CC BY
49
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ■
Гонсорунова Д.С., Кремер Е.Э., Огородова Л.М., Федорова О.С., Камалтынова Е.М.
Сибирский государственный медицинский университет,
г. Томск
ДИСФУНКЦИЯ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОПИСТОРХОЗНОЙ ИНВАЗИИ
Согласно данным различных исследований, гельминтные инвазии модифицируют направленность иммунного ответа при аллергических заболеваниях. Цель исследования - установить особенности клеточного иммунного ответа при атопическом дерматите, протекающем на фоне хронической описторхозной инвазии, до и после антигельминтной терапии. В исследование включены пациенты, страдающие атопическим дерматитом (n = 15), пациенты с хронической описторхозной инвазией (n = 15), больные сочетанной патологией (дерматит, хронический описторхоз, n = 15), а также условно здоровые дети (n = 15). Показано, что на фоне хронической описторхозной инвазии отмечается тенденция к легкому течению атопического дерматита с редкими ночными симптомами; антигельминтная терапия приводит к рецидиву симптомов болезни. Содержание CD4+CD25high Т-регуляторных клеток у больных атопическим дерматитом, сочетанным с хронической описторхозной инвазией, сопоставимо с аналогичным показателем в группе больных изолированным атопическим дерматитом, а уровень CD4+FOXP3+ статистически значимо преобладает в группе пациентов с сочетанной патологией. Дегельминтизация приводит к повышению уровня CD4+FOXP3+ Т-регуляторных клеток и снижению количества CD4+CD25high, что свидетельствует о компенсаторном усилении активности Т-регуляторных клеток за счет снижения их количества. Полученные данные могут использоваться в разработке профилактических и лечебных программ ведения больных с аллергической патологией.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: атопический дерматит; описторхозная инвазия; Т-регуляторные клетки; иммунный ответ; аллергическое воспаление.
Gonsorunova D.S., Kremer E.E., Ogorodova L.M., Fyodorova O.S., Kamaltinova E.M.
Siberian State Medical University, Tomsk
DYSFUNCTION OF T-REGULATORY CELLS IN ATOPIC DERMATITIS
WITH CHRONIC OPISTHORCHIASIS INVASION
According to various studies, helminth infestation modifies the orientation of the immune response in allergic diseases. The aim: to evaluate features of the cellular immune response in atopic dermatitis occurring on the background of chronic opisthorchiasis invasion, before and after anthelminthic treatment. The study included patients suffering from atopic dermatitis (n = 15), patients with chronic opisthorchiasis invasion (n = 15), patients with comorbidity (dermatitis, chronic opisthorchiasis, n = 15), as well as relatively healthy children (n = 15). It is shown that with chronic opisthorchiasis invasion tended to be less severe atopic dermatitis with rare nocturnal symptoms; anthelminthic therapy leads to relapse of symptoms. The content of CD4 +CD25high T-regulatory cells in patients with atopic dermatitis, associated with chronic opisthorchiasis invasion, comparable with those in the group of patients with isolated atopic dermatitis, and the level of CD4+FOXP3+ were significantly prevalent in patients with comorbidity. Anthelminthic treatment leads to increased levels of CD4+FOXP3+ T-regulatory cells and reduce the number of CD4+CD25high, indicating a compensatory increase in activity of T-regulatory cells by reducing their number. The data obtained can be used to develop preventive and therapeutic methods for allergic diseases.
KEY WORDS: atopic dermatitis; opisthorchiasis invasion; T-regulatory cells; immune response; allergic inflammation.
Многочисленные эпидемиологические и экспериментальные исследования свидетельствуют о роли различных внешнесредовых факторов, включая инфекции и гельминтные инвазии, в подверженности к аллергическим болезням, в том числе и атопическому дерматиту (АД) [1, 2].
