CC BY
71УДК 639.3: 575.224 DOI: 10.24411/0023-4885-2020-105019
ДОМЕСТИКАЦИЯ, МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ И ФИЗИОЛОГО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ HELIX POMATIA
Доместикация виноградной улитки Helix pomatia
Г.И. Пронина*, А.Б. Петрушин, Н.Ю. Корягина, Л.А. Розумная
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства (ФГБНУ ВНИИР)
Россия, 14240, Московская обл., р/п. им. Воровского
e-mail: g.pronina@rgau-msha.ru
Г.И. Пронина: SPIN6162-9922, ORCID 0000-0002-0805-6784, ResearcherID AAT-7345-2020; Scopu-sID: 56613245700;
А.Б. Петрушин: SPIN5774-7636, ORCID 0000-0002-4255-1463, ResearcherID AAV-2662-2020, Sco-pusID 57194692696;
Н.Ю. Корягина: SPIN 1057-6450, ORCID 0000-0001-8556-2202, Researcher ID AAU-3519-2020, Scopus ID 57194692422;
Л.А. Розумная: SPIN2062-0315, ORCID 0000-0002-7638-1490
Виноградная улитка Helix pomatia является хорошим объектом разведения и выращивания. Однако работ в направлении её доместикации и селекции практически не проводится. В этой связи цель настоящей работы заключалась в доместикации виноградной улитки и создании племенного стада для селекции. В течение 5 поколений отбирались стрессоустойчивые особи для дальнейшего разведения и выращивания, совершенствовалась технология кормления и содержания улитки в условиях интенсивной нагрузки, что позволило снизить отход с 30 до 5%. В настоящее время сформировано ремонтно-маточное стадо виноградной улитки в количестве 600 особей. Низкая вариабельность размерно-весовых показателей виноградной улитки позволяет создать устойчивую однородную популяцию при выращивании в искусственных условиях. Выявленные в результате физиолого-иммунологической оценки параметры: показатели гемоци-тарной формулы и лизосомально-катионного теста, послужат в дальнейшем для оценки состояния здоровья и профилактики заболеваний виноградной улитки.
Ключевые слова: виноградная улитка Helix pomatia, доместикация, стрессоустойчивость, физио-лого-имунологическая оценка.
Виноградная улитка (Helixpomatia) относится к классу брюхоногих моллюсков (Gastropoda Mollusca). Она обладает рядом хозяйственно-полезных качеств, благодаря которым начато активное её разведение (гелицекуль-тура) в европейских странах и России. Виноградная улитка (Helix pomatia) имеет питательное и диетическое мясо, содержащее комплекс незаменимых аминокислот и низкий процент жира [1].
В отличие от морских обитателей раковин, например, устриц, сухопутные улитки не вызывают аллергических реакций [2]. Биологически
активные вещества улитки (аллантоин, коллаген, эластин, альфа-гидроксикислоты и др.) используются в фармацевтике и косметологии. Секрет слизи улиток оказывает благотворное действие на кожу - аллантоин стимулирует регенерацию, протеины успокаивают и смягчают, коллаген и эластин укрепляют кожу, витамины А, С, Е стимулируют синтез коллагена и процесс обновления кожи, альфа-гидроксикислоты являются эксфоли-антом [3].
В Европе помимо использования мяса и слизи пользуется спросом икра виноградных улиток, причем цены на этот товар сопоставимы со
стоимостью цен на икру лососёвых и осетровых рыб (100 - 200 евро за 100 г).
Виноградная улитка является хорошим объектом разведения и выращивания. Однако работ в направлении её доместикации и селекции практически не проводится. Целью настоящей работы было доместицировать виноградную улитку и создать племенное стадо для селекции, а также провести морфометрическую и физиолого-имму-нологическую оценку одомашненных особей.
Метериалы и методы исследований
Объектом исследования являлась виноградная улитка Helixpomatia L. Маточное стадо улитки содержалось на ограниченной опытной территории площадью 11 соток. Размножение и зимовка маточного поголовья проводились в условиях невысокой плотности посадки. Для оценки возможностей опытного выращивания виноградной улитки по интенсивной технологии создавалась плотность посадки до 159 шт./м2.
