Дизайн системы олигонуклеотидов и оптимизация условий амплификации ecf-генов бактерий рода Salinicola семейства halomonadaсеае Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2017 БИОЛОГИЯ Вып. 3

МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 579.25: 577.213.3: 579.84

Л. Н. Ананьинаa, Е. А. Шестаковаa, А. А. Пьянковаа, Е. Г. ПлотниковааЬ

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия b Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия

ДИЗАЙН СИСТЕМЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ АМПЛИФИКАЦИИ еЫ- ГЕНОВ БАКТЕРИЙ РОДА SALINICOLA СЕМЕЙСТВА HALOMONADA CEAE

Осуществлен поиск нуклеотидных последовательностей ect-оперона бактерий сем. Halomonadaceae в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации (США) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ выравненных 33 нуклеотидных последовательностей представителей родов Salinicola, Halomonas, Chromohalobacter, Kushneria, Cobetia и Halotalea позволил обнаружить консервативные области. К ним была разработана система олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагмента ect-оперона, включающего гены: ectA, кодирующий L-2,4-диаминобутир-атацетилтрансферазу, и ectB, детерминирующий L-2,4-диаминобутиратаминотрансферазу. Экспериментально подобраны условия полимеразной цепной реакции и состав ПЦР-смеси для амплификации участка ect-оперона на ДНК матрице бактерий рода Salinicola.

Ключевые слова: олигонуклеотиды; ect-гены; полимеразная цепная реакция; Salinicola.

L. N. Anan'inaa, E. A. Shestakovaa, A. A. Pyankovaа, E. G. Plotnikovaа,ь

a Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation b Perm State University, Perm, Russian Federation

DESIGN OF OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM AND OPTIMIZATION OF CONDITIONS FOR AMPLIFICATION OF ect-GENES OF BACTERIA OF GENUS SALINICOLA OF HALOMONADACEAE FAMILY

Search for nucleotide sequences of ect-operon from bacteria of Halomonadaceae family was carried out in open database of National Center for Biotechnology Information (USA) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Analysis of aligned 33 nucleotide sequences from the members of genera Salinicola, Halomonas, Chromohalobacter, Kushneria, Cobetia and Halotalea allowed revealing conserved regions. The system of oligonucleotide primers was designed to these in order to amplify the ect-operon fragment including genes: ectA, which encodes L-2,4-diaminobutyrate acetyltransferase and ectB, which determines L-2,4-diaminobutyrate aminotransferase. Conditions for polymerase chain reaction were experimentally selected, as well as PCR-mixture composition to amplify the ect-operon site on DNA of bacteria of genus Salinicola.

Key words: oligonucleotides; ect-genes; polymerase chain reaction; Salinicola.

Род Salinicola семейства Halomonadaceae был предложен в 2007 г. по результатам исследования таксономического положения штамма бактерий, выделенного из образца почвы территории промышленной разработки Верхнекамского месторождения солей [Ананьина и др., 2007]. Филогенетическая обособленность нуклеотидной последовательности 16S рДНК и фенотипические отличия исследованного штамма от представителей других родов сем. Наlomonadaceae позволили отнести его

к новому виду нового рода Salinicola socius. Позднее было пересмотрено таксономическое положение видов Halomonas salaria и Chromohalobacter salarius, которые были реклассифицированы как S. salaria и S. halophilus, соотвественно [de la Haba et al., 2010]. Недавно были описаны новые виды рода S. acroporae, S peritrichatus S. rhizosphaerae [Huo et al., 2013; Lepcha et al., 2015; Raju et al., 2016]. Представители рода обнаружены в засоленной почве, ризосфере мангра Avicennia marina L.,

© Ананьина Л. Н., Шестакова Е. А., Пьянкова А. А., Плотникова Е. Г., 2017

297

морских солеварнях, морях и океане [Ананьина и др., 2007; Aguilera et al., 2007; Kim et al., 2007; Huo et al., 2013; Raju et al., 2016].