Предполагается, что на фоне гельминтной инвазии изменяется регуляция иммунного ответа, что приводит к модификации клинического течения аллергических заболеваний [3, 4]. Так, в некоторых исследованиях показано, что сопряженность аллергических болезней и паразитарной инвазии ассоциирована не только с низкой распространенностью болезни, но и со значимо меньшей выраженностью
Корреспонденцию адресовать:
ГОНСОРУНОВА Дарима Сергеевна,
634009, г. Томск, ул. Карла Маркса, 44,
ГБОУ ВПО «СибГМУ Минздравсоцразвития»
Тел. раб. 8 (3822) 51-67-49; сот. +7-913-108-3632. Е-таИ; [email protected]
клинических проявлений [5, 6]. Схожие данные установлены в отношении влияния инвазии Schistosoma, Ascaris lumbricoides, Heligmosomoides polygyrus, Opisthorchis felineus на риск развития аллергических заболеваний, в том числе и АД [6-9]. Аналогичные результаты получены нами ранее в ходе проведенного эпидемиологического исследования. Так, более тяжелое течение АД и ранняя манифестация болезни наблюдаются у детей, проживающих в г. Томске (регион с низким уровнем описторхоз-ной инвазии), в то время как у сельских школьников, проживающих в регионе с высоким уровнем описторхоза, АД чаще встречается в легкой форме с продолжительными ремиссиями [10].
Экспериментальные данные указывают на возможность модификации иммунного ответа при гельминтной инвазии за счет супрессорных цитокинов (IL-10) и снижения уровня провоспалительных маркеров (IL-4, IL-5) [11-13].
Современные исследования продемонстрировали роль Т-регуляторных клеток (Treg) в формировании
■ ДИСФУНКЦИЯ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОПИСТОРХОЗНОЙ ИНВАЗИИ
иммунного ответа при аллергических заболеваниях и хронических гельминтозах [12-14]. В экспериментальном исследовании на модели астмы установлено достоверное повышение уровня С04Т0ХР3+ Тreg в перибронхиальных лимфатических узлах у мышей, инфицированных Heligmosomoides ро^угш [9]. По данным других исследований, при инвазии экспериментальных мышей Shistosoma ]аротсит отмечено подавление аллергического воспаления и, напротив, дефицит Тreg ассоциирован с активацией ТЬ-2 воспаления и развитием аллергического заболевания [13]. Установлена ассоциация высокого уровня С04Т0ХР3+ Тreg и снижения дыхательной гиперреактивности у мышей, инвазированных трематодой Shistosoma тап-soni, при этом протективный эффект сопряжен с выработкой супрессорных цитокинов [14].
Дисфункция Тreg лежит и в основе АД, а количественное содержание варьирует в зависимости от фазы болезни, активности воспаления [15, 16]. Однако данные, раскрывающие механизмы направленности иммунного ответа при АД, протекающем на фоне хронической гельминтной инвазии, немногочисленны.
Цель исследования — установить характеристики клеточного иммунного ответа с участием Тreg при атопическом дерматите, протекающем на фоне хронической описторхозной инвазии, до и после анти-гельминтной терапии.
КЛИНИЧЕСКИЕ ГРУППЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведено открытое проспективное исследование в дизайне «случай-контроль» по протоколу, одобренному Локальным независимым комитетом по этике при ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития (№ 1000 от 27.04.2009 г.). В исследовании приняли участие больные в возрасте 7-15 лет, страдающие АД (п = 15, средний возраст 9,35 ± 0,12 лет), хроническим опис-торхозом (п = 15, средний возраст 10,18 ± 0,21 лет), а также больные АД, протекающем на фоне хронического описторхоза (п = 15, средний возраст 10,73 ± 0,11 лет). Группу контроля составили здоровые дети (п = 15, средний возраст 9,56 ± 0,43 лет). Исследование выполнено на базе Областного детского центра аллергологии и иммунологии (ОГУЗ «Областная детская больница», г. Томск).
