CC BY
100
© В.И. Чемерилова,
О.А. Секерина, Е.В Кравец, Л.В. Маланушенко
Иркутский государственный университет, г. Иркутск
Ш Исследовали особенности появления морфологических R-вариантов в периодических культурах двух штаммов Bacillus thuringiensis. Показано, что как в оптимальных, так и в стрессовых условиях (рН 9,4) частота появления R-вариантов увеличивается только в стационарной фазе. Флуктуационный тест не выявил зависимости встречаемости вариантов от количества пройденных генераций и количества проанализированных колоний. Большинство из возникающих вариантов являются аспорогенными и акристал-логенными, но не отличаются от исходных S-вариантов по ряду других диагностически значимых для вида признаков. Скрещивания между S- и R-вариантами показали, что присутствие R-вариантов в культуре обеспечивает увеличение эффективности рекомбинации между штаммами разных подвидов.
Ш Ключевые слова: Bacillus thuringiensis; аспорогенные варианты; мутагенез стационарной фазы
ДИССОЦИАЦИЯ У BACILLUS THURINGIENSIS КАК ПРОЯВЛЕНИЕ
«МУТАГЕНЕЗА СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЫ»
ВВЕДЕНИЕ
Расщепление на морфологические варианты клоновых культур многих видов бактерий, исторически получившее название «диссоциация», имеет особое значение у вида энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis, так как приводит к появлению в исходных споро- и кристаллообразующих культурах вариантов с полной или частичной утратой этих важных для промышленного производства биоинсектицидов свойств [14, 24]. Явление описано для многих подвидов Bacillus thuringiensis, и анализ свойств отдельных выщепляющихся морфологических вариантов показал, что с нарушением спорообразования может изменяться целый ряд признаков: кристаллообразование и вирулентность, состав клеточных стенок, характер хемоответа, метаболическая активность, особенности размножения на полных и непитательных средах, антибиотико- и фагорезистентность, УФи осмочувствительность [1—3, 8, 10, 11, 14].
В исследованиях последних лет, проведенных на разнообразных микроорганизмах со сходными процессами расщепления, предполагается, что диссоциация является способом адаптации популяции к меняющимся условиям среды [5, 12]. Для Bacillus thuringiensis этот вопрос остается практически неразработанным. С одной стороны, имеются данные, что процесс диссоциации происходит интенсивней в старых культурах и усиливается при изменениях условий среды, но, с другой стороны, возникающие аспорогенные формы, как правило, не отличаются от исходных большей жизнеспособностью [1, 8, 30]. В проведенных ранее исследованиях нами было показано, что повышение температуры культивирования до 40 оС увеличивает долю недоминантных выщепляющихся морфологических вариантов до 100 %, но это увеличение не связано с селекцией более устойчивых к повышенной температуре форм [13]. Особое внимание в этом исследовании привлек тот факт, что увеличение доли морфологических вариантов наблюдалось только к концу периода культивирования, несмотря на то, что температура была повышена с самого начала.
В настоящем исследовании мы показали, что появление морфологических вариантов в периодических культурах Bacillus thuringiensis при повышенных до 9,4 значениях рН питательной среды (рН средней кишки инфицируемых насекомых) происходит также в стационарной фазе роста и, по-видимому, индуцируется увеличением плотности популяции и истощением пищевых ресурсов. Наличие в культурах морфологических вариантов может способствовать увеличению эффективности генетического обмена даже между клетками, принадлежащими к разным подвидам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали штаммы дикого типа: 49 ssp. dendrolimus (серотип И4а4Ь) и 2002 ssp. thuringiensis (серотип H1), выделенные из при-
родных популяций сибирского шелкопряда и хранящиеся в коллекции музея микробиологии Иркутского государственного университета. Оба штамма формировали гладкие блестящие колонии белого цвета; клетки образовывали споры и кристаллы (Б-варианты). В результате диссоциации в исходных культурах появлялись Н-варианты, формирующие колонии серого цвета, с матовой поверхностью, олиго- или аспорогенные, акристаллические. Для исследования физиолого-био-химических свойств были взяты Н-варианты, выделенные при разных условиях культивирования штаммов 49 и 2002 и характеризующиеся 0—3 %% уровнем образования спор и отсутствием кристаллов токсина. В экспериментах по гибридизации использовали полученные в данном исследовании методом позитивной селекции спонтанные мутанты штамма 49: 49з9г1, устойчивый к стрептомицину и рифампици-ну, 49р1г7з2 пигментообразующий, устойчивый к стрептомицину и рифампицину, а также устойчивый к 100 мкг/мл тетрациклина спонтанный мутант 20021:16, полученный от штамма 2002.