Конхиометрические признаки определялись путем промеров с помощью штангенциркуля. Определялась толщина раковины, что отражает кальциевый обмен, показатель выхода полезной пищевой продукции вычисляли в % от общей массы с раковиной. Плодовитость определяли по количеству икринок в кладке. Прочность оболочки икринок оценивали на аппарате Грея. Измерялась масса груза, при котором лопалась икринка.
Гемолимфу отбирали путем пункции сердца через стенку раковины.
Дифференцирование гемоцитов осуществляли в нативной гемолимфе в камере Горяева. Мазки гемолимфы окрашивали по методу Пап-пенгейма.
Фагоцитарная активность гемоцитов виноградной улитки определялась цитохимическим методом с бромфеноловым синим по М.Г. Шу-бичу [4], адаптированным для беспозвоночных Г.И. Прониной [5]. Определялось содержание неферментного катионного белка в лизосомах фагоцитирующих клеток.
Микроскопические исследование гемолимфы виноградной улитки проводили с помощью цифрового микроскопа Optica DM-15.
Результаты исследований статистически обработаны при помощи Excel пакета Microsoft Office с использованием t-теста, P < 0,05.
Результаты исследований
На первых этапах доместикации виноградной улитки было создано одомашненное стадо в количестве около 600 особей. В течение 5 поколений отбирались стрессоустойчивые особи для дальнейшего разведения и выращивания, совершенствовалась технология кормления и условия содержания улитки в условиях интенсивной нагрузки, что позволило снизить отход с 30 до 5%.
Виноградная улитка - растительноядный полифаг. Были выявлены оптимальные пищевые предпочтения виноградной улитки в условиях средней полосы России, на основании которых проводился подбор предпочитаемых улиткой кормов. В условиях средней полосы России улитка охотно поедает овощи (морковь, капусту, свёклу, кабачки, тыкву), а также листья кабачков, сныть, клевер, одуванчик и другую травянистую растительность. Улитки также хорошо потребляют хлеб, геркулес, пшено.
Наряду с подбором рациона осуществлялся поиск оптимальных параметров освещенности и влажности для маточного стада улитки, содержащихся в садке при высоких плотностях посадки.
Для жизнедеятельности виноградная улитка, в том числе для образования слизи, нуждается в высокой влажности (оптимальные параметры не менее 75-95%). В сухую погоду виноградная улитка прячется под камнями, в тени растений или в сыром мху. В засушливое лето виноградная улитка становится вялой, бездеятельной, впадает в оцепенение. После выпадения осадков выходит из спячки [6]. Влажность почвы в районе содержания стада улитки поддерживалась путем регулярного дождевания.
Виноградная улитка избегает прямых солнечных лучей, наиболее активна в течение ночи. Освещенность на опытном участке регулировалась системой навесов и укрытий в виде деревянных щитов.
При осеннем понижении температуры воздуха улитка уходит за зимовку. Зимует она на месте выпаса, закапываясь в почву на глубину 5 - 10 см [6], поэтому при пастбищном выращивании не требуется дополнительных площадей для зимовки.
Виноградные улитки являются гермафродитами, однако при спаривании происходит обмен половыми продуктами, поэтому требуемое для получения потомства суммарное количество производителей в 2 раза меньше, чем при разведении разнополых особей.
Рисунок 1. Спаривание виноградной улитки
Figure 1. Mating of a grape snail
При непосредственном акте оплодотворения особи прижимаются друг к другу подошвами (риа 1).
Их размножение происходит весной - летом [7, 8]. Через 1 - 2 недели после спаривания улитки зарываются в землю и откладывают икру примерно на глубине 3 см [6].
Икра улитки крупная массой 0,14±0,01 г и диаметром 6,1±0,4 мм (табл. 1). Результаты исследования показали, что прочность оболочки икры виноградной улитки ниже, чем у рыб, и составляет 136,3±10,1 г (на аппарате Грея). Показатель является важным параметром качества продукции и для оценки икры улитки использовался впервые. С одной стороны, относительно низкая прочность оболочки икры улитки свидетельствует о большей уязвимости. С другой стороны, это качество дает возможность эмбрионам насыщаться через оболочку икринки влагой, находящейся в почве.