Диагноз атопического дерматита устанавливали в соответствии с диагностическими критериями, изложенными в национальном согласительном документе [17]. При этом обязательным условием считалось
наличие данного заболевания в течение 12 месяцев, предшествовавших включению в исследование.
Диагноз хронической описторхозной инвазии устанавливали на основании положительного результата копроовоскопии и/или дуоденального зондирования и ПЦР кала (молекулярно-генетическая идентификация яиц Opisthorchis felineus), подтвержденного не позднее 3 месяцев до включения в исследование при наличии регулярного употребления в пищу речной рыбы.
Контрольную группу составили условно-здоровые дети, не имеющие в анамнезе и на момент включения аллергических заболеваний и паразитарных инвазий, в том числе описторхоза.
Антигельминтную терапию больным хроническим описторхозом и АД, сочетанным с хронической опис-торхозной инвазией, проводили препаратом Биль-трицид в дозе 50 мг/кг в 3 приема в течение суток в условиях стационара ОГУЗ «Областная детская больница» г. Томска. Проспективное наблюдение за больными осуществляли в течение 6 месяцев после дегельминтизации.
Определение уровня Тreg проводили при включении больных в исследование, а у больных хроническим описторхозом — через 6 месяцев после антигель-минтной терапии. Для определения фенотипических характеристик Treg клеток использовали мононукле-арные клетки (МНК) периферической крови. МНК выделяли из гепаринизированнй венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,077 г/см3). Для получения МНК на 2,5 мл фиколл-урографина (в соотношении 1:2) наслаивали 5 мл крови в стерильной пластиковой пробирке объемом 15 мл. Центрифугировали в течение 7 минут при 3000 об/мин. Пастеровской трансфер-пипеткой осуществляли сбор клеток интерфазного кольца. Далее проводили двукратную отмывку собранных клеток в 5 мл бессывороточной (неполной) среды ИРМ1-1640 (содержит 25 мМоль HEPES и 24 мМоль бикарбоната №). После отмывки клетки ресуспендировали в полной среде ИРМ1-1640, содержащей 10 % ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка), 2 мМоль Ь-глутамина и 50 Ед/мл пенициллин/стрептомицина. Подсчет клеток производили в камере Горяева в 5 больших учетверенных квадратах. Рабочая концентрация клеток составляла 2 х 106 на пробу.
Относительное содержание С04+С0251"81' и внутриклеточную экспрессию С04Т0ХР3 определяли методом проточной цитофлюориметрии с помощью FITC-меченных анти-СЭ4 и РЕ-Су7*-меченных анти-СЭ25 моноклональных антител. Внутриклеточную
Сведения об авторах:
ГОНСОРУНОВА Дарима Сергеевна, очный аспирант, кафедра факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития, г. Томск, Россия. Е-таіІ: [email protected]
КРЕМЕР Елена Эдуардовна, очный аспирант, кафедра гистологии, цитологии, эмбриологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития, г. Томск, Россия. Е-таіІ: [email protected]
ОГОРОДОВА Людмила Михайловна, доктор мед. наук, профессор, член-корреспондент РАМН, зав. кафедрой факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития, г. Томск, Россия. Е-т^іІ: [email protected] ФЕДОРОВА Ольга Сергеевна, доктор мед. наук, доцент, кафедра факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития, г. Томск, Россия. Е-т^іІ: [email protected]
КАМАЛТЫНОВА Елена Михайловна, канд. мед. наук, доцент, кафедра факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития, г. Томск, Россия. Е-т^Н: [email protected]
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ■
экспрессию FOXP3 оценивали в популяции CD4+ клеток, используя процедуру пермеабилизации клеток и РЕ-меченные анти^ОХР3 моноклональные антитела. Результаты представляли в виде процентного содержания соответствующей субпопуляции лимфоцитов по отношению к гейтированным МНК.