Культуры выращивали в жидкой или на агаризован-ной среде ЬБ при температуре 28 оС. Селекцию мутантов, устойчивых к антибиотикам, и анализ фенотипа рекомбинантов проводили на той же среде с добавлением соответствующих растворов антибиотиков (конечная концентрация в среде: стрептомицина — 50 мкг/мл, ри-фампицина — 25 мкг/мл, тетрациклина — 100 мкг/мл).
В экспериментах с периодическими культурами споры из единичных колоний с четкой Б-морфологи-ей вносили в жидкую среду ЬБ и культивировали при оптимальных условиях (28 °С, рН 6,8) в течение 12 час. Выросшую культуру переносили в соотношении 1 : 750 (у/у) в свежую среду с рН 6,8 (контроль) и рН 9,4 (опыт) и продолжали культивирование при 28 °С в течение 72 и более часов. Значение рН среды устанавливали с помощью буферного раствора ЫаИСОз. Рост культуры и частоту встречаемости морфологических вариантов в ней контролировали путем периодического высева проб на плотную среду и учета образовавшихся колоний.
При проведении флуктуационного теста аналогично полученную двенадцатичасовую культуру разбавляли х105 раз, высевали на чашки с плотной ЬБ для изучения исходного состава и затем по 0,1 мл суспензии вносили в 10—20 пробирок с 2 мл свежей среды. Посевы культивировали в течение 24 часов и высевали после соответствующих разведений на плотную среду отдельно из каждой пробирки (индивидуальные культуры). Затем сливали по 1 мл культуры из каждой пробирки в общую и также через соответствующее число десятикратных разведений высевали на плотную среду (общая культура). Подсчет числа жизнеспособных клеток в культурах и учет морфологии образованных на плотной среде колоний вели на
10-е сутки. Частоту возникновения морфологических вариантов вычисляли по формуле, предложенной С. Лу-риа и М. Дельбрюком [12], параметры роста культур — по формулам, принятым для периодических культур [7]. Полученные результаты подвергали стандартным методам статистической обработки.
Гибридизацию проводили путем совместного культивирования штаммов в жидкой среде и на фильтрах [22, 25]. Выделение и количественный учет рекомбинантов (трансципиентов) осуществляли, высевая смесь клеток родительских штаммов сразу после совместного культивирования на соответствующие селективные среды. Контролем во всех случаях являлся параллельный посев исходных штаммов на аналогичную селективную среду.
Физиолого-биохимические свойства штаммов определяли по общепринятым методикам [9]. Исследование антигенных свойств проводили капельной реакцией агглютинации с использованием одного из разведений (1 : 50 или 1 : 100) иммунных монорецепторных диагностических О-сывороток с известным титром антител [15]. Для количественной оценки наличия терморезистентных спор из 10-суточных культур готовили суспензии с исходной концентрацией микробных тел 1 х 108. Делали кратные разведения в физиологическом растворе и высевали на ЬБ до и после прогрева при 75 оС в течение 30 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Кривые роста и процентное содержание морфологических вариантов в периодических культурах штаммов 49 и 2002, культивируемых в оптимальных условиях и при повышенном до 9,4 значении рН среды, определены по результатам семи и шести, соответственно, повторностей эксперимента и представлены графически на рис. 1.