Известно, что для выживания в условиях засоления бактерии поддерживают осмотический баланс, как правило, за счет синтеза de novo «совместимых веществ», основным из которых для эубактерий является эктоин. В настоящее время охарактеризованы генетические и биохимические системы биосинтеза эктоина бактерий родов Chromohalobacter и Halomonas семейства Halomo-nadaceae [Ono et al., 1999; Calderón et al., 2004; Cai et al., 2011; Schwibbert et al., 2011; Pastor et al., 2013], в то время как бактерии рода Salinicola остаются менее изученными [Olsson et al., 2017]. Синтез эктоина начинается реакцией трансамини-рования L-аспартат-р-полуальдегида с последующим ацетилированием образующегося диаминобу-тирата (ДАБ) и завершается циклизацией Ny-ацетил-Ь-2,4-диаминобутирата в эктоин. У бактерий семейства Halomonadaceae ген ectA, кодирующий L-2,4-ДАБацетилтрансферазу, и гены ectB и ectC, детерминирующие L-2,4-ДАБамино-трансферазу и эктоинсинтазу, соответственно, расположены в перечисленной последовательности и организованы в единый оперон ectABC [Ono et al., 1999; Calderon et al., 2004].

В настоящее время в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) представлены нуклеотидные последовательности ect-оперона четырех штаммов бактерий рода Salinicola, из них типовым штаммом валидно описанного вида является лишь Salinicola socius SMB35T. Таким образом, имеющаяся информация не дает представления о разнообразии ect-генов бактерий рода Salinicola. Ввиду этого представляется актуальным амплификация и последующее определение нуклеотидной последовательности ect-генов типовых штаммов рода Salinicola.

Из литературных источников известны пары вырожденных праймеров для амплификации ect-генов бактерий семейства Halomonadaceae [Kuhlmann, Bremer, 2002; Okamoto et al., 2004; Ананьина, Плотникова, 2011]. Проведенный нами анализ данных праймеров in silico показал, что представленные в базе данных NCBI нуклеотид-ные последовательности ect-генов бактерий рода Salinicola имеют несовпадения в З'-области прай-меров, что, в свою очередь, может затруднить амплификацию. Отсюда следует очевидная потребность в новой эффективной системе олигонуклео-тидов для амплификации и секвенирования интересующих нас генов.

Целью данной работы явилась разработка и оптимизация системы вырожденных праймеров для амплификации и секвенирования ect-генов у типо-

вых штаммов валидных видов рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Объектами исследования были типовые штаммы узаконенных видов S. salarius DSM 1844T, S. peritrichatus JCM 18795T, S. acroporae JCM 30412T, S. halophilus CECT 5903T, S. socius SMB35T.

Среды и условия культивирования

Минеральная среда Раймонда (г/л деионизиро-ванной воды): NH4NO3 - 2.0, MgSO4x7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2.0, Na2HPO4 - 3, CaCl2x6H2O - 0.01, Na2CO3 - 0.1, pH - 7.0 [Raymond, 1961].

Агаризованная богатая среда Раймонда следующего состава (г/л среды Раймонда): триптон -5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 30, агар - 15.

Культивирование бактерий проводили на ага-ризованной богатой среде Раймонда в термостати-руемом шкафу ТС-1/80 СПУ (Россия) при температуре 28оС.

Молекулярно-генетические и

биоинформационные методы исследования

Геномную ДНК выделяли методом щелочного лизиса целых клеток 1 колонии бактериальной культуры, которую вносили в эппендорф, содержащий 100 мкл 0.05 М раствора NaOH, перемешивали и далее выдерживали 15 мин. при 95°С, после этого замораживали при -20°С в течение 15 мин. Процедуру последовательного замораживания и оттаивания повторяли 3 раза [Versalovic et al., 1994].

Амплификацию ect-генов на матрице ДНК исследуемых штаммов проводили на приборе С1000 Touch («Bio-Rad», США).

ПЦР выполняли в 25 мкл смеси, состоящей из 1х буфера для Taq-полимеразы («Синтол», Россия), 0.25 мМ дНГФ, 1.5 мМ MgCl2, 0.004 мг БСА, 10 пкмоль каждого праймера, 2 ед. акт. Taq-полимеразы («Синтол», Россия) и 20 нг геномной ДНК. Кроме того, была использована ПЦР-смесь того же состава, в которой количество каждого праймера было увеличено до 50 пкмоль.