Статистическую обработку проводили при помощи пакета программ «Statistica for Windows 6.0». Для оценки различия средних в попарно не связанных выборках применяли U-критерий Манна-Уитни, в связанных — критерий Вилкоксона. При оценке различий между качественными характеристиками независимых выборок использовался критерий хи-квадрат Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность. Статистическая значимость различий категориальных данных зависимых выборок оценивалась с помощью критерия хи-квадрат Мак-Немара. Разницу значений считали значимой при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Статистический анализ клинических симптомов АД показал преобладание локализованных форм у больных, имеющих хроническую описторхозную инвазию, в сравнении с таковыми у неинвазированных лиц (53,3 % и 6,7 %, соответственно, p < 0,05). Легкое течение АД отмечалось чаще при сочетанной патологии в сравнении с изолированным АД (60 % и
13.3 %, соответственно, p = 0,02). Среднее значение индекса SCORAD на момент включения в исследование статистически значимо выше у больных АД в сравнении с таковым у больных АД, протекающем на фоне хронического описторхоза (34,0 ± 2,83 баллов и 21,49 ± 1,62, соответственно, p < 0,05). Нарушение сна различной интенсивности по причине зуда, как индикатор тяжести болезни, чаще отмечалось у больных АД, не имеющих описторхозную инвазию, в сравнении с сочетанной патологией (80 % и
33.3 %, соответственно, p < 0,05).
Средняя частота обострений за 6 месяцев до включения в исследование у больных АД без описторхоза составила 2,93 ±
0,32, что превышало аналогичный показатель в группе инвазированных лиц — 1,67 ±
0,35 (p < 0,05). Использование системных кортикостероидных препаратов за последние 6 месяцев зарегистрировано у большего числа больных с изолированным АД, однако показатели статистически не различались с
показателями в группе больных сочетанной патологией (26,7 % и 6,7 %, соответственно, р = 0,32).
Приведенные данные свидетельствуют о наличии особенностей клинического течения АД у лиц, страдающих хронической описторхозной инвазией.
Анализ клеточного иммунитета при изучаемых состояниях проведен путем исследования содержания Тreg в периферической крови больных различных групп. Установлено, что содержание С04+С0251"81' у больных АД, описторхозом и сочетанной патологией статистически значимо выше, чем в контрольной группе (табл. 1). Уровень С04+С025Ы811 у больных АД, сочетанным с хронической описторхозной инвазией, не отличался от показателя в группе больных изолированным АД, однако был значительно выше, чем у больных описторхозом.
В ходе исследования выявлено также более высокое содержание внутриклеточного транскрипционного фактора FOXP3+ у больных АД, не имеющих опис-торхозной инвазии, у больных сочетанной патологией и пациентов, страдающих описторхозом, по сравнению с контролем (табл. 1). Уровень С04Т0ХР3+ оказался статистически значимо выше в группе пациентов с АД, страдающих хроническим описторхо-зом, в сравнении с показателями в группе больных АД, не имеющих гельминтоза (р < 0,05). Зарегистрировано сопоставимое содержание транскрипционного фактора при сочетанной патологии и изолированной описторхозной инвазии. Поскольку маркер С04Т0ХР3+ является показателем функциональной активности Тreg, выявленные изменения связаны с дополнительной стимуляцией Тreg гельминтными антигенами для усиления супрессорного влияния на иммунный ответ.
В дальнейшем проводили оценку динамики клинических показателей у больных АД, страдающих хронической описторхозной инвазией, после дегель-
Таблица 1
Содержание CD4+CD25Wgh и CD4+FOXP3+ клеток в периферической крови обследованных пациентов, % (М±m)
Атопический
Популяции клеток Атопический дерматит Описторхоз дерматит в сочетании с описторхозом Контроль
CD4+CD25hl9h, % 2,80 і 0,38* 2,58 і 0,37* 3,69 і 0,43* 0,88 і 0,16
CD4+FOXP3+, % 5,19 і 0,51* 7,88 і 1,31* 8,03 і 0,87** 0,81 і 0,43
Примечание: * р < 0,05 в сравнении с группой контроля (критерий Манна-Уитни); ** р<0,05 в сравнении с группой больных атопическим дерматитом (критерий Манна-Уитни).