В оптимальных условиях штаммы 49 и 2002 не отличались достоверно по характеру размножения. Время удвоения концентрации клеток штамма 49 в фазу логарифмического роста составило 0,8 ± 0,11 ч, а клеток штамма 2002 — 0,8 ± 0,07 часа. К 24 часу в обеих культурах концентрация клеток в среднем одинаково достигала максимального значения 2,4 х 108кл/мл. Перенос клеток, выросших при оптимальных условиях, в среду с повышенным значением рН приводил к гибели части клеток обоих штаммов в первые часы культивирования, но, начиная с 6 часов, концентрация клеток увеличивалась со скоростью, характерной для логарифмической стадии роста. Некоторое увеличение времени удвоения концентрации клеток по сравнению с оптимальными условиями наблюдали только для штамма 2002, которое составило в этот период 1,0 ± 0,07 час. Также наблюдали продолжение роста исследуемых культур с 48 до 72 час, что, очевидно, связано с дополнительным
A
D, % С, lg
B
D С
время культивирования, час
время культивирования, час
Б
D, % С, lg
Г
D C
100 г 9 г
80
60 -
40
20
время культивирования, час
46,9
3 6 9 12 24 48 72
время культивирования, час
Рис. 1. Концентрация клеток (С, 1ц) и процентное содержание морфологических вариантов (О, %) в периодических культурах: штаммов 49 и 2002, соответственно: А и Б — при 28 оС, рН 6,8; В и Г — при 28 оС, рН 9,4
0
поступлением питательных веществ в результате гибели клеток на начальных этапах культивирования и снижения рН среды. К концу культивирования значение рН среды после размножения исследуемых штаммов понижалось до 8,75-8,76.
Как видно из рис. 1, при всех условиях культивирования доля морфологических вариантов возрастала только в поздней стационарной фазе роста исследованных штаммов. Культивирование при повышенном значении рН среды в отличие от оптимальных условий приводило к более значительному увеличению доли морфологических вариантов и при меньшей плотности культур. Так, например, для штамма 49 встречаемость морфологических вариантов на 48 часу культивирования в оптимальных условиях увеличилась до 1,2 % при концентрации 3,6 х 108кл/мл, а в условиях повышенного значения рН среды — до 9,1 % при концентрации
клеток на порядок ниже — 3,9 х 107. Подобное наблюдали и для штамма 2002. Через 72 часа число R-вариантов в культуре штамма 49 возросло до 77,3 % (в контроле 16,1 %). У штамма 2002 доля R-вариантов возросла менее значительно и составила 46,9 % (в контроле 25,7 %), возможно, в связи с особенностью реакции его генотипа на рН среды.
Это свидетельствовало о том, что появление R-вариантов в культурах Bacillus thuringiensis связано только со стационарной фазой роста, а стрессовый фактор среды (рН 9,4) может усиливать интенсивность процесса диссоциации в рамках нормы реакции генотипа конкретного штамма.
Классический флуктуационный тест Лурия—Дельб-рюка, проведенный нами в ряде повторностей с целью количественной оценки процесса возникновения морфологических вариантов в клоновых культурах иссле-
Таблица 1
Частоты встречаемости Я-вариантов и их дисперсии в индивидуальных и общей культурах штаммов 49 и 2002
в вариантах флуктуационного теста
Штамм Число опытов Число удвоений Индивидуальные культуры общая культура
частота R-вариантов х10-2 2 с частота R-вариантов х10-2 2 о
49 3 20 0,1 ± 0,08 0,1 0 0
2 4 0,1 ± 0,03 0,008 0,1 ± 0,03 0,007
2002 1 25 7,3 ± 4,79 229,3 7,6 ± 4,67 218,3
1 20 5,5 ± 3,00 89,8 2,3 ± 1,49 22,1
1 19 1,0 ± 0,25 0,6 0,7 ± 0,22 0,5
дуемых штаммов (табл. 1), не предоставил картины, ожидаемой для обычных мутаций, возникающих спонтанно в растущих культурах. При анализе 70 независимых культур штамма 49 и 50 культур штамма 2002 нами не было обнаружено случая возникновения R-вариантов на ранних этапах их размножения. При высеве через 24 часа, как правило, встречались единичные колонии с измененной морфологией, или даже только часть колонии была представлена R-формой. Сопоставление частот встречаемости R-вариантов и дисперсии этого показателя в вариантах с независимыми субкультурами (индивидуальными культурами) и повторными пробами из одной и той же культуры (общей, в нашем случае «усредненной сливанием») показало, что частота встречаемости R-вариантов не зависела от количества пройденных генераций и количества проанализированных колоний.