На рисунке 2 показаны размеры улитки и её икринок.
Для оценки возможности роста в искусственных условиях определялись конхиометри-ческие признаки улитки (табл. 2).
Результаты показали низкую вариабельность размерно-весовых показателей виноградной улитки, что позволяет создать устойчивую однородную популяцию при выращивании в искусственных условиях.
Кровеносная система виноградной улитки незамкнутая. Циркулирующая жидкость представлена гемолимфой. Дыхательным пигментом является гемоцианин [2, 9, 10]. Данные по клеточному составу гемолимфы единичных исследователей противоречивы, единая классификация отсутствует. В частности, А.А. Присный [4] предложил классификацию, основываясь не только на морфологических, но и на функциональных свойствах гемоцитов: степени их адгезионной и поглотительной способности; качественных показателей гранул и вакуолей; реакции на осмотическую нагрузку.
Для оценки иммуно-физиологического состояния Helix pomatia L. были использованы гематологические и цитохимические показатели гемолимфы виноградной улитки. Было установлено, что клетки гемолимфы - гемоциты (рис. 3) нестойки in vitro, поэтому их дифференциальный подсчет для гемоцитарной формулы следует проводить в камере Горяева непосредственно после отбора гемолимфы.
Нами определено 3 типа гемоцитов (Гц) улитки Helix pomatia L. аналогично гемоцитам десятиногих ракообразных: Гц I - агранулоциты (размеры 5-8х5-8 мкм), Гц II - полугранулоциты (размеры 11-14^14-17 мкм) и Гц III - грануло-циты (размеры 18-19х 19-21 мкм). Найденное рядом авторов соотношение гемоцитов I и гемо-
Таблица 1. Показатели плодовитости виноградной улитки Helix pomatia Table 1. Indicators of fertility of the grape snail Helix pomatia
Показатели / Indicators Значение / Value
Диаметр икринки, мм / Egg diameter, mm 6,1±0,4
Масса икринки, г / Egg weight, g 0,14±0,01
Кол-во икринок в кладке, шт. (плодовитость) / Number of eggs in a clutch, pcs. (fertility) 39,0±4,0
Прочность оболочки икры, г (на аппарате Грея) / Caviar shell strength, g (on the Gray apparatus) 136,3±10,1
Рисунок 2. Размножение виноградной улитки: А - размер улитки; Б - размеры икринок Figure 2. Reproduction of the grape snail: A - the size of the snail; B - the size of the eggs
Рисунок 3. Гемоциты виноградной улитки: А - в камере Горяева; Б - в покрашенных по Пап-пенгейму мазках
Figure 3. Hemocytes of a grape snail: A - in Goryaev's chamber; B - in Pappenheim-colored strokes
Таблица 2. Размерно-весовые показатели виноградной улитки Helix pomatia Table 2. Dimensional and weight characteristics of the grape snail Helix pomatia
Показатели / Indicators Значение / Value Коэффициент вариабельности Cv / Coefficient of variability Cv
Масса улитки, г / Snail weight, g 21,78±0,57 13,2
Масса раковины, г / Shell mass, g 4,47±0,52 28,6
Промер раковины А, мм / 34,97±0,57 8,2
Sink measurement A, mm
Промер раковины В, мм / 38,98±0,43 5,5
Sink measurement B, mm
Промер раковины С, мм / 29,0±0,43 7,4
Sink measurement С, mm
Толщина раковины, мм / 1,0±0,09 48,7
Shell thickness, mm
Выход товарной продукции, % / Output of marketable products,% 19,6±1,0 13
Рисунок 4. Гемоциты виноградной улитки при определении СЦК (в реакции с бромфеноло-вым синим)
Figure 4. Hemocytes of grape snail in the determination of CCV (in reaction with bromophenol
blue)
цитов II как 90% и 10% [11, 12, 13] возможно связано с неодинаковым по скорости разрушением этих типов клеток во внешней среде.