Information about authors:
GONSORUNOVA Darima Sergeyevna, postgraduate student, Department of faculty pediatry with course of children diseases for treatment faculty, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: [email protected]
KREMER Elena Eduardovna, postgraduate student, Central Research Laboratory, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: [email protected]
OGORODOVA Ludmila Mikhailovna, doctor of medical sciences, professor, corresponding member of RAMS, head of Department of faculty pediatric with course of children diseases for treatment faculty, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: [email protected] FYODOROVA Olga Sergeyevna, doctor of medical sciences, docent, Department of faculty pediatry with course of children diseases for treatment faculty, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: [email protected]
KAMALTINOVA Elena Mikhailovna, candidate of medical science, docent, Department of faculty pediatry with course of children diseases for treatment faculty, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: [email protected]
■ ДИСФУНКЦИЯ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОПИСТОРХОЗНОЙ ИНВАЗИИ
минтизации, при контрольном паразитологическом исследовании которых через 6 месяцев яйца опис-торхов не обнаружены.
Антигельминтная терапия привела к увеличению среднего показателя частоты обострений болезни за период наблюдения (с 1,67 ± 0,35 до 2,6 ± 0,40, р < 0,05), что привело к увеличению доли пациентов, принимающих системные кортикостероидные препараты за период катамнестического наблюдения (с 6,7 % до 20 %, р = 0,59). Индекс БСОИДО характеризовался увеличением среднего значения с 21,49 ± 8,42 баллов до 30,79 ± 1,91 баллов (р < 0,05), что может отражать утяжеление течения АД и рецидивы болезни.
Статистический анализ продемонстрировал выраженную динамику уровня в периферической крови больных исследуемых групп (табл. 2). Так, через 6 месяцев после дегельминтизации у больных опистор-хозом и больных АД в сочетании с описторхозом наблюдается значительное снижение уровня С04+С025ЫбЬ (р < 0,05). Напротив, содержание СЭ4ТОХР3+ статистически значимо возросло у больных с АД, что свидетельствует об усилении функциональной активности Тreg, вызванном снижением количества С04+С025|"8Ь клеток.
ВЫВОДЫ:
В результате проведенного исследования установлено, что АД на фоне хронической описторхозной инвазии характеризуется тенденцией к более легкому
Таблица 2
Содержание CD4+CD25Wgh и CD4+FOXP3+ клеток в периферической крови больных атопическим дерматитом в сочетании с хроническим описторхозом, % (М ± m)
Популяции Атопический дерматит в сочетании с описторхозом
клеток До лечения После лечения
CD4+CD25hl9h 3,69 і 0,43 1,22 і 0,15*
CD4+FOXP3+ 8,03 і 0,87 12,76 і 0,87*
Примечание: * р < 0,05 в сравнении с показателями до дегельминтизации (критерий Вилкоксона).
течению с редкими ночными симптомами. Антигель-минтная терапия способствует прогрессированию клинических симптомов и рецидивам АД, что может быть результатом прекращения влияния антигенов гельминта на активность воспаления.
Полученные клинические данные коррелируют с изменениями показателей иммунологического статуса у пациентов в сторону супрессорного влияния хронической описторхозной инвазии на аллергическое воспаление при атопическом дерматите. Модификация клеточного иммунного ответа на фоне хронического описторхоза сопряжена с изменением количественного содержания и функциональной активности Т-регуляторных клеток. Понимание механизмов моди-фикационной роли гельминтной инвазии при аллергическом воспалении может служить основой для разработки новых профилактических методов и подходов в отношении иммунозависимых заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Reddy, A. Atopic disorders and parasitic infections /Reddy A., Fried B. //Adv Parasitol. - 2008 - V. 66. - P. 149-191.