Частота возникновения морфологических R-вариантов, рассчитанная на одну клетку на одну генерацию как по результатам флуктуационного теста, так и роста периодических культур на 24 час культивирования, в разных экспериментах варьировала в культурах штамма 49 от 1,2 x 10-4до 3,4 x 10-4, а в культурах штамма 2002 — от 0,8 x 10-3до 7,1 x 10-3. В среднем, частота возникновения морфологических вариантов у штамма 2002 ssp. thuringiensis составила 2,5 x 10-3 на одну клетку на одну генерацию и была достоверно (Р < 0,05) выше частоты возникновения таковых у штамма 49 ssp. dendrolimus — 4,1 x 10-4.
С целью выяснения значимости появления морфологических R-вариантов у них исследовали ряд физио-лого-биохимических признаков, имеющих диагностическое для подвидов Bacillus thuringiensis [18] значение, а также признаки, характеризующие ответ клеток на неблагоприятные условия среды.
Ни один из 25 R-вариантов штаммов 49 и 2002 не изменил соматический о-антиген, характер роста в жидкой питательной среде, способность к образованию ацетилметилкарбинола, наличие или отсутствие
амилолитической, лецитиназной и уреазной активностей, характерных для исходных S-вариантов. В некоторых случаях наблюдали только вариации в степени проявления протеолитической активности, как в сторону ослабления, так и усиления. Также стоит отметить, что ряд R-вариантов штамма 49 отличался от исходных S-форм способностью к гидролизу сахарозы (данные не приведены).
В наибольшей степени у R-вариантов было нарушено спорообразование - процесс, который является последним клеточным ответом на неблагоприятные пищевые условия. Результаты исследования 57 R-вариантов штамма 49 и 204 R-вариантов штамма 2002 по степени нарушения образования терморезистентных спор представлены на рис. 2. Ни один из исследованных вариантов не спорулировал с эффективностью 100 %. У S-вариантов исследуемых штаммов процесс споро- и кристаллообразования завершался на 3 — 5-е сутки, и мазки, приготовленные из культур этого возраста, содержали свободные споры и кристаллы токсина, только иногда встречались единичные клетки. В культурах R-вариантов даже на 7 — 10-е сутки в основном присутствовали клетки, также наблюдались дегенеративные явления и лизис. Причем у одних вариантов клетки оставались в длинных цепочках, слабо окрашивались и имели деструктурирован-ную или содержащую структуры цитоплазму, у других — наблюдали одиночные клетки, но имеющие извитую или даже свернутую в кольцо форму. Споры встречались с разной частотой, а кристаллы, как правило, отсутствовали.
Исходя из полученных результатов о нарушении спо-руляции у R-вариантов, исследовали их способность к обмену генетической информацией. При этом мы основывались на установленном сходстве процессов генетической регуляции инициации споруляции и наличии генов Clp АТФ-зависимых протеаз у Bacillus thuringiensis и Bacillus subtilis [19, 26, 27]. А, как известно, одной из первых реакций на стрессовые усло-
вия, вызванные увеличением плотности популяции и недостатком питания, кроме мобилизации аппарата хемотаксиса, у Bacillus subtilis является развитие компетентности у части клеток и усиление рекомбинационных процессов [6, 16, 23, 28].
С этой целью были проведены эксперименты по совместному культивированию генетически маркированных производных штаммов 49 и 2002, имеющих S- или R-морфологию. Проверили 4 варианта скрещиваний с учетом морфологии: 49S х 2002S, 49S х 2002R, 49R х 2002S и 49R х 2002R. В каждом из вариантов провели от 4 до 7 скрещиваний, отличающихся генетически маркированными производными штаммов 49 и
2002, условиями гибридизации и селекции рекомбинантов (2-х, 3-х и 4-факторные). Во всех случаях опыты по скрещиванию на плотной среде с использованием фильтров оказались результативнее скрещиваний в жидкой среде. Результаты двух наиболее информативных трехфакторных скрещиваний представлены в табл. 2.
