CC BY
46
3. Huson D. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary Studies / D. Huson, D. Bryant // Mol. Biol. Evol. - 2006. - Vol. 23 (2). - P. 254-267.
4. Kaygorodova I. Molecular phylogeny of Baikalian Lumbriculidae (Oligochaeta): Evidence for recent explosive speciation / I. Kaygorodova, D. Sherbakov, P. Martin // Comparative Cytogenetics. - 2007. -Vol. 1. - P. 71-84.
5. Rapidly evolving lineages impede the resolution of phylogenetic relationships among Clitellata (Annelida) / P. Martin, I. Kaygorodova, D. Sherbakov, E. Verheyen // Mol. Phyl. Evol. - 2000. - Vol. 5 (3). -P. 355-368.
О.В. Макарова, О.А. Секерина, В.И. Немерилова ЧАСТОТА И ОСОБЕННОСТИ ДИССОЦИАЦИИ У ШТАММОВ ТРЕХ ПОДВИДОВ bacillus thuringiensis
ГОУ ВПО Иркутский государственный университет (Иркутск)
Одной из форм внутривидовой изменчивости, известной для многих бактерий, является диссоциация, которая заключается в появлении различающихся по ряду наследуемых свойств вариантов при размножении исходно однородной популяции клеток. От спонтанных мутаций диссоциативные изменения отличаются высокой частотой, обратимостью и комплексностью. В связи с тем, что у многих возбудителей инфекционных заболеваний при диссоциации появляются варианты с существенным различием в патогенности, крайне необходимо прогнозирование изменения состава бактериальной популяции. Никакие прогнозы невозможны без знания механизмов, частот диссоциативных переходов, коррелятивных зависимостей между генетическими, морфологическими и физиолого-биохимическими различиями у диссоциантов.
Исследование закономерностей диссоциации у энтомопатогенного вида бактерий Bacillus thuringiensis (ВТ) представляет не только коммерческий интерес из-за появления в исходных спорокристаллообразующих штаммах, имеющих, как правило, S-морфологию и формирующих на плотной среде колонии белого цвета, особей с нарушениями споруляции и способности формировать кристаллический токсин (R-варианты). Согласно результатам молекулярно-генетических исследований последних лет ВТ проявляет очень тесное родство с таким патогенном как Bacillus antracis - возбудителем сибирской язвы. И хотя представители этих видов занимают разные экологические ниши, среди ВТ были обнаружены штаммы, патогенные для мышей и вызывающие серьезные оппортунистические инфекции у человека. О закономерностях и механизмах диссоциации у представителей группы Bacillus cereus, к которой относят оба упомянутых вида, известно крайне недостаточно.
Целью настоящего исследования явилось определение частоты SoR диссоциации и особенностей появления диссоциантов в периодических культурах штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis.
В исследовании использовали штаммы 49 subsp.dendrolimus (серотип Н4а4ь), 1003 subsp. entomocidus (серотип Н6), 2002 subsp. thuringiensis (серотип HJ, полученные из коллекции Музея микробиологии Иркутского государственного университета.
Клетки или споры из отдельных колоний с четкой морфологией, характерной для исследуемого варианта, переносили в 15 мл жидкой среды Луриа-Бертани (LB) и культивировали двенадцать часов при 28 °С с естественной аэрацией. Ночные культуры разбавляли свежей прогретой до 28 °С средой LB в соотношении 1 : 750 и продолжали культивирование в течение 72 часов. Исходное число жизнеспособных клеток, динамику размножения культур и появление диссоциативных вариантов контролировали путем периодического высева проб на агаризованную среду LB. Число формируемых на плотной среде колоний учитывали через сутки, а их морфологию описывали на 5-7 сутки. Параметры роста вычисляли по формулам, предложенным для периодических культур.
Исследовали характер размножения и динамику появления R-вариантов у восьми S-клонов штамма 49, семи S-клонов штамма 2002 и трех S-клонов штамма 1003, а также характер размножения и динамику появления S-вариантов у независимо полученных трех R-клонов штамма 49, трех R-клонов штамма 2002 и трех R-клонов штамма 1003.
Результаты исследования показали, что в оптимальных условиях культивирования исследуемые S-клоны одного и того же штамма, а также S-клоны штаммов разных подвидов достоверно не отличались по характеру размножения. Время генерации клеток в логарифмическую фазу роста S-клонов штамма 49 составило 0,8 ± 0,11 ч, штамма 2002 - 0,8 ± 0,07 ч и штамма 1003 - 0,8 ч. По-видимому, скорость размножения этих бацилл находится под строгим генетическим контролем. В период 6-9 часов культуры замедляли рост и переходили в стационарную фазу, которая продолжалась до конца периода наблюдения. Процесс отмирания, т.е. внутриклоновый отбор, становился заметным только лишь после 24-48 часов
культивирования и не отличался особой интенсивностью. Различие между штаммами наблюдали только по максимальной концентрации жизнеспособных клеток, достигаемой в стационарную фазу в используемом объеме среды. Для штаммов 49 и 2002 она составила 3,6 х 108 кл/мл и 0,7 х 108 кл/мл, соответственно. Для клонов штамма 1003 конечная концентрация клеток была на порядок выше — 1,7 х 109 кл/мл, что может быть обусловлено большей устойчивостью клеток данного штамма к увеличению плотности популяции и присутствию в среде продуктов метаболизма.
