radiation-induced RET and NTRK1 rearrangements in 191 post-chernobyl papillary thyroid carcinomas: biological, phenotypic, and clinical implications. Clin Cancer Res. 2000; 6 (3): 1093-103.
25. Namba H., Nakashima M., Hayashi T., Hayashida N., et al. Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88 (9): 4393-7.
26. Nikiforova M.N., Kimura E.T., Gandhi M., Biddinger P.W., et al. BRAF mutations in thyroid tumors are restricted to papillary carcinomas and anaplastic or poorly differentiated carcinomas arising from papillary carcinomas. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88 (11): 5399-404.
27. Xing M., Westra W.H., Tufano R.P., Cohen Y., et al. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90 (12): 6373-9.
28. Xing M., et al. The BRAF T1799A mutation and poor outcomes of papillary thyroid cancer-report from the international collaborative BRAF study group. Thyroid. 2011; 21 (S1): 112.
29. Kim T.H., Park Y.J., Lim J.A., Ahn H.Y., et al. The association of the BRAF (V600E) mutation with prognostic factors and poor clinical outcome in papillary thyroid cancer: a meta-analysis. Cancer. 2012; 118 (7): 1764-73.
30. Sapio M.R., Guerra A., Marotta V., Campanile E., et al. High growth rate of benign thyroid nodules bearing RET/PTC rearrangements. J Clin Endocrinol Metab. 2011; 96 (6): E916-9.
31. Sapio M.R., Guerra A., Marotta V., Campanile E., et al. High growth rate of benign thyroid nodules bearing RET/PTC rearrangements. J Clin Endocrinol Metab. 2011; 96 (6): E916-9.
32. Burrows N., Resch J., Cowen R.L., von Wasielewski R., et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in thyroid carcinomas. Endocr Relat Cancer. 2010; 17 (1): 61-72.
33. Nikiforov Y.E., Ohori N.P., Hodak S.P., Carty S.E., et al. Impact of mutational testing on the diagnosis and management of patients with cytologically indeterminate thyroid nodules: a prospective analysis of 1056 FNA samples. J Clin Endocrinol Metab. 2011; 96 (11): 3390-7.
34. Beaudenon-Huibregtse S., Alexander E.K., Guttler R.B., Hersh-man J.M., et al. Centralized molecular testing for oncogenic gene mutations complements the local cytopathologic diagnosis of thyroid nodules. Thyroid. 2014; 24 (10): 1479-87.
35. Nikiforova M.N., Lynch R.A., Biddinger P.W., et al. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: 2318-26.
36. Karunamurthy A., Panebianco F., Hsiao S.J., et al. Prevalence and phenotypic correlations of EIF1AX mutations in thyroid nodules. Endocr Relat Cancer. 2016; 23: 295-301.
37. Melo M., Gaspar da Rocha A., Batista R., et al. TERT, BRAF, and NRAS in primary thyroid cancer and metastatic disease. J Clin Endocrinol Metab. 2017; 102: 1898-907.
38. Liu R., Xing M. TERT promoter mutations in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2016; 23: R143-55.
39. Ibrahimpasic T., Xu B., Landa I., et al. Genomic alterations in fatal forms of non-anaplastic thyroid cancer: identification of MED12 and RBM10 as novel thyroid cancer genes associated with tumor virulence. Clin Cancer Res. 2017; 23: 5970-80.
40. Liu D., Hou P., Liu Z., Wu G., et al. Genetic alterations in the phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling pathway confer sensitivity of thyroid cancer cells to therapeutic targeting of AKT and mammalian target of rapamycin. Cancer Res. 2009; 69: 7311-9.
41. Dankort D., Curley D.P., Cartlidge R.A., Nelson B., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nat Genet. 2009; 41 (5): 544-52.
42. Nikiforova M.N., Wald A.I., Roy S., Durso M.B., et al. Targeted next-generation sequencing panel (ThyroSeq) for detection of mutations in thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2013; 98 (11): E1852-60.
43. Santhanam P., Khthir R., Gress T., et al. Gene expression classifier for the diagnosis of indeterminate thyroid nodules: a meta-analysis. Med Oncol. 2016; 33: 14.
44. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 2014; 159: 676-90.
45. Wylie D., Beaudenon-Huibregtse S., Haynes B.C., Giordano T.J., et al. Molecular classification of thyroid lesions by combined testing for miRNA gene expression and somatic gene alterations. J Pathol Clin Res. 2016; 2: 93-103.
46. Ferris R.L., Baloch Z., Bernet V., et al. American thyroid association statement on surgical application of molecular profiling for thyroid nodules: current impact on perioperative decision making. Thyroid. 2015; 25: 760-8.
47. Eszlinger M., Bohme K., Ullmann M., et al. Evaluation of a two-year routine application of molecular testing of thyroid fine-needle aspirations using a seven-gene panel in a primary referral setting in Germany. Thyroid. 2017; 27: 402-11.