Процедура ПЦР включала начальную денатурацию при 95°С, которая длилась 5 мин. Далее следовали 30 циклов, состоящих из последовательно повторяющихся шагов: денатурации при 94°С в течение 30 сек., отжига праймеров при температурах 38, 39, 42, 46, 50, 54, 57 или 58°С на протяжении 30 сек., каждый цикл завершала элонгация при 72°С длительностью 1 мин. 20 сек. После 30-го цикла следовала терминальная элонгация

при 72°С продолжительностью 5 мин. Условия последующих реакций были теми же, но температура отжига праймеров составляла 50°С.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в 0.5х ТВЕ-буфере в напряжении электрического поля 5.0 V/см в течение 40 мин. ДНК была визуализирована после окрашивания бромистым этидием (0.5 мгк/мл) в проходящем УФ-свете и документирована системой Gel Doc XR («BioRad», США) для преобразования сигналов в цифровые данные. Отображаемая на дисплее электрофореграмма, состояла из пикселей. Каждый пиксель имел координаты X и Y, предоставляющие информацию о горизонтальном и вертикальном положении на электрофореграмме, и значение Z - интенсивность сигнала пикселя. Полученные электрофореграммы обрабатывали с

Секвенирование генов проводили с помощью разработанных праймеров, Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v3.1 («Thermo Fisher Scientific», США) на приборе Genetic Analyzer 3500xl («Thermo Fisher Scientific», США), следуя инструкциям фирмы-производителя.

Биоинформационное обеспечение. Публичная база данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (https://www.ncbi. nlm.nih.gov). Пакет программ BioEdit (www.mbio.ncsu. edu), позволяющий выравнивать нуклеотидные последовательности. Пакет программ OligoAnalyzer 3.1 (https://eu.idtdna.com/calc/analyzer) для определения термодинамических и структурных характеристик праймеров. Подбор праймеров осуществляли, следуя рекомендациям [Патрушев, 2004; Designing PCR primers and probes https://eu.idtdna.com/pages/decoded/ decoded-

articles/pipet-tips/decoded/2013/10/21/ designing-pcr-primers-and-probes].

Результаты и их обсуждение

Конструирование праймеров

Поиск генетических локусов, кодирующих ферменты синтеза эктоина, осуществляли в геномах умеренных галофильных бактерий сем. Halomonadaceae, депонированных в публичной базе данных NCBI (США). В анализ были включены нуклеотидные последовательности 33 штаммов бактерий представителей родов Halomonas, Chromohalobacter, Cobetia, Kushneria, Halotalea и Salinicola.

С применением пакета программ BioEdit нук-леотидные последовательности генов ect-оперона были выравнены (рис. 1). Далее осуществляли поиск консервативных областей длиной от 16 (минимально допустимая длина праймера) до 20 нуклео-тидов, у которых на 3'-конце предполагаемого

праймера первые два нуклеотида были одинаковыми для всех последовательностей, а третий нук-леотид имел не более 2 замен. На 5'-конце предполагаемого праймера допускали наличие позиций, имеющих до 4 нуклеотидных замен.

а

Ch jap

s. С?

in SMB3 5 Salinicola йтА МНЗР.З-1 Salinicola sp . MIT1003 Salinicola 3alariu|MA0133 9 Cobetia ämphilecti KMM29É Cobetia зр. UCD-24C Cobetia CEU3tat0CLU[i Jül KushnetiaJàu'rantia DSM213^p ■rfalotalea alkalile«Üá IHB рЩ13600 H elongata BSM2581 П salina BÉ H campani'ë.ijsis LS21

h 1.' jli V_ en:___: LC1

H halocynthiae r^W.^.V H. huangheensis EJGMM-îffâï H anticariensis И335

_h is

Salinicola iMlinicola

CJ

MH3R3-J. Salinicola зр. MIT10G3 Salinicola salarius 1AG133 9 Cobetia amphilecti KMM296 Cobetia зр. UCD-24C Cobetia crustatocuin JOl E'ushnecia i - ; : 'T Slt'l : ' ■