В этих скрещиваниях в качестве одного из родительских штаммов были использованы спонтанные мутанты штамма 49, маркированные мутациями устойчивости к рифампицину и стрептомицину, а в качестве другого — спонтанный мутант штамма 2002, устойчивый к 100мкг/мл тетрациклина. Селекцию рекомбинантов
Таблица 2
Эффективность образования рекомбинантов и их стабильность в трехфакторных скрещиваниях S- и R- вариантов
штаммов 49 и 2002 Bacillus thuringiensis
Вариант скрещивания Участвующие в скрещивании производные штаммов Селекция на среде* Частота появления рекомбинантов х10-9 при высеве смеси Доля (%) рекомбинантов, стабильно проявлявших Доля (%) рекомбинантов, утративших маркеры донора
49 2002 из жидкой среды с фильтров три** маркера два*** маркера
S х S 49s9d 2002t16 СРТ 0 8 0 62,5 37,5
49plT7s2 2002t16 СРТ нт 0 нт нт нт
S х R 49s9d 2002t16 СРТ 0 42 9,5 81,0 7 1****
49plT7s2 2002t16 СРТ нт 32 нт нт нт
R х S 49s9d 2002t16 СРТ 0 20 11,1 83,3 5,6
49plT7s2 2002t16 СРТ нт 65 нт нт нт
R R 49s9d 2002t16 СРТ 0 15 0 93,7 6,3
49plT7s2 2002t16 СРТ нт 6 нт нт нт
Примечание: * — СРТ, среда с добавлением стрептомицина (50 мкг/мл), рифампицина (25 мкг/мл), тетрациклина (100 мкг/мл);
** — устойчивость к стрептомицину, рифампицину, тетрациклину; *** — устойчивость к рифампицину и тетрациклину; **** — один рекомбинант утратил все селективные маркеры; нт — не тестировано.
после совместного культивирования родительских штаммов вели на среде, содержащей три антибиотика.
Как показал анализ рекомбинантных клонов по ряду неселективных признаков, в том числе соматическому О-антигену (данные не представлены), донором селективных маркеров во всех скрещиваниях, независимо от используемой комбинации морфологических вариантов, оказались мутанты штамма 49, а реципиентом — штамм 2002t16. Однако, как видно из результатов табл. 2, варианты скрещиваний, в которых родительские штаммы были представлены разными морфологическими формами, отличались большей эффективностью при других равных условиях. Кроме того, анализ наследуемости селективных маркеров в процессе 7-8 пересевов и двухлетнего хранения в неселективных условиях у 85 клонов от скрещивания морфологических вариантов штаммов 49s9r1 и 2002t16, показал, что в таких скрещиваниях чаще формировались стабильные рекомбинанты. В варианте скрещивания типа S х S маркеры донора (устойчивость к рифампицину и стрептомицину) были утеряны у трех из восьми рекомбинантов сразу после первого пассажа в неселективные условия, у остальных сохранялся только маркер устойчивости к ри-фампицину. Не останавливаясь подробно на анализе результатов гибридизации, который заслуживает отдельного рассмотрения, отметим только, что среди рекомбинантов, полученных в скрещиваниях типа R х R были обнаружены такие, у которых восстанавливалась способность к споруляции и токсинообразованию, причем кристаллы эндотоксина в ряде случаев имели необычную форму.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты исследования динамики появления R-вариантов в периодических клоновых культурах двух штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, показали, что независимо от условий культивирования процесс диссоциации индуцируется только в поздней стационарной фазе роста. Гипотеза увеличения доли диссоциантов в неблагоприятных условиях за счет их селективного преимущества при размножении не подтвердилась результатами нашего исследования, проведенного ранее [13]. Основным фактором, индуцирующим расщепление, являлась плотность популяции, так как культивирование в условиях повышенных значений рН среды или, как было показано ранее [13], повышенной до 40 °С температуры, не меняло закономерности появления вариантов в стационарной фазе роста. Стрессовые факторы среды только увеличивали интенсивность процесса. Стабильное наследование морфологии колоний и других свойств R-вариантов свидетельствовали, что их возникновение вызвано изменениями в генетическом материале. Од-
нако результаты флуктуационного теста встречаемости R-вариантов, проведенного нами на 24-часовой культуре, противоречили ожидаемому для обычных мутаций, которые возникают в растущих культурах. В большей степени полученные результаты согласовывались с данными исследований, показавших, что в условиях стресса, вызванного нехваткой питания, в неделящихся или медленно делящихся клетках включаются механизмы, обеспечивающие увеличение их генетического разнообразия в популяции, благодаря которому повышается вероятность ее выживания [4, 17, 20, 21]. Адаптивное значение диссоциации уже давно предполагалось многими исследователями [5, 12]. А тот факт, что диссоциация в исходно клоновых культурах Bacillus thuringiensis наблюдалась только в стационарную фазу роста, при истощении питательной среды и повышенной плотности популяции, независимо от внешних факторов, позволил сделать предположение, что появление R-вариантов может являться результатом функционирования подобных стресс-индуцированных механизмов и у данного вида бацилл. Достоверное различие в частотах возникновения R-вариантов у штаммов, принадлежащих к разным подвидам, а также различия у них интенсивности процесса диссоциации в условиях повышенного значения рН среды предполагали наличие влияния генотипа на данный процесс.