О цитохимических свойствах гемолимфы улитки мы судили по содержанию неферментного катионного белка в лизосомах в реакции с бромфеноловым синим (рис. 4), все типы гемо-цитов виноградной улитки обладают способностью к фагоцитозу, что согласуется с данными других исследователей лишь отчасти.
Так, А.А. Присный, Т.А. Пигалева и С.В. Кулько [11] in vitro с использованием культуры клеток Saccharomyces cerevisiae выявили, что наиболее активно в процессе фагоцитоза участвуют клетки типа I, в то время как гемоциты типа II большей частью участвовали в процессах адгезии клеток Saccharomyces cerevisiae на своей поверхности.
Таким образом, показатели гемоцитарной формулы и лизосомально-катионного теста можно использовать для оценки состояния здоровья и профилактики заболеваний виноградной улитки при доместикации. Проводятся дальнейшие исследования по иммуно-физиологической оценке виноградной улитки.
Выводы:
Виноградная улитка Helix pomatia L. успешно прошла первые этапы доместикации, в том числе в условиях интенсивной технологии.
В результате отбора стрессоустойчивых особей, совершенствования технологии кормления и содержания снизился отход улиток с 30 до 5%.
В настоящее время создано 5-е поколение. Сформировано ремонтно-маточное стадо виноградной улитки.
Морфометрическая оценка показала низкую вариабельность размерно-весовых показателей виноградной улитки, что позволяет создать устойчивую однородную популяцию при выращивании в искусственных условиях
В результате физиолого-иммунологической оценки выявлено, что клетки гемолимфы представлены 3-мя типами: агранулоциты, полугранулоциты и гранулоциты. Все гемоциты содержат лизосо-мальный катионный белок, что свидетельствует об их фагоцитарной способности. Физиологические параметры: показатели гемоцитарной формулы и лизосомально-катионного теста, послужат в дальнейшем для оценки состояния здоровья и профилактики заболеваний виноградной улитки.
Список литературы / References
1. Супрунович А.В., Макаров Ю.Н. Пищевые беспозвоночные. - Наукова думка: Киев, Украина, 1990. - 264 с. [Suprunovich A.V., Makarov Yu.N. Food invertebrates. - Nau-kova dumka: Kiev, Ukraina, 1990. - 264 p.]
2. Holde K.E., Miller K.I. Hemocyanins // Adv Protein Chem. - 1995. - issue 47. - pp. 1-81. DOI: 10.1016 / s0065-3233 (08) 60545-8.
3. Корпачев В.В. Целебная Фауна. - М.: Наука, 1989. - 19 с. ^orpachev V.V. Healing Fauna. -Nauka: Moskva, Rossiya, 1989. - 19 p.]
4. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бром-фенолового синего // Цитология. - 1974. -№ 10. - С. 1321-1322. [Shubich M.G. Detection of Cationic protein in the cytoplasm of leukocytes using bromophenol blue // TSitol-ogiya. - 1974. - issue 10. - pp. 1321-1322.]
5. Пронина Г.И. Физиолого-иммунологиче-ская оценка культивируемых гидробион-тов: карпа, сома обыкновенного, речных раков / Диссертация на соискание ученой степени доктора биол. наук, РГАУ МСХА им. К.А.Тимирязева, Москва, 2012. [Pronina G.I. Physiological and immunological assessment of cultured hydrobionts: carp, common catfish, river crayfish // Dissertatsiya na soiskanie uchenoy stepeni doctor biologiches-kikhnauk., RGAU MSKHA im. K.A. Timi-ryazeva, Moskva, 2012.]
6. Догель В.А. Зоология беспозвоночных / Учебник для ун-тов, 7-е изд. - М.: Высшая школа, 1981. - 606 с. [Dogel V.A. Invertebrate Zoology / A textbook for universities, 7th ed. - Vysshaya shkola: Moskva, Rossiya, 1981. - 606 p.]