■Äalotaiea áijialilenta IHB Б H elongata DSM2581

alin

Б S

:j3¿г LS21 tivboliviensis ICI H huangheensis BJGMM-E45 H anticari ensis FP3 5

^J 230

CGGACGAA CGGACGAA CGGACGAA CGACGGAA CCACCGAG CGACGGAA CGACAGAA CAGATGAG CAGATGAG CAGATGAA CACTTTCT 13 600 CTGACGAG CCAACGAA ll'CAA.C.lXC CAAATGAA TCAATGAA CCAATGAA ССАА'СЗДл CCGACGAG

Рис. 1. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ectA- (а) и ectB-генов (б) представителей родов Halomonas, Chromohalobacter, Cobetia, Kushneria, Halotalea и Salinicola семейства Halomonadaceae :

консервативные нуклеотиды выделены цветом, участки, комплементарные праймерам, ограничены линиями и стрелками, указывающими направление амплификации

Было обнаружено две области, соответствующие перечисленным параметрам: позиции 253— 269 ectA-гена и позиции 880—895 ectB-гена согласно нумерации Chromohalobacter salexigens DSM 3043T (AJ011103) (рис. 1). Принимая во внимание в выбранных регионах вариабельные нуклеотидные позиции, были сконструированы следующие праймеры: EAh 5' GGITTYGTITCIGGYTA 3' и EBh 5' CICGRAAIGTRCCGTT 3'. Пара праймеров имела допустимую разницу в содержании ГЦ-пар (до 6%). Отличие между минимальными и максимальными значениями температур плавления праймеров составило 3.4 и 2.1оС, соответственно. Праймеры не образовывали тугоплавких шпилек со свободной энергией Гиббса менее -3 ккал^моль-\ Однако были выявлены гомо- и гетеродимеры, образующиеся за счет спаривания от 2 до 5 нук-леотидов, характеризующиеся AG более -9 ккал^моль-1. Биохимические, термодинамические и структурные характеристики подобранных прай-меров представлены в таблице.

б

Характеристика праймеров

Параметр EAh EBh

Длина, п.н. 17 16

Степень вырожденности* 4 4

Содержание ГЦ, % 50 56.2

Температура плавления, оС мин. - макс. (средняя) 42.2—57.6 (50.1) 45.6—59.7 (52.5)

Тугоплавкие шпильки AG < -3 ккал^моль"1 - -

Количество гомодимеров, мин. - макс. значение AG (ккал^моль"1), в скобках указано количество спаренных оснований 18, AG -0.96 ккал^моль"1 (2) — AG -8.19 ккал^моль"1 (4) 17, AG -2.24 ккал^моль"1 (2) — AG -8.45 ккал^моль"1 (4)

Количество гетеродимеров, значение AG (ккал^моль"1), в скобках указано количество спаренных оснований 17, AG -1.46 ккал^моль"1 (2) — AG -9.97 ккал^моль"1 (5)

Порядковый № нуклеотида от начала гена, соответствующего 5'-концу праймера согласно нумерации Ch. salexigens DSM 3043T (AJ011103), в скобках указано название гена 253 (ectA) 895 (ectB)

* Степень вырожденности праймера рассчитывали, перемножая количество вариантов нуклеотидов в каждой позиции.

Апробирование праймеров

С целью оптимизации условий полимеразной цепной реакции провели несколько реакций, отличающихся значениями температуры на этапе отжига. Установлено, что наибольшая концентрация продукта ПЦР была получена при температуре отжига праймеров 50°С (рис. 2). Далее провели тестирование праймеров на ДНК матрице типовых штаммов валидных видов рода Salinicola в реакционной смеси того же состава при температуре отжига 50°С. Для штаммов S. salarius DSM 1844T, S. peritrichatus JCM 18795T, S. acroporae JCM 30412T получен один продукт длиной около 1200 п.н., соответствующий рассчитанной длине такового Ch. salexigens DSM 3043T В то время как на ДНК матрице штамма S. socius SMB35T амплификация привела к синтезу одного неспецифического фрагмента длиной около 200 п.н., отличающегося от ожидаемой.