Как показано к настоящему времени на различных бактериальных и дрожжевых генетических системах, спектр механизмов, приводящих к повышению генетического разнообразия в популяциях практически неде-лящихся, но жизнеспособных клеток, довольно широк и, как отмечают некоторые авторы [4], по-видимому, включают все возможные молекулярные механизмы. В первую очередь, это активация SOS-системы, инактивация системы репарации ошибочно спаренных оснований, амплификация отдельных областей генома, транспозиции, внутрипопуляционный плазмидный и фаговый перенос генетической информации и другие. Отличительным результатом функционирования этих механизмов в условиях стресса является увеличение скорости изменчивости в 100 и более раз. Уровень возникновения R-вариантов, определяемый из результатов флуктуационного теста и анализа роста периодических культур как 2,5 х 10—3—4,1 х 10-4 на одну клетку на одну генерацию, мог свидетельствовать в пользу нашего предположения.
Результаты проведенного исследования и известные из литературы данные не позволяют с достоверностью говорить о механизмах, лежащих в основе возникновения R-вариантов у исследованных штаммов, ясно только, что в ряде случаев не происходит потери генетического материала, так как возможны реверсии к исходной S-форме. Так, в наших исследованиях у 11% R-вариантов, выделенных от штамма 49, и у 29 % ва-
риантов штамма 2002 наблюдали спонтанную реверсию к исходному типу. Возможность реверсии отмечалась и другими авторами [1, 8]. Также можно предполагать, что горячей точкой изменчивости в стационарную фазу являются процессы, связанные с диф-ференцировкой клеток. Анализ выборки независимо возникших R-вариантов показал, что единственным признаком, коррелирующим с изменением морфологии колоний, является нарушение спорообразования. Ранее подобная корреляция была выявлена для диссоциативных вариантов штаммов разных подвидов, в том числе ssp. galleriae, у которых, по словам авторов, морфологию колоний можно использовать для выделения аспороген-ных или олигоспорогенных мутантов [1]. По-видимому, именно нарушение процесса спорообразования приводит к наблюдаемой морфологии колоний и позволяет визуализировать результаты процессов, происходящих в стационарной фазе.
В отношении других диагностически значимых для подвидов свойств мы не наблюдали качественных различий в проанализированной выборке R-вариантов, за исключением способности сбраживать сахарозу. Из результатов исследований, упомянутых нами во введении [1—3, 8, 10, 11, 14], и других работ, можно заметить, что у диссоциантов могут быть изменены главным образом признаки, характеризующие приспособленность клеток к неблагоприятным условиям среды. Ранее нами было показано, что у R-вариантов исследуемых штаммов может измениться характер хемоответа [10]. В данном исследовании впервые получены результаты, свидетельствующие, что появление в стационарных культурах в процессе диссоциации аспорогенных R-вариантов может в некоторой степени способствовать обмену генетической информацией даже между штаммами, принадлежащими к разным подвидам. К сожалению, во всех этих исследованиях, как правило, ограничивались сравнением с исходной формой единичных вариантов, что в настоящее время не позволяет получить точную картину процесса, понять его биологический смысл и механизмы.