2. Heratizadeh, A. Atopic dermatitis: The hygiene hypothesis: Prevention through helminth infections? /Heratizadeh A, Werfel T, Kapp A. //Ha-utarzt. - 2006. - V. 57, N 7. - P. 576, 578-585.
3. Hopkin, J. Immune and genetic aspects of asthma, allergy and parasitic worm infections: evolutionary links /Hopkin J. //Parasite Immunol. -
2009. - V. 31, N 5. - Р. 267-273.
4. Van Riet, E. Chronic helminth infections induce immunomodulation: consequences and mechanisms /Van Riet E., Hartgers F.C., Yazdanbakhsh M. //Immunobiol. - 2007. - V. 212, N 6. - Р. 475-490.
5. Association of atopy, asthma, allergic rhinoconjunctivitis, atopic dermatitis and intestinal helminth infections in Cuban children /W^demann M., Diaz R.J., Heredia L.M. et al. //Trop. Med. Int. Health. - 2008. - V. 13, N 2. - Р. 180-186.
6. Изучение распространенности аллергической патологии и описторхозной инвазии и их взаимосвязи у населения Томской области /Огородова Л.М., Фрейдин М.Б., Сазонов А.Э. и др. //Бюл. сибир. медицины. - 2006. - № 4. - С. 48-51.
7. Helminth-derived products inhibit the development of allergic responses in mice /Trujillo-Vargas C.M., Werner-Klein M., Wohlleben G. et al. //Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2007. - V. 175, N 4. - Р. 336-344.
8. Silva, M.T. Atopic dermatitis and ascariasis in children aged 2 to 10 years /Silva M.T., Souza V.M., Bragagnoli G. //J. Pediat. (Rio J.). - 2010. -V. 86, N 1. - Р. 53-58.
9. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis /Hartmann S., Schno-eller C., Dahten A. et al. //Clin. Exp. Allergy. - 2009. - V. 39, N 10. - Р. 1585-1596.
10. Эпидемиологические и клинические особенности атопического дерматита у детей, проживающих в регионе, эндемичном по опис-торхозу /Огородова Л.М., Камалтынова Е.М., Федорова О.С. и др. //Вопр. соврем. педиатрии. - 2010. - № 3. - С. 50-53.
11. Влияние инвазии Opisthorchis felineus на иммунный ответ при бронхиальной астме /Огородова Л.М., Фрейдин М.Б., Сазонов А.Э. и др. //Бюл. сибир. медицины. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 85-90.
12. Клеточный иммунный ответ у детей, страдающих бронхиальной астмой в сочетании с хронической описторхозной инвазией /Елисеева О.В., Кремер Е.Э., Огородова Л.М. и др. //Вопр. диагностики в педиатрии. - 2011. - Т. 3, № 2. - С. 15-19.
13. Schistosoma mansoni antigens modulate experimental allergic asthma in a murine model: a major role for CD4+CD25+ Foxp3+ T cells independent of interleukin-10 /Pa^ico L.G., Marinho F.A., Fonseca C.T. et al. //Inf. Immun. - 2009. - V. 77, N 1. - Р. 98-107.
14. Pathogen induced regulatory cell populations preventing allergy through the Th1/Th2 paradigm point of vie /Roumier T., Capron M., Dom-browicz D. et al. //Immunol. Res. - 2008. - V. 40. - Р. 117.
15. Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей /Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Литвина М.М. и др. //Мед. иммунол. - 2008. - Т. 10, № 2-3. - Р. 159-166.
16. Regulatory T cells in atopic dermatitis: epidermal dendritic cell clusters may contribute to their local expansion /Szegedi A., Ba^th S., Nagy G. et al. //Br. J. Dermatol. - 2009. - V. 160, N 5. - Р. 984-993.
17. Атопический дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение, профилактика: науч.-практ. программа /Союз педиатров России. - М., 2004. - С. 10-11.