Для штамма S. halophilus CECT 5903T ПЦР-продукт не был синтезирован (рис. 3а). Используемые праймеры являются вырожденными, т.е. представляют смесь комбинаций нуклеотидных последовательностей в неизвестном соотношении. Вероятно, концентрация варианта олигонуклеотида, комплементарного нуклеотидным последовательностям генов-мишеней штаммов S. halophilus CECT 5903T и S. socius SMB35T, меньше других. Поэтому была увеличена концентрация олигонуклеотидов в ПЦР смеси с 10 пкмоль до 50 пкмоль, что привело к синтезу искомого фрагмента на матрице ДНК штаммов S. socius SMB35T и S. halophilus CECT 5903T (рис. 3б). Но на матрице ДНК штамма S. socius SMB35T были синтезированы неспецифические фрагменты размером около 800 п.н. и 200 п.н.

а

I I

М 1 2 3 4 5 6 7 8 М б

то 2500 -1

I-

х

о

2 |—

<| 2000 -

& _

о ^

¡2 Ц= 1000 -

о __

х

Ю

s 500 -

х

о

IX

S 0 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I 1 1 I

38 39 42 46 50 54 57 58 Температура отжига праймеров, оС

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ect-оперона штамма S. peritrichatus JCM 18795T при разных температурах отжига праймеров (а) и концентрация ПЦР-продукта, оцененная по интенсивности свечения амлифицированного фрагмента ДНК (б):

1 — 38°С, 2 — 39°С, 3 — 42°С, 4 — 46°С, 5 — 50°С, 6 — 54°С, 7 — 57°С, 8 — 58°С; М — маркер молекулярных длин 100 bp Plus («Thermo Fisher Scientific, США»)

Для подтверждения амплификации фрагмента ect-оперона была определена нуклеотидная последовательность ПЦР-продуктов типовых штаммов S. salarius DSM 1844T, S. peritrichatus JCM 18795T,

S. acroporae JCM 30412T, S. halophilus CECT 5903T. Последующий сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с депонированными в публичных базах ect-генами с помощью программы Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) выявил их гомологию с ect-генами бактерий рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

M 1 2 3 4 5 К M б

К

М 1 2 3 4 5 К Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ect-оперона штаммов рода Salinicola при концентрации праймеров 10 пкмоль (а) и 50 пкмоль (б):

1 — S. peritrichatus JCM 18795T, 2 — S. acroporae JCM 30412T, 3 — S. salarius DSM 1844T, 4 — S. socius SMB35T, 5 — S. halophilus CECT 5903T, M — маркер молекулярных длин 100 bp Plus («Thermo Fisher Scientific, США »), K — отрицательный контроль без ДНК

Заключение

Таким образом, предложенную систему праймеров можно использовать для амплификации фрагмента ect-оперона у бактерий рода Salinicola семейства Halomonadaceae.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Министерства образования и науки Пермского края в рамках проекта № 17-44590178.

Библиографический список

Ананьина Л.Н. и др. Salinicola socius gen. nov., sp. nov. - новая умеренно галофильная

бактерия из ассоциации микроорганизмов, утилизирующей нафталин // Микробиология. 2007. Т. 76, № 3. С. 369-376.

Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Новая система олигонуклеотидов для амплификации ес^генов бактерий семейства Нalomonadaceae // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. Т. 4, № 1. С. 17.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. T. 1: Генная белковая инженерия. М.: Наука, 2004. 526 с.

Aguilera M. et al. Chromohalobacter salarius sp. nov., a moderately halophilic bacterium isolated from a solar saltern in Cabo de Gata, Almería, southern Spain // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. Vol. 57. P. 1238-1242.

Cai L. et al. Comparative genomics study of polyhy-droxyalkanoates (PHA) and ectoine relevant genes from Halomonas sp. TD01 revealed extensive horizontal gene transfer events and co-evolutionary relationships // Microb. Cell Fact. 2011. Vol. 10. P. 115. URL: http://www.microbialcellfactories.com/content/10/1/8 8.

Calderón M.I. et al. Complex regulation of the synthesis of the compatible solute ectoine in the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043T // Microbiology. 2004. Vol. 150. P. 3051-3063.

de la Haba R.R. et al. Taxonomic study of the genus Salinicola: transfer of Halomonas salaria and Chromohalobacter salarius to the genus Salinicola as Salinicola salarius comb. nov. and Salinicola halophilus nom. nov., respectively // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. Vol. 60. P. 963-971.

Designing PCR primers and probes URL: https://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/pipettips/decoded/2013/10/21/designing-pcr-primers-and-probes.