7. Артемьева Е.А., Семенов Д.Ю. Виноградная улитка Helix pomatia L. (Mollusca, Gastropoda, Helicidae) - реакклиматизирован-ный вид малакофауны Ульяновской области / Сб. науч. тр. Природа Симбирского Поволжья. - Ульяновск: Корпорация технологий продвижения, 2004. - № 5. - С. 6062. [Artemyeva E.A., Semenov D.Yu. Grape snail Helix pomatia L. (Mollusca, Gastropoda, Helicidae) - reacclimatizing kind of mollusk fauna of the Ulyanovsk region. Sb. nauch. tr. Priroda Simbirskogo Povolzh'ya. - Ul'ya-novsk: Korporatsiya tekhnologij prodvizhe-niya, 2004. - issue 5. - pp. 60-62.]
8. Ханше Карл. Выращивание съедобных улиток // Международный агропромышленный журнал. - 1991. - № 6. - С. 71-72. [Khanum Carl. The farming of edible snails. Mezhdunarodnyj agropromyshlennyj zhurnal. - 1991. - № 6. - pp. 71-72.]
9. Anupam Nigam, Jimmy Ng., Ennacheril Tr. The Molecular Evolution of Arthropod and Molluscan Hemocyanin Evidence for Apo-morphic origin and convergent evolution in O2 hinding sites. - 1997. - issue 41. - pp. 199228.
10. Ellerton D.H., Husain N.R. Extraction, Isolation, Purification and Characterization of Hae-mocyanin from Archachatinamarginata In Structure and Function of Invertebrate Oxygen Carriers, 1st ed. - Vinogradov S.N., Kapp O.H. Springer; Softcover reprint of the original: San Francisco, USA, 1991. - pp. 37-48.
11. Присный А.А., Пигалева Т.А., Кулько С.В. Морфофункциональные особенности форменных элементов гемолимфы виноградной улитки (Helixpomatia) // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Естественные науки. -2010. - Т. 13. - № 21 (92). - С. 73-76. [Prisny A.A., Pigaleva T.A., Kulko S.V. Morphological and functional features of the shaped elements of the hemolymph of the grape snail (Helix pomatia) // Nauchnye vedomosti Bel-gorodskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Estestvennye nauki. - 2010. - vol. 13. - issue 21 (92). - pp. 73-76.].
12. Cheng T.C. A classification of molluscan he-mocytes based on functional evidences // Comparative Pathbiology. - 1984. - issue 6. -pp.111-146.
13. Yoshino T.P. The ultrastructure of circulating he-molymph cells of the marine snail Cerithidea cal-ifornica (Gastropoda: Prosobranchiata) // Journal of morphology. - 1976. - issue 150 (2). - pp. 485494. DOI: 10.1002/jmor.1976.150.2.485.
DOMESTICATION, MORPHOMETRIC AND PHYSIOLOGICAL-IMMUNO-LOGICAL ASSESSMENT OF HELIX POMATIA
Domestication of the Helix pomatia grape snail
G.I. Pronina*, A.B. Petrushin, N.Yu. Koryagina, L.A. Rozumnaya
Federal state budgetary scientific institution all-Russian research Institute of irrigation fish farming Russia, 142460, Moscow region, Noginsky district, r/p im. Vorovsky e-mail: g.pronina@rgau-msha.ru
The grape snail Helix pomatia is a good breeding and cultivation object. However, there is practically no work in the direction of domestication and selection. In this regard, the purpose of this work was to domesticate the grape snail and create a breeding herd for selection. During 5 generations, stress-resistant individuals were selected for further breeding and rearing, the feeding technology and conditions of keeping the snail under intensive load conditions were improved, which made it possible to reduce mortality from 30 to 5%. At present, a repair brood herd of grape snails has been formed in the amount of 600 individuals. The low variability of the size and weight parameters of the grape snail makes it possible to create a stable homogeneous population when grown under artificial conditions. The parameters revealed as a result of physiological and immunological assessment: indicators of the hemocytic formula and lysosomal-cationic test, will serve in the future to assess the health status and prevent diseases of the grape snail.
Key words: dgrape snail Helix pomatia, domestication, stress resistance, physiological and imunological assessment.