Мы можем предположить, на основании полученных результатов и фактов, известных для Bacillus subtilis, что R-варианты являются производными фракции клеток стационарной фазы, временно становящихся гипер-мутабильными [20, 29]. Такая фракция может сформироваться в несинхронно развивающейся культуре в результате нехватки плотностно-зависимого сигнального олигопептида, запускающего программу споруляции [16, 28], и/или перехода клеток в предапоптозное состояние из-за сильного голода. При попадании этих клеток вновь на питательную среду изменения ДНК (мутации, транспозиции, перестройки), которые не будут препятствовать возобновлению роста, смогут фиксироваться в результате отбора (сбраживание сахарозы,
хемотаксис). Изменения в генах, контролирующих основные процессы (возможно, отвечающие за соматический О-антиген, характер роста в жидкой питательной среде, образование ацетилметилкарбинола и т.п.), в первую очередь приведут к гибели клеток, если не будут репарированы. Наличие большого количества аномальных и лизировавшихся клеток в культурах R-вариантов отмечалось не только нами [14]. Оставшиеся клетки будут размножаться вновь до момента истощения питательных веществ и они погибнут, если их не перенести вновь в оптимальные пищевые условия, и если у них за это время не будут восстановлены гены, отвечающие за процессы постэкспоненциальной фазы. Возможно, наблюдаемые среди R-вариантов различия по количеству терморезистентных спор на 10-е сутки культивирования отражают способность к репарации.
Заключая изложение результатов проведенного исследования, можно только утверждать, что процесс диссоциации у Bacillus thuringiensis — это результат происходящих в стационарной фазе генетических событий, которые визуализируются благодаря возникновению аспорогенных или олигоспорогенных вариантов, формирующих колонии с измененной морфологией. Этот процесс реализуется в пределах нормы реакции генотипа и может способствовать адаптации изогенных культур. Молекулярно-генетические механизмы, вызывающие диссоциацию у этого вида бацилл, остаются неизвестными, но в свете полученных данных, на наш взгляд, их знание необходимо как для успешного использования в практике, так и для понимания особенностей существования вида в биоценозах.
Литература
1. Азизбекян Р.Р., Белых Р.А., Нетыкса Е.М., Погосбекова М.Р. Сравнительная характеристика спорообразующих и аспороген-ных штаммов Bacillus thuringiensis. // Генетика. — 1978. — Т. 14, № 3. — С. 510-518.
2. Азизбекян РР., Нетыкса Е.М. Сравнительная фагочувствитель-ность R- и S-штаммов Bacillus thuringiensis. // Микробиология. — 1978. — Т. 47, № 3. — С. 527-533.
3. Белых Р.А., Смирнова Т.А., Степанова Т.В., Азизбекян РР. Ан-тибиотикочувствительность штаммов Bacillus thuringiensis var. galleriae. // Микробиология. — 1982. — Т. 51, № 3. — С.490-496.
4. Вельков В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие. // Молекулярная биология. — 2002. — Т. 36, № 2. — С. 277-285.
5. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий. // Микробиология. — 1998. — Т. 67, № 2. — С. 149-155.
6. Дой Р. Споруляция и прорастание спор. // Бациллы. Генетика и биотехнология: Пер. с англ. / Под ред. К. Харвуда. — М.: Мир, 1992. — С. 236-297.
7. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов: Учеб. пособие/ Под ред. В.П. Гончаровой. — Л.: Лен. ун-т, 1983. — 188 с.
8. Кашкова Г.Г. Оценка диссоциации в культуре Bacillus thuringiensis var. dendrolimus Tal. в зависимости от трофических свойств питательного субстрата. // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве. — Иркутск, 1981. — С. 13-16.
9. Лабинская А.С. микробиология с техникой микробиологических исследований. — м.: медицина, 1978. — 319 с.
10. Лебенко Е.В., Секерина о.А., Чемерилова В.И. особенности хемотаксиса у диссоциативных S- и R-вариантов Bacillus thuringiensis. // микробиология. — 2005. — т. 74, № 1. — С. 87-91.
11. Левин А.С., Завезенова т.В., Фёдорова Е.Ф. и др. К биохимической характеристике R- и S-диссоциантов энтомопатогенной культуры Bacillus thuringiensis var. dendrolimus Tal. // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве. — Иркутск, 1979. — С. 23-32.
12. милько Е.С., Егоров Н.С Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации. — м.: мГУ, 1991. — 144 с.
13. Секерина о.А., Чемерилова В.И. об адаптивности процесса диссоциации у Bacillus thuringiensis. // микробиология. — 2003. — т. 72, № 5. — С. 689-694.
14. талалаев Е.В., Кашкова Г.Г., Гутман о.И., Барайщук ГВ. о вирулентности штаммов var. dendrolimus и var. galleriae, относящихся к группе бацилл thuringiensis. // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве: Сб. научн. тр. — Иркутск: Изд-во Иркутского гос. ун-та, 1980. — С. 4—17.