Huo Y.-Y. et al. Salinicola peritrichatus sp. nov., isolated from deep-sea sediment // Antonie van Leeuwenhoek. 2013. Vol. 104. P. 55-62.

Kim K.K. et al. Halomonas gomseomensis sp. nov., Halomonas janggokensis sp. nov., Halomonas salaria sp. nov. and Halomonas denitrificans sp. nov., moderately halophilic bacteria isolated from saline water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. Vol. 57. P. 675-681.

Kuhlmann A.U., Bremer E. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68, № 2. P. 772-783.

Lepcha R.T. et al., Comparative 16S rRNA signatures and multilocus sequence analysis for the genus Salinicola and description of Salinicola acroporae

а

sp. nov., isolated from coralAcropora digitifera // Antonie van Leeuwenhoek. 2015. Vol. 108. P. 5973.

Okamoto T. et al. Comparative phylogenetic analyses of Halomonas variabilis and related organisms based on 16s rRNA, gyrB and ectBC gene sequences // Syst. Appl. Microbiol. 2004. Vol. 27, № 3. P. 323-333.

Olsson B.E. et al. Draft genome sequences of strains Salinicola socius SMB35T, Salinicola sp. MH3R3-1 and Chromohalobacter sp. SMB17 from the Verkhnekamsk potash mining region of Russia // Stand. Genomic. Sci. 2017. Vol. 19. P. 1-13. DOI 10.1186/s40793-017-0251-5.

Ono H. et al. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacterium, Halomonas elongate // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 91-99.

Pastor J.M. et al. Role of central metabolism in the osmoadaptation of the halophilic bacterium Chro-mohalobacter salexigens // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 24. P. 17769-17781.

Raju K. et al. Salinicola rhizosphaerae sp. nov., isolated from the rhizosphere of the mangrove Avicennia marina // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016. Vol. 66. P. 1074-1079.

Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Ind. Microbiol. 1961. Vol. 2. P. 23-32.

Schwibbert K. et al. A blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T // Environ. Microbiol. 2011. Vol. 13. P. 1973-1994.

Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Meth. Cell. Mol. Biol. 1994. Vol. 5. P. 25-40.

References

Aguilera M et al. Chromohalobacter salarius sp. nov., a moderately halophilic bacterium isolated from a solar saltern in Cabo de Gata, Almería, southern Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 57 (2007): pp. 1238-1242.

Anan'ina L.N., Plotnikova E.G. [New oligonucleotide primer system for bacterial ect-genes amplification of Halomonadaceae famaly]. Vestnik Uralskoj medicinskoj academiceskoj nauki. V. 4, № 1 (2011): p. 17. (In Russ.).

Anan'ina L.N. et al. [Salinicola socius gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic bacterium from a naphthalene-utilizing microbial association]. Mik-robiologija. V. 76, № 3 (2007): pp. 369-376. (In Russ.).

Cai L. et al. Comparative genomics study of polyhy-droxyalkanoates (PHA) and ectoine relevant genes from Halomonas sp. TD01 revealed extensive hori-

zontal gene transfer events and co-evolutionary relationships. Microb. Cell Fact. V. 10, № 88 (2011): pp. 1-15. Available at:

http://www.microbialcellfactories.com/content/10/1/ 88.

Calderón M.I. et al. Complex regulation of the synthesis of the compatible solute ectoine in the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043T. Microbiology. V. 150 (2004): pp. 3051-3063.

de la Haba R.R. et al. Taxonomic study of the genus Salinicola: transfer of Halomonas salaria and Chromohalobacter salarius to the genus Salinicola as Salinicola salarius comb. nov. and Salinicola halophilus nom. nov., respectively. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 60 (2010): pp. 963971.

Designing PCR primers and probes. Available at: https://eu. idtdna. com/pages/decoded/decoded-articles/pipettips/decoded/2013/10/21/designing-pcr-primers-and-probes.

Huo Y.-Y. et al. Salinicola peritrichatus sp. nov., isolated from deep-sea sediment. Antonie van Leeuwenhoek. V. 104 (2013): pp. 55-62.

Kim K.K. et al. Halomonas gomseomensis sp. nov., Halomonas janggokensis sp. nov., Halomonas salaria sp. nov. and Halomonas denitrificans sp. nov., moderately halophilic bacteria isolated from saline water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 57 (2007): pp. 675-681.