В период логарифмического роста доля R-вариантов в культурах трех штаммов колебалась без видимой закономерности и составляла в среднем для штамма 49 — 0,3 %, для штамма 2002 — 2,7 %, а для штамма 1003 — 4,6 %. Однако, начиная с 48 часов культивирования (поздняя стационарная фаза), наблюдали существенное увеличение доли морфологических вариантов в культурах всех исследуемых штаммов. К 72 часам культивирования доля R-вариантов у S-клонов штамма 49 возрастала в среднем до 16,1 %, у штамма 2002 — до 25,7 %, а у штамма 1003 — до 54 %. Частота возникновения R-вариантов, оцененная по частоте их встречаемости после известного числа генераций, колебалась у клонов штамма 49 в пределах 1,2 х 10-4 — 3,4 х 10-4, у клонов штамма 2002 — 0,8 х 10-3 — 1,2 х 10-4, а для клонов штамма 1003 составила 5,1 х 10-3 на одно клеточное деление, что сравнимо с частотами диссоциации по другим признакам разных видов микроорганизмов.
Анализ параметров роста R-вариантов исследуемых штаммов в аналогичных условиях периодической культуры выявил отсутствие достоверных отличий с S-вариантами, что исключало селективное преимущество R — вариантов в условиях стационарной фазы. Так, время генерации в логарифмическую фазу роста для R-вариантов штамма 49 колебалось от 0,72 до 0,8 ч, штамма 2002 — 0,75 — 0,83 ч, штамма 1003 — 0,8 ч. Через 24 часа культивирования различий в максимальной для данного объема среды концентрации клеток у S- и R-вариантов штаммов 49 и 2002 не наблюдали, а для штамма 1003 R-варианты достигали концентрации 8,3 х 108 кл/мл, что было на порядок ниже, чем у S-вариантов.
В отличие от индукции R-вариантов у S-клонов в стационарную фазу роста увеличения частоты появления S-вариантов в процессе культивировании R-клонов не происходило. Частота их встречаемости у трех штаммов и разных клонов одного и того же штамма была различна. У всех R-клонов штамма 1003 были обнаружены S-варианты, их доля в культуре незначительно варьировала в процессе роста и в среднем составила 3,3%. Аналогично для штамма 2002 доля S-вариантов в среднем равнялась 1,06 % и также колебалась без видимой закономерности. Среди 3462 проанализированных колоний R-клонов штамма 49 в исследуемый период было встречено 17 S-вариантов, что составило 0,49 %. Частота R^-S перехода, определенная флуктуационным тестом для штамма 49 составила 5,4 х 10-4 на клетку на генерацию, для штамма 2002 — 0,8 — 7,3 х 10-3, для штамма 1003 — 1,3 — 10—3 на одно клеточное поколение. Полученные данные могут косвенно свидетельствовать о различии механизмов, лежащих в основе S^-R и R^-S диссоциации.
Как видно из приведенных данных, процесс S^-R диссоциации характеризуется общей для трех штаммов разных подвидов ВТ закономерностью и индуцируется в позднюю стационарную фазу роста культур. Результатом процесса, как отмечалось и другими исследователями, является наследуемое нарушение споро- и кристаллообразования у некоторой доли клеток. При обратном R^S переходе общим является более низкая частота и разнообразие по способности к восстановлению S-морфологии.
Установленные закономерности позволяют нам предполагать наличие такого же процесса у представителей вида Bacillus anthracis и рекомендовать использовать его для получения у данного вида стабильных аспорогенных форм в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов с целью изготовления диагностических препаратов.
Л.В. Маланушенко, В.И. Немерилова
эффективность образования и регенерации протопластов клеток штаммов дикого типа bacillus thuringiensis
ГОУ ВПО Иркутский государственный университет (Иркутск)
Метод искусственного получения протопластов бактерий и их слияния эффективно используется для достижения различных целей: получения внутри- и межвидовых гибридов, изучения генетического взаимодействия полноценных геномов, установления сцепления и экспрессии генов и их картирования, трансформации плазмидной и хромосомной ДНК, клонирования генов, селекции промышленных штаммов. С появлением метода слияния протопластов начаты генетические исследования некоторых важных в практическом отношении микроорганизмов, не имеющих хорошо развитой системы генетического обмена, к которым можно отнести энтомопатогенный вид B. thuringiensis и других представителей группы Bacillus cereus. В ранее проведенных немногочисленных исследованиях на этих объектах было выявлено,