15. талалаева Г.Б., Покровская Л.А. о-антиген бактерий вида Bac. thuringiensis. // Селекция микроорганизмов. — Иркутск, 1978. — С. 113-122.
16. Ansaldi M., Marolt D., Stebe T., Mandic-Mulec I., Dubnau D. Specific activation of the Bacillus quorum-sensing systems by isoprenylated pheromone variants. // Mol. Microbiol. — 2002. — vol. 44. — P. 1561-1573.
17. Brisson D. The directed mutation controversy in an evolutionary context. // Critical Reviews in Microbiology. — 2003. — vol. 29, N 1. — P. 25-35.
18. De Barjac H., Frachon E. Classification of Bacillus thuringiensis strains.. // Entomophaga. — 1990. — vol. 35, N 2. — P. 233-240.
19. Fedhila S., Msadek T., Nel P., Lereclus D. Distinct clpP genes control specific adaptive responses in Bacillus thuringiensis. // J Bacteriol. — 2002. — vol. 184, N 20. — P. 5554-5562.
20. Foster P.L. Mechanisms of stationary phase mutation: a decade of adaptive mutation. // Annu. Rev. Genet. — 1999. — vol. 33, N 1. — P. 57-88.
21. Godoy v.G., Gizatullin F.S., Fox M.S. Some features of the mutability of bacteria during nonlethal selection. // Genetics. — 2000. -vol. 154, N 1. — P. 49-59.
22. Gonzalez J.M., Jr., Brown B.J., Carlton B.C. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for d-endotoxin among strains of B. thuringiensis and B. cereus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Biol. Sci. — 1982. — vol. 79, N 22. — P. 6951-6955.
23. Hamoen L.W., venema G., Kuipers O.P. Controlling competence in Bacillus subtilis: shared use of regulators. // Microbiology. — 2003. — vol. 149. — P 9-17.
24. Hanney C.L. The dissociation of Bacillus thuringiensis. // Can. J. Microbial. — 1967. — vol. 13. — P1566-1568.
25. Lereclus D., Menou G., Lecadet M.-M. Isolation of DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalisplasmid pAM ві. // Mol. Gen. Genet. — 1983. — vol. 191, N2. — P. 307-313.
26. Msadek T., Dartois v., Kunst F. et al. ClpP of Bacillus subtilis is required for competence development, motility, degradative enzyme synthesis, growth at high temperature and sporulation. // Mol. Microbiol. — 1998. — vol. 27. — P. 899-914.
27. Poncet S., Dervyn E., Klier A., Rapoport G. Spo0A represses transcription of the cry toxin genes in Bacillus thuringiensis. // Microbiology. — 1997. — vol. 143. — P. 2743-2751.
28. Sonenshein A.L. Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis. // Current Opinion in Microbiology — 2000. — vol. 3. — P. 561-566.
29. Sung H.-M., Yasbin R.E. Adaptive, or stationary-phase, mutagenesis, a component of bacterial differentiation in Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. — 2002. — vol. 184, N20. — P 5641-5653.
30. Yousten A.A. A method for the isolation of asporogenic mutants Bacillus thuringiensis. // Can. J. Microbiol. — 1978. — vol. 24, N 4. — P. 492-494.
The dissociation of Bacillus thuringiensis as manifestation of «stationary-phase mutagenesis»
Chemerilova V.I., Sekerina O.A., KravetsE.V., MalanushenkoL.V. Irkutsk state university, Irkutsk
Ш SUMMARY: Particularities of the morphological R-variants appearance in periodic culture of two strains of Bacillus thuringiensis were investigated. It is shown that both in optimum and in stressful conditions (рН 9,4) the R-variant frequency was increased in stationary phase only. Results from Luria and Delbruck’s fluctuation test established that the frequency of R-variants is independent of the number generations passed and the number of colonies under investigation. Majority of R-variants was asporogenous and acrystalligenous, but didn’t differ from original S-variants in set of others diagnostic characteristics that are significant for type. Mating between S- and R-vari-ants has shown that the presence of R-variants in culture provides increasing to efficiency of recombination between of the subspecies.
Ш KEY WORDS: Bacillus thuringiensis; asporogenous variants; stationary-phase mutagenesis