Kuhlmann A.U., Bremer E. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. Appl. Environ. Microbiol. V. 68, № 2 (2002): pp. 772783.

Lepcha R.T. et al. Comparative 16S rRNA signatures and multilocus sequence analysis for the genus Salinicola and description of Salinicola acroporae sp. nov., isolated from coral Acropora digitifera. Antonie van Leeuwenhoek. V. 108 (2015): pp. 59-73.

Okamoto T. et al. Comparative phylogenetic analyses of Halomonas variabilis and related organisms based on 16S rRNA, gyrB and ectBC gene sequences. Syst. Appl. Microbiol. V. 27, № 3 (2004): pp. 323-333.

Olsson B.E. et al. Draft genome sequences of strains Salinicola socius SMB35T, Salinicola sp. MH3R3-1 and Chromohalobacter sp. SMB17 from the Verkhnekamsk potash mining region of Russia. Stand. Genomic. Sci. V. 19 (2017): pp. 113. DOI 10.1186/s40793-017-0251-5.

Ono H. et al. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacterium, Halomonas elongate. J. Bacteriol. V. 181 (1999): pp. 91-99.

Pastor J.M. et al. Role of central metabolism in the Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic

osmoadaptation of the halophilic bacterium Chro- hydrocarbons. Develop. Ind. Microbiol. V. 2

mohalobacter salexigens. J. Biol. Chem. V. 288, (1961): pp. 23-32.

№ 24 (2013): pp. 17769-17781. Schwibbert K. et al. A blueprint of ectoine metabo-

Patrushev L.I. Iskusstvennye geneticeskie sistemy lism from the genome of the industrial producer

[Artificial genetic systems. Vol. 1. Genetic and Halomonas elongata DSM 2581T. Environ.

protein engineering]. Moscow, Nauka Publ., Microbiol. V. 13 (2011): pp. 1973-1994.

2004. 526 p. (In Russ). Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria

Raju K., Sekar J., Vaiyapuri using repetitive sequence-based polymerase chain

Ramalingam P. Salinicola rhizosphaerae sp. nov., reaction. Meth. CeU Mo1. Biol V. 5 (1994): pp.

isolated from the rhizosphere of the 25-4°. mangrove Avicennia marina. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. V. 66 (2016): pp. 1074-1079. П°ступила в редакцию 07.09.2017

Об авторах

Ананьина Людмила Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ORCID: 0000-0003-4721-2863 614081, Пермь, ул. Голева, д. 13; ludaananyina@mail.ru; (342)2808431

Шестакова Елена Анатольевна, инженер лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ORCID: 0000-0002-3494-2886 614081, Пермь, ул. Голева, д. 13; sheanton@mail.ru; (342)2808431

Пьянкова Анна Александровна, инженер лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ORCID: 0000-0003-2210-783Х 614081, Пермь, ул. Голева, д. 13; annpjankva@mail.ru; (342)2808431

Плотникова Елена Генриховна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ORCID: 0000-0002-0107-0719 614081, Пермь, ул. Голева, д. 13; peg_el@mail.ru; (342)2808431

профессор кафедры ботаники и генетики растений

ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614099, Пермь, ул. Букирева, 15

About the authors

Anan'ina Lyudmila Nikolaevna, candidate of biology, researcher of laboratory of molecular microbiology and biotechnology Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS. ORCID: 0000-0003-4721-2863 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; ludaananyina@mail.ru; (342)2808431

Shestakova Elena Anatol'evna, engineer of laboratory of molecular microbiology and biotechnology

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS. ORCID: 0000-0002-3494-2886 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; sheanton@mail.ru; (342)2808431

Pyankova Anna Alexandrovna, engineer of the laboratory of molecular microbiology and biotechnology

Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS.

ORCID: 0000-0003-2210-783X 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; annpjankva@mail.ru; (342)2808431

Plotnikova Elena Genrikhovna, doctor of biology, leading researcher of laboratory of molecular microbiology and biotechnology Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS. ORCID: 0000-0002-0107-0719 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; peg_el@mail.ru; (342)2808431

professor of the Department of botany and plant genetics

Perm State University.

15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990